水稻親環(huán)素基因OsCYP2的啟動子及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種水稻親環(huán)素基因OsCYP2的啟動子及其應(yīng)用。該啟動子通過采用PCR技術(shù)從水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica C.V.Nipponbare)基因組中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。該啟動子驅(qū)動GUS基因的表達(dá)活性比pACTIN1::GUS、pUBI1::GUS和pCaMV35S::GUS高。該啟動子可應(yīng)用于作物分子改良育種領(lǐng)域以及植物基因工程研究領(lǐng)域。
【專利說明】
水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉一種水稻水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前最常見的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒啟動子CaMV35S和Actin啟動子，含 有TATA box和CAAT框，在雙子葉植物中高效表達(dá)，但在單子葉植物中表達(dá)較弱 (Schledzewski K,Mendel R R.Quantitative transient gene expression:comparison of the promoters for maize polyubiquit ini, rice actinl,maize-derivedEmu andCaMV 35S in cells of barley,maize and tobacco[J].Transgenic Research,1994, 3(4) :249-255.)11^^(^等研究了玉米泛素蛋白Ubiquitin(UBIl)啟動子，該啟動子也是 一類組成型啟動子，并且也能在植物所有組織中高效表達(dá)(Muhitch M J, Shatters R G.Regulation of the maize ubiquitin(Ubi~l)promoter in developing maize(Zea mays L.)seeds examined using transient gene expression in kernels grown in vitro[J] .Plant cell reports, 1998,17(6-7):476-481)。此外，Ubiquitin啟動子在禾本 科中能高效表達(dá)，也通常被用于禾本科植物的基因工程研究中。該啟動子在植物組織都能 表達(dá)，但是在成熟組織中的表達(dá)水平則成顯著下降趨勢（Cornejo M J，Luth D, Blankenship K M,et al.Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice[J].Plant molecular biology ,1993,23(3): 567-581)。魏晶等通過分離水稻基因 L0C-0s07g34589,構(gòu)建了一個組成型啟動子，命名為PSUI1，并與Ubiquitin啟動子作對比，研 究表明前者在水稻成熟組織中也具有很高表達(dá)水平，但較后者表達(dá)水平較低，為后者的1/ 3-1/2,但穩(wěn)定性更高(魏晶，毛偉華等.1個新水稻組成型啟動子的克隆與功能鑒定[J].華 中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012,31(2):139-146)素蛋白Ubiquitin啟動子比采用35S啟動子效率高 出 了十倍（Sohal A K,Pallas J A, Jenkins G I.The promoter of a Brassica napus lipid transfer protein gene is active in a range of tissues and stimulated by light and viral infection in transgenic Arabidopsis[J]. Plant molecular biology ,1999,41(1) :75-87 )。而從水稻中分離的rubi 3啟動子，比玉米中Ubiqui tin啟動子 活性更高，是一類在單子葉植物中極具應(yīng)用價值的強效組成型啟動子(Lu J，Sivamani E, Li X,et al.Activity of the 5/regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes[J].Plant cell reports,2008,27(10):1587-1600)〇
