專利名稱：VEGF-165及HβD3雙基因質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因治療領(lǐng)域，具體地說，涉及可在基因重組技術(shù)中使用的質(zhì)粒 載體及其構(gòu)建方法；更具體地說，是涉及具有VEGF-165和Ηβ D3雙基因真核表達重組質(zhì)粒 載體及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和工業(yè)化程度的日益提高，創(chuàng)傷與其他意外傷害所致的死亡 在我國已成為僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病的第四大死亡原因，在青壯年 中則占第一位。因此，深入開展創(chuàng)傷與創(chuàng)傷后組織修復(fù)的研究不僅是創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)深入發(fā)展的 需要，也是現(xiàn)代社會發(fā)展的重要需求。目前，對于頌面部及人體其它部位創(chuàng)傷的修復(fù)，特別 是大型組織缺失的創(chuàng)傷修復(fù)多采用“以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷”的治療模式，雖然對局部創(chuàng)傷組織缺 失的修復(fù)起到明顯的療效，挽救了患者生命，創(chuàng)傷后一次性組織瓣移植修復(fù)創(chuàng)傷缺損也大 大縮短了患者的治療時間，但是由于組織瓣的來源是患者身體其它部位的正常機體，術(shù)后 必定為供區(qū)帶來新的創(chuàng)傷，留下新的瘢痕，甚至功能障礙，對患者術(shù)后的生活質(zhì)量帶來一定 的影響。如何以“無創(chuàng)修復(fù)創(chuàng)傷”的方式治療這一疾病，是目前急待解決的課題。機體損傷后出現(xiàn)協(xié)調(diào)的愈合過程，其中包括多種細胞、細胞因子和細胞外基質(zhì)之 間錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用。細胞因子在創(chuàng)傷愈合過程中具有重要作用，它能調(diào)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)過 程中的多種細胞反應(yīng)，影響細胞增殖、遷移、細胞外基質(zhì)合成和釋放等。在眾多細胞因子中， 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一重要的促愈合因子，免疫組化顯示VEGF的表達主要位于上 皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的胞漿中，無論是在傷前組織還是傷后不同修復(fù)階段的組 織中，VEGF均呈持續(xù)性陽性表達，提示VEGF在頌面部組織中具有較為豐富的來源，顯示了 其所能發(fā)揮的作用。因此，我們特異性選擇VEGF作為促進創(chuàng)面愈合的活性多肽，是較為理 想而可行的。對于創(chuàng)口中的感染采用抗菌素治療是常用的方法，確能有效抑制或殺滅敏感細 菌，但抗菌素不能中和毒素、不能抵抗真菌，此外，尤其是廣譜抗菌素還可加重機體內(nèi)F常 生態(tài)菌群失調(diào)節(jié)器，更進一步削弱了機體內(nèi)環(huán)境微生態(tài)屏障，形成新的感染誘發(fā)因素。研究 發(fā)現(xiàn)防御素(defensin)有明顯的殺菌和抑菌作用，并有抗真菌和中和毒素的作用，其效果 與防御素量呈正相關(guān)，防御素在機體內(nèi)抗感染方面具有獨特的優(yōu)點。防御素是機體抵御病 原微生物入侵的天然免疫的重要介質(zhì)，人類β防御素(1 3)廣泛表達于口腔組織，如口 腔粘膜、唾液腺、牙齦、舌等組織，在口腔上皮天然宿主防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。其中β 防御素_3相對于其它防御素對鹽濃度不敏感，對多藥抗藥性的金色葡萄球菌和抗萬古霉 素的糞腸球菌具有強大的殺菌作用，對革蘭氏陽性菌殺傷力更強，并且不影響口腔內(nèi)環(huán)境 微生態(tài)菌群，不傷害人體組織細胞，是理想的抗口腔內(nèi)感染的活性抗菌肽。綜上，本發(fā)明 針對人體軟組織創(chuàng)傷臨床發(fā)生率高，危害重，治療難的科學(xué)問題，擬 優(yōu)選VEGF-165和防御素-3為實現(xiàn)既促進創(chuàng)面上皮修復(fù)，又能增強機體免疫的協(xié)同治療策 略解決問題，為有效治療機體軟組織創(chuàng)傷提供新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是構(gòu)建一種人VEGF-165和人防御素3雙基因重組質(zhì)粒載體， 為基因治療機體軟組織創(chuàng)傷提供新的途徑。本發(fā)明的目的之二 是提供上述重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的之一，主要通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)VEGF-165和Hi3D3雙基因質(zhì)粒載體，其特征是所述的重組質(zhì)粒載體包括人 VEGF-165 和人 H β D3 基因。

