專利名稱：一種提取枯草芽孢桿菌基因工程菌質(zhì)粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取枯草芽孢桿菌基因工程菌質(zhì)粒的方法。
背景技術(shù)：
枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis,簡稱B. subtilis)是芽抱桿菌的一個種，枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，該種在自然界分布極為廣泛，是一種重要的工業(yè)微生物，最早關(guān)于B. subtilis應(yīng)用的紀(jì)錄是采用該種的一個變種B. subtilis var. natto (舊稱Bacillus natto)發(fā)酵大豆以便生產(chǎn)細(xì)菌型發(fā)酵食品“納豆(Natto)”。這種食品是亞洲國家的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在中國，這種發(fā)酵食品被稱為“豆豉”。枯草芽孢桿菌酶的主要應(yīng)用領(lǐng)域之一是食品工業(yè)，全世界食品工業(yè)用酶約占總量的60%，我國則更是高達(dá)85%以上。由于它的細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，對人畜安全，是非致病的，不產(chǎn)毒素和致熱致敏蛋白質(zhì)，故為一種食品安全的菌種，美國食品藥物管理局(FDA)和中國農(nóng)業(yè)部等均批準(zhǔn)為安全菌株，是發(fā)酵工業(yè)中常用的菌種，被歸為食品級微生物范疇?？莶菅挎邨U菌為芽孢桿菌屬的模式菌種，其菌株168的全基因組序列已于1997年發(fā)表(G1: 50812173),基因組信息可以從數(shù)據(jù)庫 SubtiList (http://genolist. pasteur.fr/SubtiList/)搜索得到。其遺傳學(xué)和生理學(xué)已得到深入研究，人們對其遺傳背景和生理特性的了解僅次于大腸桿菌(E. coli)。對于外源蛋白表達(dá)的研究，枯草芽孢桿菌還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于大腸桿菌。但是在表達(dá)和分泌活性蛋白方面枯草芽孢桿菌則要明顯優(yōu)于大腸桿菌，枯草芽孢桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主，有以下一些優(yōu)點1)非致病性微生物，不產(chǎn)生內(nèi)毒素；2)沒有明顯的密碼子偏好性，同時表達(dá)產(chǎn)物也不容易形成包涵體；3)分泌蛋白能力強，特別是對一些源于革蘭氏陽性菌的蛋白，可直接將功能性胞外蛋白分泌到培養(yǎng)基中(目前，大約60%的市售酶由芽孢桿菌生產(chǎn))，這有利于目的蛋白的回收和純化等后續(xù)操作；4)遺傳背景研究比較清楚，以及多年的工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)基礎(chǔ)。但是，也存在以下一些不足1)存在限制和修飾系統(tǒng)，重組質(zhì)粒不穩(wěn)定；2)能自發(fā)形成感受的菌株極少，感受態(tài)持續(xù)時間短暫，分子克隆效率低；3)能夠產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，往往造成表達(dá)產(chǎn)物的大量降解?？傊?，隨著研究的不斷深入，相信不久的將來枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在的問題會很好地被解決。獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA是構(gòu)建枯草芽孢桿菌表達(dá)體系的前提條件。目前用于細(xì)菌質(zhì)粒DNA抽提的方法不少，如常規(guī)的堿裂解法、SDS裂解法等，但枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏 陽性菌，胞壁較厚，且多數(shù)易形成芽孢，使用常規(guī)的質(zhì)粒提取方法實驗結(jié)果不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種提取枯草芽孢桿菌基因工程菌質(zhì)粒的方法，以解決現(xiàn)有提取方法存在的破壁不完全、質(zhì)粒DNA質(zhì)量低、產(chǎn)量不高、重復(fù)性差等缺陷。本發(fā)明利用普通瓊脂糖凝膠電泳即可分析枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒圖譜、且操作簡便、安全、質(zhì)粒圖譜清晰、重復(fù)性好，為枯草芽孢桿菌分子克隆以及表達(dá)系統(tǒng)的建立創(chuàng)造了有利條件。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。所述的提取枯草芽孢桿菌質(zhì)粒DNA的方法，包括以下步驟I)菌體的培養(yǎng)與收集挑取枯草芽孢桿菌的單菌落于2-10ml LB液體培養(yǎng)基中28-35°C振蕩培養(yǎng)10-15小時，0. 5-5wt%轉(zhuǎn)接到40_150ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至細(xì)菌生長密度為OD6tltl = 0. 5-1. 2，收集40-150mg菌體于離心管中；·