[0003] 盧碧霞等對轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S定量分析發(fā)現(xiàn)，rbcS啟動子表達(dá)水平較CaMV35S啟動 子高，而rbcS啟動子同時具有組織特異性和光誘導(dǎo)性，在水稻上應(yīng)用廣泛(盧碧霞，張改生， 夏勉，等.水稻rbcS啟動子的克隆及其在轉(zhuǎn)基因水稻中的特異性表達(dá)[J].西北農(nóng)林科技大 學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007,1:020)。用rbcS啟動子驅(qū)動CyCIC*基因在一個粳稻品種中超量 表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在抗蟲方面成績顯著，且Bt蛋白僅在綠色組織中高效表達(dá)(Ye R， Huang H,Yang Z,et al.Development of insect-resistant transgenic rice with CrylC*-free endosperm[J].Pest management science,2009,65(9):1015_1020)。利用玉 米泛素 Ubiquntin啟動子感病水稻中過量表達(dá)抗病基因0sWRY13,其轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯病 的抗性顯著增強（Qiu D,Xiao J,Ding X，et al.0sWRKY13mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate- dependent signaling[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2007,20(5):492-499)。將抗蟲基因 SNAC1基因超量表達(dá)，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻在大田重度干旱脅迫后的 抗旱能力（Hu H，Dai M，Yao j.et al.Ocerexpression a NAM，ATAF，and CUC(NAC) transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci 1^厶，2006，103:12987-12992)。超量表達(dá)水稻抗旱基因 OsSKIPa，提高了轉(zhuǎn)基因水稻對氧自由基的清除能力，而通過干旱脅迫處理后，該轉(zhuǎn)基因植 株中其它抗旱相關(guān)基因的表達(dá)水平在相同條件下顯著高于野生型對照(Hou X，xie k，yao j.et al.Homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance .Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:6410-6415)。利用組成型啟動子ACT INI將已知的抗旱基因 CBF3、S0S2、NCED2、NPK1、L0S5、ZAT10和 NHX1驅(qū)動表達(dá)，通過抗性檢測后，發(fā)現(xiàn)對比野生型水稻，轉(zhuǎn)基因水稻相對產(chǎn)量提高，相對結(jié) 實率提高，而且在不同基因之間表達(dá)水平及抗性比較后，發(fā)現(xiàn)L0S5和ZAT10這兩個基因抗性 最為突出，對于培育有使用價值的轉(zhuǎn)基因抗旱水稻具有較大的參考價值(Xiao B Z，Chen X,Xiang C B,et al.Evaluation of seven function-known candidate genes for their effects on improving drought resistance of transgenic rice under field conditions[J].Molecular Plant,2009,2(1):73-83)〇
[0004] 綜上，高活性表達(dá)的啟動子的研發(fā)，在水稻品質(zhì)改良，特別是抗病性、耐鹽和耐旱 方面從基因工程改造角度考慮是一個不錯的選擇，在今后的育種研究中有重要指導(dǎo)意義， 根據(jù)水稻雌性不育突變體基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)結(jié)果，在水稻野生型(FST)與突變體(fst)植株 不同發(fā)育時期，很多參與物質(zhì)運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及植物激素合成相關(guān)基因的表達(dá)都出現(xiàn)很 大程度的下調(diào)或上調(diào)情況，且表達(dá)水平大不相同（Lee DS，Chen LJ，Li CY，et al· The Bsister MADS gene FST determines ovule patterning and development of the zygotic embryo and endosperm[J].PloS one，2013,8(3):e58748)。而水稻肌動蛋白基因 OsRAcl(ACTl)、泛素基因1^191^^111(1^11)、真核翻譯起始因子基因6032、細(xì)胞色素 (Cytochtome C)基因 CYC和親環(huán)素基因 Cyclophilin 2(CYP2)表達(dá)一直保持一個相對較高 的水平，即任何發(fā)育時期都表現(xiàn)出高表達(dá)水平，說明這類基因在水稻發(fā)育過程中起著極為 重要的作用。單從芯片數(shù)據(jù)上顯示，CYP2基因表達(dá)水平比ACTIN1、CYC、UBI1等在各主要發(fā)育 時期都要高。那么克隆這幾個基因的啟動子，它們的啟動子是否也會出現(xiàn)其基因之間的那 種表達(dá)水平差異呢？
[0005] 基于這種情況，本研究旨在采用PCR和生物信息學(xué)等技術(shù)，對水稻0SCYP2基因啟動 子進(jìn)行克隆，構(gòu)建PCYP2: : GUS雙元表達(dá)載體，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷組織，獲 得轉(zhuǎn)基因陽性水稻植株；以pACTINl: :GUS、pUBIl::⑶S和pCaMV35S: :GUS等陽性轉(zhuǎn)基因植株 為對照，通過GUS組織化學(xué)染色及吸光度測定分析，以評估pCYP2在水稻轉(zhuǎn)基因中的啟動效 率。研究結(jié)果將為類似啟動子的開發(fā)與篩選提供一種可行的方法和新視野，望對水稻基因 工程研究，特別是基因的功能驗證方面提供助力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 1. 一種水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所 不。
