艾納香查爾酮合酶基因Bb-CHS、其編碼蛋白質(zhì)以及基因克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1，一種艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS編碼的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID NO:2，本發(fā)明還涉及RT?PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合，用于克隆艾納香查爾酮合酶基因Bb?CHS基因全長的方法。為進(jìn)一步研究艾納香Bb?CHS基因的表達(dá)、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為Bb?CHS基因參與艾納香黃酮組成及調(diào)控機(jī)制研究提供參考，同時也為菊科植物Bb?CHS基因功能和進(jìn)化研究提供了新的背景資料。另外Bb?CHS基因的大量表達(dá)，有助于提高艾納香的生物學(xué)產(chǎn)量，同時提高植株有效成分榭皮素等類黃酮化合物的含量，從而同時提高艾納香的產(chǎn)量和品質(zhì)。
【專利說明】
艾納香查爾酬合酶基因化-CHS、其編碼蛋白質(zhì)從及基因克隆 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種基因及其克隆方法，同時也設(shè)及到該基因編 碼蛋白質(zhì)，尤其設(shè)及一種艾納香查爾酬合酶基因抓-CHS、其編碼蛋白質(zhì)W及基因克隆方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾納香(Blumea balsamifera L.DC.)為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物，主要 分布于我國海南、貴州、廣西、廣東、云南、臺灣等省。W其全草或地上部分入藥，具有鎮(zhèn)痛、 發(fā)汗、桂風(fēng)除濕、去疲止咳、通經(jīng)止血等功效，在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族地區(qū)有著悠久 的用藥歷史，是一種重要的民間藥物。同時艾納香也是獲取天然冰片(艾片）的重要植物來 源之一。并且，在精致艾片過程中所產(chǎn)生的艾油具有擴(kuò)張血管、降低血壓、抑制交感神經(jīng)的 作用，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。另外，艾油因其獨(dú)特的芳香氣味，還被廣泛應(yīng)用于香料 W及化妝品行業(yè)。雖然W艾納香為原材料的產(chǎn)品眾多，然而關(guān)于其化學(xué)成分的研究較少。
[0003] 對于艾納香而言，其化學(xué)成分比較復(fù)雜，但具有藥理作用的主要集中在黃酬類和 揮發(fā)油成分上。關(guān)于艾納香揮發(fā)油成分的研究：周欣等（2001)、馬芝玉等（2009)采用GC/MS 方法檢測到艾納香中揮發(fā)油成分主要為:k龍腦、精腦、e-石竹締、芳精醇、大葉香締D、香木 蘭締、順-a-沒藥締、e-孽澄茄油締、丫-依蘭油締、ent-貝殼杉締等祗類化合物。鄧芹英等 (1996)，曹家慶等(2008)，陳銘等(2009)分別對艾納香中黃酬類成分進(jìn)行了分析，主要含有 艾納香素、木犀草素、搬皮素、兒茶素W及阿亞黃素等。除此之外，艾納香中還含有多其他種 化合物，如小麥黃素、芹菜素、原兒茶酸（甲醋）、咖啡酸（甲醋）、香草酸等化合物。其中樹皮 素等類黃酬化合物具有廣泛的生理活性，在抗腫瘤方面具有良好的作用。
[0004] 查爾酬合酶（chalcone synthase,CHS)是類黃酬類物質(zhì)代謝合成過程中的關(guān)鍵 酶，在植物與環(huán)境的相互作用中起到了重要的作用（如抗病、防止UV損傷、影響植物根瘤形 成等），對植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，同時與植物的花色的形成密切相關(guān)。目前 在研究植物生長發(fā)育及抗性中設(shè)及較多研究，而從植物次生代謝及產(chǎn)物藥理藥效活性方面 研究較少。
[0005] 目前，CHS基因在高梁、玉米、矮牽牛、蘭花、金魚草、擬南芥、豆類和松樹等植物上 成功克隆，但目前還沒有關(guān)于艾納香查爾酬合酶(CHS)基因的相關(guān)報道。因此，對艾納香查 爾酬合酶基因的克隆W及對他們的生物學(xué)功能研究，將有助于明確艾納香中類黃酬類次生 代謝的分子機(jī)理，為調(diào)控其艾納香中有效成分等奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種首次從艾納香種獲得的查爾 酬合酶基因。本發(fā)明的另一個目的是提供艾納香查爾酬合酶編碼的氨基酸序列及編碼蛋白 質(zhì)性質(zhì)生物信息學(xué)預(yù)測。同時，本發(fā)明還提供該艾納香查爾酬合酶基因的克隆方法及引物 對。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是運(yùn)樣實現(xiàn)的：
[000引本發(fā)明的第一個方面是提供一種艾納香查爾酬合酶基因，從艾納香（Blumea balsamifera DC)中克隆，命名為抓-C服基因，其核巧酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個方面是提供一種本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合酶基 因編碼的蛋白質(zhì)，命名為抓-C服蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本發(fā)明的第S個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合酶基因化- C服的克隆方法，其特征在于:包括W下步驟：
[0011] (1)從艾納香葉片中提取總RNA;
