缺刻緣綠藻δ6 fad基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及一種缺刻緣綠藻A6FAD基因啟動(dòng)子及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生四締酸（arachidonicacid，ArA，20:4?6)是人類營養(yǎng)的一種必需脂肪酸。不 僅具有許多生理學(xué)及藥理學(xué)活性，而且是人腦膜憐脂的主要成分。它在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮第二信 使作用，參與造血免疫調(diào)節(jié)，引起血管舒張，參與肝、膽等器官多種功能的調(diào)節(jié)，是內(nèi)循環(huán)系 統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用的前列腺素和白介=締的前體。ArA還是成熟母乳的一種 重要成分，對(duì)產(chǎn)后嬰兒的視力和智力發(fā)育都是必需的。因此，F(xiàn)A0/WK)推薦在嬰兒奶粉中添 加ArA。缺刻緣綠藻（Myrmeciaincisa)富含大量的ArA，尤其是在脅迫環(huán)境（如憐饑餓、 氮饑餓）下，ArA最高含量可達(dá)到藻體干重的7%，是目前ArA含量較高的藻種，具有潛在的 開發(fā)利用價(jià)值。
[0003] ArA是一種多不飽和脂肪酸（PUFA)。生物體中的PUFA合成主要有兩種途徑，即 ?-6途徑和0-3途徑。ArA是沿著0-6途徑合成的：即亞油酸首先在A6脂肪酸去飽 和酶（FAD)的去飽和作用下生成丫-亞麻酸，之后由A6脂肪酸延長(zhǎng)酶（FAE)延長(zhǎng)生成雙 高-丫 -亞麻酸（dihomo-丫-linolenicacid，20:3&s'ii'i4,DGLA)，再由A5FAD的去飽和作 用生成ArA。研究還發(fā)現(xiàn)，亞油酸在A15FAD的作用下可生成a-亞麻酸（ALA)進(jìn)入0-3 途徑，然后，ALA可在A6FAD作用下去飽和為十八碳四締酸（stearidonicacid，SDA， 18:4&6'9'12'1 5)，并通過脂肪酸去飽和與延長(zhǎng)作用，進(jìn)一步產(chǎn)生二十碳五締酸巧PA)和二十二 碳六締酸值HA)。Tocher和Harvie的研究指明，0-6和0-3合成途徑的第一步催化脫氨 反應(yīng)是限速步驟，在《-6途徑中，運(yùn)一步驟是由A6FAD起催化作用的。通過對(duì)缺刻緣綠 藻A6FAD作底物偏好性分析，發(fā)現(xiàn)A6FAD不僅可W使LA變成GLA，也可W將ALA催化成 SDA，但產(chǎn)物的效率都不高，從而也說明了A6FAD的限速作用。顯然，A6FAD基因的轉(zhuǎn)錄 量越大就越有利于ArA的產(chǎn)生。
[0004] 眾所周知，基因的轉(zhuǎn)錄一般受控于該基因上游5' -側(cè)翼序列的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子序 列常常含有調(diào)控元件，使該基因的轉(zhuǎn)錄對(duì)變化的環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答，從而表現(xiàn)出差異性表達(dá)。因 此，為了深入探討缺刻緣綠藻在氮等逆境條件下累積ArA的機(jī)理，有必要了解該藻A6FAD 基因的啟動(dòng)子及其功能。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分離的多核巧酸。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的多核巧酸的用途。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組載體。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] 一種分離的多核巧酸，所述的多核巧酸選自下列中的一種：
[0011] a)沈QIDNO. 4的第383bp至第2347bp處所示的核巧酸序列；或
[0012] b)與a)中所限定的核巧酸序列互補(bǔ)的核巧酸序列。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] 如上所述的多核巧酸用于作為啟動(dòng)子元件的用途。
[0015] 所述的啟動(dòng)子元件用于指導(dǎo)目的基因表達(dá)。
[0016] 所述的目的基因來自于藻類。
[0017] 為實(shí)現(xiàn)上述第=個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0018] 一種重組載體，所述的重組載體含有如上所述的多核巧酸，作為啟動(dòng)子元件。
[0019] 所述的重組載體還含有與所述多核巧酸可操作地連接的目的基因。
[0020] 所述的目的基因位于所述多核巧酸的下游。
[0021] 所述的重組載體是真核表達(dá)載體。
[0022] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0023] 一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞：
[0024]a)含有如上任一所述的重組載體；或
[00巧]b)其基因組中整合有外源的如上所述的多核巧酸。 陽0%] 所述的宿主細(xì)胞是真菌。