[0009] 2. -種水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2，其特征在于，所述水稻親環(huán)素基因 0sCYP2的啟動子pCYP2為：
[0010] (a)技術(shù)方案1所述的水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列中 取代一個或一個以上后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；
[0011] 或者(b)技術(shù)方案1所述的水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2所示的核苷酸序 列中添加一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；
[0012] 或者(C)技術(shù)方案1所述的水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2所示的核苷酸序 列缺失一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；
[0013] 或者(d)技術(shù)方案1所述的水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2所示的核苷酸序 列具有至少90%同源性，且具有啟動子功能的核苷酸序列；
[0014] 或者(e)技術(shù)方案1所述的水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子PCYP2所示的核苷酸序 列雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列。
[0015] 3.技術(shù)方案1或2所述水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2在改良植物生長特性 的應(yīng)用。
[0016] 4.技術(shù)方案1或2所述水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2在植物基因工程中的 應(yīng)用。
[0017] 5.技術(shù)方案1或2所述水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2在作物分子改良育種 中的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0019] 經(jīng)⑶S報告基因表達(dá)分析實驗證明：本發(fā)明水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2 在根、葉、花、種子等組織器官中能驅(qū)動GUS報告基因高效表達(dá)，而且表達(dá)效率高于pCYC:: GUS、pACTINl::⑶S、pG0S2: :GUS、pUBIl::⑶S，pCaMV35S:⑶S。因此，本發(fā)明水稻親環(huán)素基因 0sCYP2的啟動子pCYP2的驗證，在理論上將為研究水稻0sCYP2基因的表達(dá)調(diào)控機理提供更 為良好的實驗基礎(chǔ);在應(yīng)用方面為利用本發(fā)明水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2構(gòu)建 表達(dá)載體高效表達(dá)外源基因創(chuàng)造了條件；在水稻基因功能驗證方面除了使用CaMV35S、 Ubiquitin等啟動子外，可以選擇來自水稻自身的本發(fā)明水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子 PCYP2,同時在整個植物基因工程研究方面具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。
[0020] 序列表中SEQ ID N0:1所示的是本發(fā)明水稻親環(huán)素基因0SCYP2的啟動子PCYP2的 核苷酸序列。
[0021] SEQ ID從):2所示的是引物0￥?2?+的堿基序列。
[0022] SEQ ID從):3所示的是引物0￥?2?-郎勺堿基序列。
[0023] SEQ ID從):4所示的是引物113+的堿基序列。
[0024] SEQ ID從):5所示的是引物113-郎勺堿基序列。
[0025] SEQ ID從):6所示的是(；1^表達(dá)載體特異性引物即61]869-31?的堿基序列。
[0026] SEQ ID從):7所示的是引物》^3+的堿基序列。
[0027] SEQ ID從):8所示的是引物》^3-1?的堿基序列。
[0028] SEQ ID從):9所示的是引物(；1]5]\^3+的堿基序列。
[0029] SEQ ID從)：10所示的是引物(；1]5]\^3-郎勺堿基序列。
【附圖說明】
[0030] 圖1是水稻不同發(fā)育時期基因 CYP2與六(^1、1^11、0￥(：和6032基因表達(dá)水平分析結(jié) 果圖。圖1中橫坐標(biāo)是水稻花器官不同發(fā)育時期，橫坐標(biāo)上:ME1表示減數(shù)分裂期，JBF為開花 前期，5DAP為開花后五天?？v坐標(biāo)是基因的表達(dá)量，圖1中，+表示UBI1，-?-表示CYC，-《-表示 ACT1，表示 G0S2，一·一表示 CYP2。