[001。。似總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA;
[0013] (3)設(shè)計簡并引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，其中，簡并引物對為：
[0014] PFl:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0015] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0016] (4)PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.COli JM109感受態(tài)細(xì) 胞，采用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗證后測序，獲得化-CHS基因 片段；
[0017] (5似總RNA為模板，采用SMART? race Kit提供的反轉(zhuǎn)錄引物合成RACE第一鏈 CDNA;根據(jù)獲得化-CHS基因片段設(shè)計3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對，WRACE第一鏈CDNA為模 板進(jìn)行快速擴(kuò)增，其中，3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對為：
[001 引 66-(：服基因5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0019] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0020] (6)步驟(5)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、回收、亞克隆和測序，獲得化-CHS基因3 '和5 ' 末端序列，并進(jìn)行拼接；
[0021] (7)根據(jù)上述拼接序列，于抓-CHS基因開放閱讀框兩端設(shè)計全長CDNA擴(kuò)增引物對， 進(jìn)行全長序列的克隆，其中全長CDNA擴(kuò)增引物對為：
[0022] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0023] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0024] 進(jìn)一步地，步驟(5)中5'-&3'-RACE PCR反應(yīng)體系為：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化 l;10x Ex !"aq Buffe;r，Mg2+plus 5]il;dNTP Mixture各2.5mmol/L，4]il;3'-RACE-Ready cDNA 化1 ;GSP，10皿ol/L，化I; UPM，IOx，5iU ; d地20補(bǔ)充至50iU ;
[0025] 進(jìn)一步地，步驟(7)中化-CHS基因全長序列的克隆的反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積 為50ia，1.5mmol/LMgCl2,4種dNTP各200i^mol/L，引物各150ng，1.5UTaqplusDNA polymerase,高保真，IOOng cDNA。
[0026] 進(jìn)一步地，步驟(1)中采用TRNzol法提取總RNA。
[0027] 進(jìn)一步地，步驟（2)中采用TaKaRa公司生產(chǎn)的PrimeScript? 1st Shand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0028] 本發(fā)明的第四個方面是提供一種克隆本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的簡并引物對，其特征在于，所述簡并引物對為：
[00巧]PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0030] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。
[0031] 本發(fā)明的第五個方面是提供一種克隆本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的3'和5'末端快速擴(kuò)增引物對，所述3'和5'末端快速擴(kuò)增引物對為：
[0032] Bb-CHS基因5'RACE引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0033] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0034] 本發(fā)明的第六個方面是提供一種克隆本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-C服的全長CDNA擴(kuò)增引物對，所述全長CDNA擴(kuò)增引物對為：
[0035] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0036] Bb-CHS基因3' 引物：TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0037] 本發(fā)明的第屯個方面是提供一種克隆本發(fā)明第一個方面所述的艾納香查爾酬合 酶基因抓-CHS的引物組，所述引物組包括簡并引物對、3'和5'末端快速擴(kuò)增引物對、W及全 長CDNA擴(kuò)增引物對，其中，
[0038] 所述簡并引物對為：
[0039] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0040] PR1：TCACCCACCT CGTATTTTGC；
[0041 ] 所述3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對為：