其中，VEGF-165基因序列如序列表1所述。Ηβ D3基因序列如序列表2所述。 pVIVOl-mcs質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)圖如表3所示，Ηβ D3基因插入到載體MCSl位點即968_974bp 區(qū)域，VEGF-165基因插入到載體MCS2位點即4085_4098bp區(qū)域。利用pVIVOl-mcs質(zhì)粒載 體系統(tǒng)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3。本發(fā)明所用質(zhì)粒載體pVIV01-mCS，是雙基因共表達真核載體，宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效 率和基因表達水平高，暫時性表達，安全性較好，是基因治療的優(yōu)良載體，應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合 和組織工程等較為理想。本發(fā)明的目的之二，主要通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種VEGF-165和Ηβ D3雙基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，主要包括以下幾個步驟1)獲得人VEGF-165和人Ηβ D3基因；2)用NcoI和EcoRI對H β D3DNA和質(zhì)粒pVIVOl-mcs進行雙酶切，采用粘端連接法 進行連接，獲得重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3 ；3)再用 BspHI 和 HindIII 對重組質(zhì)粒 pVIVOl-mcs-Hβ D3 和 VEGF DNA 進行雙酶 切，采用粘端連接法進行連接，得到重組質(zhì)粒pVIV01-mcs-VEGF165-Hi3 D3 ；4)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細胞，外源基因在細胞中表達。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果1、本發(fā)明選擇特異性促進上皮細胞增殖的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和能抗細 菌、抗真菌并能中和毒素的人類βΗβ 3(Ηβ 3)作為活性生物分子，將其克隆到多基因表 達載體pVIVOl-mcs中，并將其轉(zhuǎn)染損傷粘膜區(qū)，使損傷局部表達分泌VEGF和H β D3，同時發(fā) 揮這兩種基因的作用，促進創(chuàng)面愈合。動物實驗充分證實VEGF和Hi3D3雙基因療法能夠 加快口腔粘膜組織難愈性創(chuàng)傷的愈合。2、本發(fā)明在同一載體上搭載血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和人類βΗβ 3(Ηβ 3)， 使基因轉(zhuǎn)染后，兩個外源基因共表達，協(xié)同發(fā)揮作用。同時多基因表達載體pVIVOl-mcs是 瞬時轉(zhuǎn)染的，治療后不會對機體產(chǎn)生長久的作用，從而避免了其它并發(fā)癥的產(chǎn)生。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明圖1是VEGF-165及Ηβ D3雙基因質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2獲取的目的基因電泳圖HL-I和HL-2均為從白血病細胞(HL60)中擴增出 hVEGF165cDNA基因片段，YY為從牙齦組織中擴增出Ηβ D3cDNA基因片段；圖3重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3NcoI和EcoRI雙酶切鑒定圖 4 重組質(zhì)粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 雙酶切鑒定電泳圖 DL2000 和 DL15000 為Marker，P為空載體，VDP165為重組質(zhì)粒，VDP165-D為重組質(zhì)粒經(jīng)Ncol、EcoRI雙酶 切得到的Hi3D3cDNA基因片段，VDP165-V為重組質(zhì)粒經(jīng)AgeI、HindIII雙酶切后得到 hVEGF165cDNA 基因片段；圖5轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3的293FT細胞48h時明場下做 免疫熒光；圖 6 轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h DAPI 下做免 疫熒光；圖 7 轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h 綠光下 Ηβ D3 紅色熒光抗體；圖 8 轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒 pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3 的 293FT 細胞 48h 藍光下 VEGF 綠色熒光抗體。
具體實施方式
1. 1材料手術(shù)中切除的患者牙齦組織由西南醫(yī)院口腔科提供，白血病細胞HL-60 由本所曲小龍碩士惠贈，293FT細胞由本所保存，VEGF165和Ηβ D3上下游引物均由上海捷 瑞生物公司合成，其他主要試劑見下表
Γμμ
質(zhì)粒 pVIVOl-mcsInvivoGen
總RNA提取試劑盒大連寶生物
質(zhì)粒小提試劑盒北京天根
NcoI酶東洋坊
EcoRI酶東洋坊
HindIII 酶NEB
BspHI IlNEB
AgeI 酶NEB
逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace- α )東洋紡
高保真聚合酶(kod-pius)mm
普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒北京天根
權(quán)利要求