[0031] 圖2是水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2的PCR擴增圖譜。圖2中Μ表示Marker; 泳道1表示啟動子擴增條帶。
[0032]圖3是水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2片段鏈接y&TA載體后獲得陽性克隆 提取質(zhì)粒之后酶切結(jié)果圖。圖3中Μ表示Marker;泳道1表示啟動子片段陽性克隆-1;泳道2表 示啟動子片段陽性克隆-2。
[0033]圖4是水稻親環(huán)素基因0sCYP2基因及其啟動子pCYP2的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖5是水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2片段與⑶S報告基因組成的雙元表達(dá) 載體的質(zhì)粒酶切圖。圖5中Μ為分子標(biāo)尺;泳道1~3是陽性單克隆質(zhì)粒。
[0035] 圖6是含目的基因 pCYP2啟動子片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后的陽性克隆篩選結(jié) 果圖。圖6中Μ為分子標(biāo)尺;泳道1是陽性對照pCaMV35S: :GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，泳 道2至8為pCYP2: :GUS載體轉(zhuǎn)入菌后產(chǎn)生的單克隆。
[0036] 圖 7 是PCR 檢測是否含有目的基因（pCYP2、pUNIl、pCYC: :GUS、pG0S2 和pACTINl)的 轉(zhuǎn)基因植株結(jié)果圖。圖7中Μ為分子標(biāo)尺；泳道1是野生型陰性對照植株黎榆B;泳道2是 pCaMV35S: :GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065;泳道3至4是pUNI 1::⑶S轉(zhuǎn)基植株編號為ΑΤ44; 泳道5至6是pCYC::⑶S轉(zhuǎn)基因植株編號為AT45;泳道7至8是pG0S2: :GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為 AT47;泳道9至10是pCYP2: : GUS轉(zhuǎn)基因植株編號AT48;泳道11至12是pACTIN1: : GUS轉(zhuǎn)基因植 株編號為AT49。
[0037] 圖8是pCaMV35S: :GUS、pG0S2: :GUS和pCYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因水稻葉片的GUS染色結(jié) 果圖。圖8中A是陰性對照LiyuB，B是pCaMV35S::⑶S轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，C是pG0S2:: GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為AT47，D是pCYP2: : GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為AT48。
[0038] 圖9是pCaMV35S: :GUS、pG0S2: :GUS和pCYP2: :GUS的Το代轉(zhuǎn)基因植株穎花⑶S染色 結(jié)果圖。其中:Α是pCaMV35S::⑶S的轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，B是pG0S2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植 株編號為AT47，C是pCYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株編號為AT48。
[0039]圖10是pCYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株AT48的To代開花10天后的種子GUS染色結(jié)果圖。 圖10中兩幅圖均為AT48,為不同的兩顆種子染色而成。
[0040]圖 11 是pCaMV35S: :GUS、pG0S2: :GUS和pCYP2: :GUS的Το代穗子⑶S染色圖。其中：A 是pCaMV35S: :GUS轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，B是pG0S2: :GUS編號為AT47，C是pCYP2: :GUS 編號為AT48。
[0041 ]圖12是pCYP2::⑶S、pUNIl::GUS、pCYC::GUS、pG0S2::⑶S和pACTINl::GUS的Τι 代 轉(zhuǎn)基因植株種子發(fā)芽一周后GUS染色結(jié)果圖。圖12中六、0、6、1、1、？表示根尖和芽尖染色情 況;B、E、H、K、N、Q主要展示胚芽和胚芽鞘染色情況;C、F、I、L、0、R展示胚乳和胚芽基部表達(dá) 情況;其中:A，B，C為陰性對照常規(guī)水稻品種黎榆B(LiyuB); D、E、F是pUNI 1::⑶S的轉(zhuǎn)基因植 株編號為六了44;6、!1、1是?0￥(：::61^的轉(zhuǎn)基因植株編號為4了45 ;1、1(、1^是?6032::61^的轉(zhuǎn)基因 植株編號為AT47;M、N、0是pCYP2::⑶S的轉(zhuǎn)基因植株編號為AT48;P、Q、R是pACTINl: :GUS的 轉(zhuǎn)基因植株編號為AT49。