[0042] Bb-C服基因5'RACE引物:CACAAGGCTA TCAAGATGGG，
[0043] 66-(：服基因3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1';
[0044] 全長cDNA擴(kuò)增引物對為：
[0045] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0046] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0047] 本發(fā)明的有益效果是：
[0048] 本發(fā)明設(shè)及一種艾納香查爾酬合酶基因化-CHS與編碼的蛋白質(zhì)及其克隆方法。本 發(fā)明采用RT-PCR與RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，對艾納香種化-CHS基因進(jìn)行了研究，首次從艾 納香葉片中克隆得到化-CHS基因全長序列，并對其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，為進(jìn) 一步研究艾納香化-CHS基因的表達(dá)、調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為化-CHS基因參與艾納香黃酬組成 及調(diào)控機(jī)制研究提供參考，同時也為菊科植物化-C服基因功能和進(jìn)化研究提供了新的背景 資料。另外抓-CHS基因的大量表達(dá)，有助于提高艾納香的生物學(xué)產(chǎn)量，并同時提高植株有效 成分樹皮素等類黃酬化合物的含量，從而同時提高艾納香的產(chǎn)量和品質(zhì)。
【具體實施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，W更好地理解本發(fā)明。
[0050] 步驟1，選用艾納香(Blumea balsamifera DC)葉片作為試驗材料，采用TR化〇1法 提取總RNA，其含量及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0化1] 步驟2，^總1?酷為模板，采用化1(日1?日公司生產(chǎn)的？'1111日5。'191了《1318付日11(1。0魁 Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0052] 步驟3, W該cDNA為模板，根據(jù)NCBI上其他植物CHS基因保守區(qū)域，設(shè)計簡并引物 對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，簡并引物對為：
[0053] PF1:TCACCAAACA AAGCCTGTCC，
[0054] PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC;
[0055] 反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積為50iU，1.5mmol/L MgCl2,4種dNTP各200皿ol/L，引 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0化6] PCR反應(yīng)條件為：
[0化7]

[005引步驟4，PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. COli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗證后測序，獲得抓- C服基因片陳?
[0化9]
[0060]
[0061] 步驟5，根據(jù)上述抓-C服基因片段設(shè)計3 '和5 '末端快速擴(kuò)增(RACE)引物對；
[0062] 66-(：服基因 5'尺4〔6引物:〔4〔4466口'4 1'〔44641666，
[0063] 66-(：服基因 3'尺4〔6引物：〔660：7^66 1'〔444〔661'1'。
[0064] 步驟6:采用SMART? race Kit提供反轉(zhuǎn)錄引物，W總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 RACE 第一鏈 cDNA:
[00化]3'-RACE-Ready cDNA反應(yīng)體系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer:化1，補(bǔ) dd出0至終體積扣I;
[0066] 5'-RACE-Ready cDNA反應(yīng)體系：Total RNA liig，3'-RACE CDS Primer 化1，BD SMART II? Oligonucleotide TC溫育2min，補(bǔ)dd出0至終體積化I。
[0067] 將各反應(yīng)體系混勻后，短暫離屯、，于70°C溫育2min，迅速于冰中冷卻2min，短暫快 速離屯、后，在反應(yīng)管中加入下列試劑：5X First-Strand Buffer 2iil，DTT liil，dNTP Mix 1 ]il，BD PowerScript Reverse Transcriptase 化1，加 d地2〇補(bǔ)至lOyl，混勻，短暫離屯、，42 。(:溫育化，加入10化I Tricine-EDTA緩沖液稀釋反應(yīng)產(chǎn)物;72°C加熱10min，4°C保存?zhèn)溆谩?[006引步驟7,采用3'和5'末端快速擴(kuò)增(RACE)引物對，WRACE第一鏈CDNA為模板進(jìn)行快 速擴(kuò)增。
[0069] 5，-&3'-RACE PCR反應(yīng)體系：TaKaRa Ex Taq(SUAU)O.化1，IOx Ex Taq Buffer (Mg2+plus)扣l，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4山，3'-RACE-Ready cDNA 化1，GSP(10皿ol/ L)化1，1]口]?(10義）541，(1地2〇補(bǔ)充至50山。
[0071]
[0070] PCR厲獻(xiàn)簽化.