1.VEGF-165及Hi3D3雙基因質(zhì)粒載體，其特征在于所述重組質(zhì)粒載體包括人 VEGF-165cDNA，和人 H0D3cDNA，其中 VEGF_165cDNA 基因序列為CCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGTACGTTCGTTTAACTCAAGCTGCCTCGCCTTGCAACGCGAGTCTGT GTTTTTGCAGGAACATTTACACGTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGCTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGCCCACAGG GATTTTCTTGTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCACATTTGTTGTGCTGTAGGAAGCTCATCTCTCCTATG TGCTGGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAATCTGCATGGTGATGTTGGACTCCTCAGTGGGCACACACTCCAGGCC CTCGTCATTGCAGCAGCCCCCGCATCGCATCAGGGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTCATCAGGGT ACTCCTGGAAGATGTCCACCAGGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCTGCGCTGATAGACATCCATGAACTTCACCACT TCGTGATGATTCTGCCCTCCTCCTTCTGCCATGGGTGCAGCCTGGGACCACTTGGCATGGTGGAGGTAGAGCAGCAA GGCAAGGCTCCAATGCACCCAAGACAGCAGAAAGTTCAT ；H3D3cDNA基因序列為ATGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTGTTTTTGGTGCCTGTTCCAGGTCATGGAGGAATC ATAAACACATTACAGAAATATTATTGCAGAGTCAGAGGCGGCCGGTGTGCTGTGCTCAGCTGCCTTCCAAAGGAGGA ACAGATCGGCAAGTGCTCGACGCGTGGCCGAAAATGCTGCCGAAGAAAGAAATAA。
2.如權(quán)利要求1所述的VEGF-165及Hi3D3雙基因質(zhì)粒載體，其特征在于利用 pVIVOl-mcs質(zhì)粒載體系統(tǒng)，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-VEGF165-H0 D3。
3.VEGF-165及Hi3D3雙基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下幾個步驟1)獲得人VEGF-165和人Hβ D3基因；2)用NcoI和EcoRI對Hβ D3DNA和質(zhì)粒pVIVOl-mcs進行雙酶切，采用粘端連接法進行 連接，獲得重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-Ηβ D3 ；3)再用BspHI和HindIII對重組質(zhì)粒pVIVOl-mcs-HβD3和VEGF DNA進行雙酶切，采 用粘端連接法進行連接，得到重組質(zhì)粒pVIV01-mcs-VEGF165-Hi3 D3 ；4)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細胞，外源基因在細胞中表達。
4.如權(quán)利要求3所述的VEGF-165及Hβ D3雙基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于 通過RT-PCR獲得人VEGF-165和人H β D3基因。
5.如權(quán)利要求4所述的VEGF-165及Hβ D3雙基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于 根據(jù)Genebank中基因序列設(shè)計合成擴增VEGF-165和Ηβ D3的PCR引物其中擴增VEGF-165的PCR引物序列是正向 5，-CCCAAGCTTCACCGCCTCGGCTTGTC-3 ‘，引入 Hindi 11 位點，反向 5，-CGTCATGACCATGAACTTTCTGCTGT-3'，引入 BspHI 位點，其中擴增 H β D3 的 PCR 引物序列是正向 5 ‘ -CATGCCATGGCAGCTATGAGGATCCAT-3 ‘，引入 Nco I 位點，反向 5 ‘ -CCGGAATTCTCAGGGTTTTTATTTCT-3 ‘，引入 EcoRI 位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種VEGF-165及HβD3雙基因質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法，利用pVIVO1-mcs質(zhì)粒載體系統(tǒng)，采用酶切重組的方式，將人牙齦組織中獲得HβD3cDNA和白血病細胞(HL-60)中獲得VEGF165cDNA構(gòu)建成重組質(zhì)粒pVIVO1-mcs-VEGF165-HβD3。本發(fā)明將特異性促進上皮細胞增殖的VEGF和能抗細菌、抗真菌并能中和毒素的HβD3重組在同一載體上共同表達，將其應(yīng)用于創(chuàng)傷愈合，既能促進創(chuàng)面上皮修復(fù)，又能增強創(chuàng)傷內(nèi)環(huán)境免疫，達到“雙管齊下”。本發(fā)明將在創(chuàng)傷愈合的基因治療和組織工程研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/63GK102031268SQ201010289310
公開日2011年4月27日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者夏章權(quán), 張從紀 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院