[0042] 圖 13是pCYP2: :GUS、pUNIl: :GUS、pCYC: :GUS、pG0S2::⑶S和pACTINl: :GUS的轉(zhuǎn)基 因植株葉片GUS吸光度測定結(jié)果圖。圖13中橫坐標(biāo)表示測試的樣品，其中：常規(guī)水稻品種黎 榆B(LiyuB)為陰性對照;DTG4065是CaMV35S:⑶S的轉(zhuǎn)基因植株，AT44為pUBIl: :GUS的轉(zhuǎn)基 因植株，AT45為pCYC: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株、AT49為pACTINl: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株，AT47為 pG0S2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株，AT48為pCYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株?？v坐標(biāo)是⑶S基因表達(dá)量。
【具體實施方式】
[0043] 以下結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下各實施例所用的載體、 引物、試劑、水稻等材料均為市售，各實施例無特殊說明為常規(guī)方法。
[0044] 實施例1水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2的克隆及序列分析
[0045] 1、基于基因芯片分析結(jié)果（圖1):在水稻不同發(fā)育時期(ME1減數(shù)分裂期，JBF為開 花前期，所述開花前期是指穎花即將開放的時期，5DAP為開花后五天），水稻親環(huán)素基因 CYP2與ACT1、UBI 1、CYC和G0S2的表達(dá)水平都表現(xiàn)出組成型表達(dá)的特點，對水稻0sCYP2基因 啟動子pCYP2進(jìn)行克隆，以水稻水稻日本晴（Oryza sativa L.ssp.japonica C.V.Nipponbare)為供試材料，使用CTAB法(Murray et al. ,1980)提取水稻基因組DNA，并 將獲得的DNA作為0sCYP2基因啟動子pCYP2克隆的模板。在NCBI網(wǎng)站（http:// www · ncbi · nlm. nih · gov/genbank/)上，查詢基因0sCYP2全長序列（ID: UniGene 374170-Os. 22750)，根據(jù)0sCYP2基因的已知序列設(shè)計引物CYP2P-F/R擴增水稻親環(huán)素基因0sCYP2的 啟動子PCYP2序列，擴增完成后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，并將片段鏈接到y(tǒng)&TA克 隆載體，篩選正向插入片段陽性克隆。然后提取質(zhì)粒、酶切送測序，結(jié)果如圖2和圖3,圖2是 水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2PCR擴增圖譜，圖3是啟動子pCYP2片段鏈接y&TA載體 后質(zhì)粒酶切結(jié)果圖。所述引物CYP2P-F/R由引物CYP2P-F和引物CYP2P-R組成，所述引物 CYP2P-F的堿基序列如SEQ ID N0:2所示，所述引物CYP2P-R的堿基序列如SEQ ID N0:3所 不。
[0046] 以水稻日本晴(Oryza sativa L.ssp.japonica C.V.Nipponbare)材料所獲得的 DNA作為0sCYP2基因啟動子pCYP2克隆的模板，用引物CYP2P-F/R擴增，反應(yīng)體系如表1所示， PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性5min，從94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸3min運行35 個循環(huán)，72°C延伸15min。
[0047] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0050] 2、使用通用引物M13-F/R插入目的片段PCYP2的y&TA載體進(jìn)行雙向測序，在Blast (http: //blast · ncbi · nlm · nih · gov/Blast · cgi)中進(jìn)行序列比對，在PLACE和PlantCARE數(shù) 據(jù)庫對水稻親環(huán)素基因〇sCYP2的啟動子pCYP2區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測，水稻親 環(huán)素基因0sCYP2和其啟動子pCYP2結(jié)構(gòu)如圖4所示。引物M13-F/R由引物M13-F和引物M13-R 組成，所述引物M13-F的堿基序列如SEQ ID N0:4所示。所述引物M13-R的堿基序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0051 ] 實施例2構(gòu)建水稻親環(huán)素基因0sCYP2啟動子pCYP2的GUS融合表達(dá)載體