[0072]
[0073] 步驟8，PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、回收、亞克隆和測序。獲得抓-CHS基因3 '和5 '末端序列，并 進(jìn)行拼接。
[0074] 步驟9,根據(jù)上述拼接序列，于化-CHS基因開放閱讀框(ORF)兩端設(shè)計全長CDNA擴(kuò) 增引物對：
[0075] Bb-C服基因5'引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT，
[0076] Bb-CHS基因3' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
[0077] 進(jìn)行抓-C服基因全長序列的克?。?br>[007引反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積為50iU，1.5mmol/L 1旨(：12,4種(1腫?各200皿01/1，弓| 物各 150ng，l.抓！"aq plus DNA polymerase(高保真），100ng cDNA。
[0079] PrRl^歷義化擊.
[0080]
[0081 ] PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、回收、亞克隆和測序，獲得化-CHS基因全長序列SEQ ID NO: 1，其 編碼的氨基酸序列SEQ ID NO:2。
[0082] W上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于W上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種從艾納香中獲得的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示。2. -種權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于:其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -種權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的克隆方法，其特征在于:包括 以下步驟： (1) 從艾納香葉片中提取總RNA; (2) 以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; (3) 設(shè)計簡并引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，其中，簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； (4) PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，采 用藍(lán)白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗證后測序，獲得Bb-CHS基因片段； (5) 以總RNA為模板，采用SMART? RACE Kit提供的反轉(zhuǎn)錄引物合成RACE第一鏈cDNA;根 據(jù)獲得Bb-CHS基因片段設(shè)計3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對，以RACE第一鏈cDNA為模板進(jìn)行快 速擴(kuò)增，其中，3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; (6) 步驟(5)得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測、回收、亞克隆和測序，獲得Bb-CHS基因3 '和5 '末端 序列，并進(jìn)行拼接； (7) 根據(jù)上述拼接序列，于Bb-CHS基因開放閱讀框兩端設(shè)計全長cDNA擴(kuò)增引物對，進(jìn)行 全長序列的克隆，其中全長cDNA擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(5)中5 ' -&3 ' -RACE PCR反應(yīng)體系 為：TaKaRa Ex Taq(5U/yl)0.4yl;10x Ex Taq BufTer，Mg2+plus 5yl;dNTP Mixture各 2 · 5mmo 1/L，4μ1; 3 ' -RACE-Ready cDNA ΙμL; GSP，lOymol/L，ΙμL; UPM，IOx，5μ1; ddH20補(bǔ)充至 50μ1〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟(7)中Bb-CHS基因全長序列的克 隆的反應(yīng)體系為:PCR反應(yīng)總體積為50μ1，1.5mmol/L MgCl2，4種dNTP各200ymol/L，引物各 150ng，1.5U Taq plus DNA polymerase，高保真，IOOng cDNA。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的克隆方法，其特征在于，步驟（1)中采用TRNzol法提取總RNA; 步驟（2)中米用TaKaRa公司生產(chǎn)的PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。7. -種用于克隆權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的簡并引物對，其特 征在于，所述簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl:TCACCCACCT CGTATTTTGC。8. -種用于克隆權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的3 '和5 '末端快速擴(kuò) 增引物對，其特征在于，所述3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT。9. 一種用于克隆權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的全長cDNA擴(kuò)增引物 對，其特征在于，所述全長cDNA擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。10. -種用于克隆權(quán)利要求1所述的艾納香查爾酮合酶基因 Bb-CHS的引物組，其特征在 于，所述引物組包括簡并引物對、3'和5'末端快速擴(kuò)增引物對、以及全長cDNA擴(kuò)增引物對， 其中， 所述簡并引物對為： PFl：TCACCAAACA AAGCCTGTCC, PRl：TCACCCACCT CGTATTTTGC； 所述3 '和5 '末端快速擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' RACE 引物：CACAAGGCTA TCAAGATGGG， Bb-CHS基因 3 ' RACE 引物：CGGCCTTCGG TCAAACGGTT; 全長cDNA擴(kuò)增引物對為： Bb-CHS基因 5 ' 引物:ATGGTAAACG TTCAGGAGTT， Bb-CHS基因 3 ' 引物:TCAAATGGAC ACACTATGGA。
【文檔編號】C12N15/10GK105925546SQ201610309822
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】官玲亮, 龐玉新, 夏奇峰, 于福來, 黃梅, 胡遠(yuǎn)鵬, 胡璇, 謝小麗
【申請人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所