[0027] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0028] 本發(fā)明基于發(fā)明人的長(zhǎng)期研究經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)已克隆到的缺刻緣綠藻A6FAD基因 cDNA全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)為JN205755)設(shè)計(jì)引物，利用基因組步移（genomewa化ing)試劑 盒自缺刻緣綠藻的基因組DM中擴(kuò)增到A6FAD基因上游長(zhǎng)為2347bp的5'-側(cè)翼序列。 在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合發(fā)明人豐富的啟動(dòng)子分析和預(yù)測(cè)經(jīng)驗(yàn)，將其中長(zhǎng)1965bp 的片段連入切除T7啟動(dòng)子且插入綠色巧光蛋白（GF巧基因的PYES2載體中，然后轉(zhuǎn)入尿喀 晚合成缺陷型的釀酒酵母BY4741中。誘導(dǎo)表達(dá)后，利用激光共聚焦顯微鏡（Con化cal)觀 察轉(zhuǎn)基因酵母的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的長(zhǎng)1965bp序列可W啟動(dòng)位于其下游的GFP基因表達(dá)。巧 光強(qiáng)度分析的結(jié)果顯示，它與T7啟動(dòng)子具有相似的啟動(dòng)效率。本研究結(jié)果表明所轉(zhuǎn)入的長(zhǎng) 1965bp序列為缺刻緣綠藻A6FAD基因的啟動(dòng)子，且可W高強(qiáng)度地啟動(dòng)目的基因的大量表 達(dá)，為人為調(diào)控藻類去飽和酶等基因的表達(dá)創(chuàng)造了條件。
【附圖說明】
[0029] 附圖1是基因步移S輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。泳道Ml和M2:分別為D2000和Maker IV分子量標(biāo)準(zhǔn)；第1、2、3泳道分別對(duì)應(yīng)于A6FAD基因上游5'-側(cè)翼序列片段的第1、2、3 輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0030] 附圖2是PMD19-T載體圖譜。
[0031] 附圖3是A6FAD基因上游長(zhǎng)1965bp的5' -側(cè)翼序列W及所預(yù)測(cè)的調(diào)控元件。
[0032] 附圖4是PCAMBIA1304雙元表達(dá)載體圖譜。
[0033] 附圖5是PYES2載體圖譜。
[0034] 附圖6是轉(zhuǎn)化了pY-DT7-1965-GFP、pY-DT7-GFP和pY-GFP釀酒酵母細(xì)胞的激光共 聚焦顯微鏡圖譜。其中，Y-DT7-GFP轉(zhuǎn)基因酵母為陰性對(duì)照組，Y-GFP轉(zhuǎn)基因酵母為陽性對(duì) 照組；GFP為485nm激發(fā)光下攝取的綠色巧光蛋白信號(hào)圖。圖中的標(biāo)尺為5ym大小。
[0035] 附圖7是轉(zhuǎn)基因酵母巧光強(qiáng)度的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。 陽〇37] 實(shí)施例1
[0038] 本發(fā)明所采用的主要操作包括：
[0039] (1)將缺刻緣綠藻接種于BG-11培養(yǎng)基的S角錐形瓶中，置于溫度為25°C、光照強(qiáng) 度為115ymolphotonsm2s\光照周期為光照：黑暗/I化：1化的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定 期搖晃數(shù)次。收集藻體細(xì)胞，并提取基因組總DNA。
[0040] (2)根據(jù)缺刻緣綠藻A6FAD基因cDNA全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)為JN205755)設(shè)計(jì)基因 特異引物（GSP1 :沈QIDNO. 1 ;GSP2 :沈QIDNO. 2 ;GSP3 :沈QIDNO. 3)，通過基因組步移 技術(shù)克隆出A6FAD基因上游的5'-側(cè)翼序列（SEQIDNO. 4)，再通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行啟 動(dòng)子序列的調(diào)控元件在線預(yù)測(cè)。
[0041] (3)根據(jù)已獲得的A6FAD基因上游5' -側(cè)翼序列并結(jié)合啟動(dòng)子序列分析結(jié)果 設(shè)計(jì)帶KpnI/BamHI酶切位點(diǎn)引物（SEQIDNO. 5和沈QIDNO. 6,其中沈QIDNO. 5的第 l-6bp為化nl酶切位點(diǎn)，SEQIDNO. 6的第l-6bp為BamHI酶切位點(diǎn)），利用PCR反應(yīng)把 A6FAD基因上游5'-側(cè)翼序列長(zhǎng)1965bp的片段亞克隆到PMD19-T載體中，得到重組質(zhì)粒 PMD19T-1965?；赑CAMBIA1304雙元表達(dá)載體中GFP基因的編碼序列設(shè)計(jì)帶BamHI/EcoRI 酶切位點(diǎn)引物（SEQIDNO. 7和沈QIDNO. 8,其中沈QIDNO. 7的第l-6bp為BamHI酶切 位點(diǎn)，SEQIDNO. 8的第l-6bp為EcoRI酶切位點(diǎn)