[0052]使用限制性內(nèi)切酶Hindlll和Spel分別對目標(biāo)片段和yT&A連接的質(zhì)粒及載有雙元 表達(dá)載體(攜帶目的基因+GUS基因）同時進(jìn)行酶切消化，前者在37°C條件下酶切反應(yīng)3hr，然 后65°C20min終止酶切反應(yīng)，后者(載體)37°C條件下酶切反應(yīng)lhr，然后65°C20min終止反 應(yīng)，接著加 lyL CIAP 37°C條件下lhr，最后65°C20min終止反應(yīng)，制作1 %瓊脂糖凝膠檢測酶 切產(chǎn)物，切取目的片段及載體片段，然后經(jīng)鏈接轉(zhuǎn)化、提質(zhì)粒、酶切檢測等過程，獲得帶有目 的基因的表達(dá)載體，以GUS表達(dá)載體特異性引物HPGUseq-3R對攜帶目的基因的表達(dá)載體進(jìn) 行測序，該表達(dá)載體酶切結(jié)果如圖5所示。GUS表達(dá)載體特異性引物HPGUseq-3R的堿基序列 如SEQ ID N0:6所示。
[0053]實施例3水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得
[0054]將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，具體操作如下：將農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì) 胞從-80°C冰箱中取出，冰上放置lOmin，吸取2yL質(zhì)粒加入100yL農(nóng)桿菌桿菌感受態(tài)細(xì)胞中， 用手指輕輕彈幾下離心管管底，將離心管放入液氮中速凍2min，移除放入37°C恒溫水浴鍋 5min，此過程可以輕彈管底，在放入液氮速凍2min，再放入37°C恒溫水浴鍋5min即可取出， 加入YEP液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)lhr，涂板，之后避光28°C恒溫靜置培養(yǎng)2天-3天(24hr-36hr)， 待單克隆長出后，用特異引物HmMAS-F/R，進(jìn)行陽性克隆篩選檢測，反應(yīng)體系及程序為：10X Buffer((NH4)2S〇4)1.50yL，2.5mmol/L d NTP mixture 1.20yL，25mM MgCl2〇.90yL，HmMAS-F 0 · 12yL，HmMAS-R 0 · 12ul，Taq(5U/u 1)0 · 20yL，DNA模板（單克隆菌落）0 · lyL，ddH20補充到 15·00μΙ^94°(：預(yù)變性 4min，從 94°C 變性 10sec，60°C 退火 10sec，72°C 延伸 30sec 運行 35 個循 環(huán)，72 °C延伸15min。結(jié)果如圖6所示。HmMAS-F/R由引物HmMAS-F和引物HmMAS-R組成，引物 HmMAS-F的堿基序列如SEQIDN0:7所示，引物HmMAS-R的堿基序列如SEQIDN0:8所示。
[0055] 經(jīng)過菌落PCR檢測后的根癌農(nóng)桿菌恒溫震蕩培養(yǎng)(28°C，150r/min)2d后，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 水稻黎榆B(0ryza sativa L.ssp.japonica C.V.LiyuB)胚性愈傷組織，具體方法參照張利 東等(張利東，朱騫，等.水稻G0S2基因高活性啟動子的分離及其在葉片中的特性鑒定[J]. 分子植物育種印刷版，2014,13(1):32-38)。取成熟的黎榆B(LiyuB)種子待去殼后，使用 70%乙醇消毒3min，50%次氯酸鈉消毒lOmin后，再用50%次氯酸鈉消毒30min;然后用滅菌 的ddH 20漂洗數(shù)次，直至次氯酸鈉溶液的味道消失，充分晾干種子后接種到N6D愈傷誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30天，挑取色澤鮮亮、呈圓形或橢圓形顆粒狀的胚性愈傷組 織接種于新的N6D愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)2~3天后，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。N6D愈 傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方參見黃賽麟等的配制方法(黃賽麟，李東宣，甘樹仙，朱建榮，李娟，梁 晶，陳麗娟.水稻成熟胚培養(yǎng)高效再生系統(tǒng)的創(chuàng)新[J].分子植物育種，2008,6(4) :801-806) 〇
[0056] 獲得轉(zhuǎn)基因植株后，利用融合表達(dá)載體上報告基因 GUS的特異性引物GUSMAS-F/R 對PCYP2的轉(zhuǎn)基因再生株系進(jìn)行葉片PCR鑒定：10 X Buffer( (NH4)2S〇4) 1.50yL，2.5mmol/L dNTP mixture 1.20yL，25mM MgCl20.90yL，GUSMAS-F 0.12yL，GUSMAS-R 0.12yL，Taq(5U/ ul)0.20yL，DNA模板(轉(zhuǎn)基因植株葉片)0.1yL，ddH20補充到15.00μΙ^94Γ預(yù)變性4min，從94 °C變性10sec，60°C退火10sec，72°C延伸30sec運行35個循環(huán)，72°C延伸15min，結(jié)果如圖7所 示。所述特異性引物⑶SMAS-F/R由引物⑶SMAS-F和引物⑶SMAS-R組成，引物GUSMAS-F的堿 基序列如SEQIDN0 :9所示，引物GUSMAS-R的堿基序列如SEQIDN0:10所示。
[0057] 實施例4本發(fā)明水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2GUS表達(dá)活性的檢測
[0058] 1.轉(zhuǎn)基因水稻植株的GUS組織化學(xué)染色
[0059] 由實施例3獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過GUS染色技術(shù)，分析融合蛋白的組織表達(dá)特性。 對野生型（LiyuB)以及轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行GUS染色，GUS染色方法參照J(rèn)efferson方法 (Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions : beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[J]. The ΕΜΒ0 journal，1987,6(13): 3901 ·)，具體操作步驟如下：
[0060] ①取材:選取轉(zhuǎn)基因植株To代的葉片lcm左右及部分穗子，將其置于2. OmL離心管 中，并加一滴滅菌水，以保持其新鮮;將To代種子(1^代)進(jìn)行生根發(fā)芽，一周后取出進(jìn)行染 色。
[0061 ] ②固定:加入現(xiàn)配經(jīng)預(yù)冷處理30min的90 %丙酮，確保樣品完全浸入液體中，-20 °C 放置15~20min。
[0062] ③漂洗:移去丙酮，使用Rinse漂洗液(0.5M NaP〇4緩沖液(PH7.2) 10.00mL、0.1M K3Fe(CN)60.50mL、0.1M K4Fe(CN)6.3H20 0.50mL、ddH20 89.00mL)，漂洗葉片組織2~3次； 移去漂洗液，繼而加入X-GluC染色液于試管中，保證樣品被液體完全浸沒;常溫抽真空處理 10min或更長時間直至不再有氣泡產(chǎn)生，緩慢釋放放氣閥;若樣品未沉入液面以下或染色沒 有改變，則可以重復(fù)操作。
[0063] ④顯色:37 °C過夜處理，觀察染色變化情況；
[0064]⑤清洗:首先用ddH20清洗樣品；繼而改用70%乙醇漂洗樣品，重復(fù)數(shù)次，以除去葉 片中的葉綠素，直到葉片不顯綠色(漂洗液透明）為止；
[0065]⑥拍照：將染色樣品移到新的2.OmL離心管中，加入沒過樣品的乙醇：甘油（1:1)， 靜置數(shù)分鐘;在干凈的載玻片上滴加適量的乙醇:甘油(體積比為1:4)混合物，均勻涂開，將 樣品鋪平置于玻片中央，在其周圍滴加乙醇:甘油(體積比為1:4)混合物后，蓋上蓋玻片，調(diào) 整樣品方向及角度，使其處于正中央;選擇最佳視野，本研究拍照使用體視顯微鏡。
[0066] 其中：①葉片GUS染色結(jié)果如圖8所示，供試材料除野生型黎榆B(LiyuB)對照無染 色效果與預(yù)期吻合，其他To轉(zhuǎn)基因植株葉片組織均有不同程度的GUS著色現(xiàn)象，特別是在葉 片橫向切口處⑶S染色效果明顯，這說明染色部位表達(dá)活性高(還有可能是未染色部分是由 染色技術(shù)造成的）；再看供試材料之間，GUS表達(dá)活性差異明顯，從邊沿部位相比而言 DTG4065(pCaMV35S: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株）、AT47(pG0S2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株），和AT48 (PACYP2::⑶S的轉(zhuǎn)基因植株)依次增強。初步可以了解到AT48(pACYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株） 在這幾個陽性對照中⑶S活性最高。②圖9是pCaMV35S::⑶S、pG0S2: :GUS和pCYP2: :GUS的To 代轉(zhuǎn)基因植株穎花⑶S染色結(jié)果。其中：A是pCaMV35S: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，B 是pG0S2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株編號為AT47，C是pCYP2::⑶S的轉(zhuǎn)基因植株編號為AT48AT48染 色最為明顯，穎殼、花藥和子房都被染色，就連穎殼基部也明顯被染色，其GUS表到活性在這 個階段明顯高于DTG4065(pCaMV35S: :GUS)啟動子和AT47(pG0S2p: :GUS)啟動子。③圖10是 pCYP2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株AT48的To代開花10天后的種子⑶S染色結(jié)果圖。圖10中兩幅圖均 為AT48,為不同的兩顆種子染色而成。說明這個時期的GUS表達(dá)活性很強。④圖11是 pCaMV35S::⑶S、pG0S2: :GUS和pCYP2::⑶S的Το代穗子⑶S染色圖。其中：A是pCaMV35S: :GUS 轉(zhuǎn)基因植株編號為DTG4065，B是pG0S2: :GUS編號為AT47，C是pCYP2: :GUS編號為AT48。三者 無論麩毛還是芒都被不同程度地著色，其中AT48最為顯眼。⑤圖12是pCYP2: :GUS、pUNIl:: GUS、pCYC: :GUS、pG0S2::⑶S和pACTINl: :GUS的Τι代轉(zhuǎn)基因植株種子發(fā)芽一周后⑶S染色結(jié) 果圖。根尖和芽尖上啟動子口〇&1^353、？1^11、？0￥(：和?4(：1'預(yù)1沒有表達(dá)，而?6032和?0￥?2在 芽尖和根尖均有表達(dá)，再有pUBI 1、pG0S2和pCYP2在根部及胚芽鞘處GUS表達(dá)水平較高。
[0067] 2XUS定量分析
[0068] 米用Martin和Gallagher的方法（Martin T, WdhnerR V，Hummel S，et al .The GUS reporter system as a tool to study plant gene express ion[J]·GUS protocols : using the GUS gene as a reporter of gene expression·，1992:23-43、 Gallagher,Sean R.,ed.GUS protocols:using the GUS gene as a reporter of gene expression .Academic Press, 2012 ·):①首先取幼嫩葉片（Ti代），稱取50g放入1 · 5ml離心 管中，加入250ml提前預(yù)冷的提取液(Ectraction buffer)，在離心管底部快速研磨。②4°C 1200rpm/min離心10min。③吸取150yL上清液移至新的1.5ml離心管中，4°C 1200rpm/min離 心1 Omin。取100yL上清液移至新的1.5ml離心管中。4°C保存。④向管中加入500yL緩沖液 Assay buffer，分出50yL液體加入500yLAssay buffer，37°C恒溫水浴30min。⑤取出離心 管，加900yL 0.2M Na2C03終止反應(yīng)。使用分光光度計0D455nm測定并記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖13 所示，圖中橫坐標(biāo)表示測試的樣品，其中：常規(guī)水稻品種黎榆B(LiyuB)為陰性對照； DTG4065p是CaMV35S:GUS的轉(zhuǎn)基因植株，AT44為pUBIl: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株，AT45為pCYC:: GUS的轉(zhuǎn)基因植株、AT49為pACTINl: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株，AT47為pG0S2: :GUS的轉(zhuǎn)基因植株， AT48為pCYP2::⑶S的轉(zhuǎn)基因植株?？v坐標(biāo)表示⑶S基因表達(dá)量?？梢钥吹紸T48 (pCYP2::⑶S) 數(shù)值最高，是AT45 (pCYC::⑶S)、AT49 (pACTIN1: : GUS)和AT47 (pG0S2::⑶S)的 1-2倍，其次是 AT44(pUBI 1::⑶S)，DTG4065是（pCaMV35S:⑶S)，其數(shù)值最低，只有AT48(pCYP2: :GUS)的 1/7 左右。從本實驗來看，通過幾個啟動子的GUS吸光度測定，AT48(pCYP2: :GUS)的轉(zhuǎn)基因植株 AT48與在列(在列指AT44，AT45，AT47，AT49轉(zhuǎn)基因植株)的啟動子相比，具有最高表達(dá)水平。
【主權(quán)項】
1. 一種水稻親環(huán)素基因0sCYP2的啟動子pCYP2，其核苷酸序列如SEQIDN0:l所示。2. -種水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2,其特征在于，所述水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2包含： (a)權(quán)利要求1所述的水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列中取代 一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列； 或者(b)權(quán)利要求1所述的水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列中 添加一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列； 或者(c)權(quán)利要求1所述的水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列缺 失一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列； 或者(d)權(quán)利要求1所述的水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列具 有至少90%同源性，且具有啟動子功能的核苷酸序列； 或者(e)權(quán)利要求1所述的水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2所示的核苷酸序列雜 交且具有啟動子功能的核苷酸序列。3. 權(quán)利要求1或2所述水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2在改良植物生長特性的應(yīng) 用。4. 權(quán)利要求1或2所述水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2在植物基因工程中的應(yīng) 用。5. 權(quán)利要求1或2所述水稻親環(huán)素基因 OsCYP2的啟動子pCYP2在作物分子改良育種中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK105907762SQ201610547147
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】李東宣, 陳麗娟, 吳超, 李偉, 張小玲, 朱騫, 郭效瓊, 董陳文華, 李成云
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)