2)原生體的制備向收集的菌體中加入1-1. 5ml預(yù)冷的洗滌液A懸浮細(xì)胞，12000g離心，棄上清，菌體重懸于200-300 u I細(xì)胞裂解液B，37°C溫育1. 5_2h ；3)細(xì)胞的裂解和質(zhì)粒的提取向制備好的上述溶液中加入200-300 iiic，緩慢混勻，68°C處理lOmin，裂解細(xì)胞，向裂解液中加入100-150 溶液D，輕輕混勻，于_20°C中放20-30min ;4°C離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新I離心管內(nèi)，加入無水乙醇，_20°C過夜；4°C離心棄上清，70wt %乙醇洗滌沉淀，真空干燥沉淀，加入無菌純水溶解沉淀；4)質(zhì)粒的純化將制備好的上述溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA聯(lián)接液E到離心管中，用手顛倒1-5分鐘混勻；將聯(lián)接混合液加入一個含結(jié)合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入離心管中，再次加入聯(lián)接混合液離心，直至所有聯(lián)接混合液離心完畢；將含結(jié)合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700 ill洗滌液F到結(jié)合柱中，離心，倒掉收集管中的廢液；將結(jié)合柱重新放回收集管，8000-18000rpm離心1_5分鐘；將結(jié)合柱裝入新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 Ul洗脫液G，不戳破膜，室溫放置，8000-15000rpm離心1_3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于_20°C ;其中洗脫液 G 為 0.1mM 的 Tris-HCl，pH=9. O。其中，上述提取方法中，所述洗滌液A由20-30mM Tris-HCl、l-5mMEDTA、30-50mMNaCl,2-20%的焦磷酸鈉組成，pH = 8. O。其中焦磷酸鈉的單位為g/L。所述細(xì)胞裂解液B 由 20-30mM Tris-HCl、l_5mM EDTA、30_50mM NaCl、20wt% 葡萄糖和2mg/ml溶菌酶組成，pH=8. O。所述溶液C 由 20-30mM Tris-HCl、l_5mM EDTA、30_50mM NaCl 和 8wt%SDS 溶液組成，pH=8. O。所述溶液D 為 3M 的 NaAc, pH = 4. 8。所述DNA聯(lián)接液E由5-10M異硫氰酸胍、200_600mM醋酸鉀組成，pH=4. 5-6. O。所述洗滌液F由70%乙醇、150mM醋酸鉀組成，pH=5. O。本發(fā)明的提取方法，具有以下優(yōu)點I)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒DNA提取方法操作簡單，不需要較為復(fù)雜的設(shè)備，常規(guī)分子生物學(xué)或微生物學(xué)實驗室就可完成。2)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒DNA提取方法，選擇適宜的條件進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及合適體積的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，可最大限度的提高提取的效率；同時提取的質(zhì)粒圖譜清晰、重復(fù)性好、結(jié)構(gòu)完整，A26tlA■均達(dá)到了1. 80，完全可以滿足常規(guī)分子生物學(xué)實驗的要求，為枯草芽孢桿菌分子生物學(xué)的研究創(chuàng)造了有利條件。3)本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒DNA提取方法，應(yīng)用范圍廣，同樣適用于其它革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取。


圖1為枯草芽孢桿菌質(zhì)粒電泳圖，其中M為超螺旋DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株168質(zhì)粒PHY300a圖譜，2為枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主菌株WB600質(zhì)粒PHY300a圖譜，3為枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主菌株WB800N質(zhì)粒PHY300a圖譜，4為枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株168質(zhì)粒PHT43圖譜，5為枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主菌株WB600質(zhì)粒PHT43圖譜，6為枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株168質(zhì)粒PHT43圖譜。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。1、選用材料為枯草芽孢桿菌宿主菌株及質(zhì)粒(表I)。
表I枯草芽孢桿菌宿主菌株及質(zhì)粒
權(quán)利要求
1.一種提取枯草芽孢桿菌基因工程菌質(zhì)粒的方法，其特征在于，包括以下步驟O菌體的培養(yǎng)與收集挑取枯草芽孢桿菌的單菌落于2-10ml LB液體培養(yǎng)基中 28-35°C振蕩培養(yǎng)10-15小時，O. 5_5wt%轉(zhuǎn)接到40_150ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，至細(xì)菌生長密度為OD_ = O. 5-1. 2，收集40-150mg菌體于離心管中；2)原生體的制備向收集的菌體中加入1-1.5ml預(yù)冷的洗滌液A懸浮細(xì)胞，離心棄上清，菌體重懸于200-300 μ I細(xì)胞裂解液B，37°C溫育1. 5_2h ；3)細(xì)胞的裂解和質(zhì)粒的提取向制備好的上述溶液中加入200-300μ I溶液C，緩慢混勻，68°C處理lOmin，裂解細(xì)胞，向裂解液中加入100-150 μ I溶液D，輕輕混勻，于_20°C中放20-30min ;4°C離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管內(nèi)，加入無水乙醇，_20°C過夜；4°C離心， 棄上清，70wt%乙醇洗滌沉淀，真空干燥沉淀，加入無菌純水溶解沉淀；4)質(zhì)粒的純化將制備好的上述溶液轉(zhuǎn)移到一個干凈的離心管中，加入2-5倍體積DNA 聯(lián)接液E到離心管中，用手顛倒1-5分鐘混勻；將聯(lián)接混合液加入一個含結(jié)合柱的收集管中，室溫放置1-5分鐘，3000-10000rpm離心1_3分鐘，倒掉收集管中的廢液，將結(jié)合柱重新放入離心管中，再次加入聯(lián)接混合液離心，直至所有聯(lián)接混合液離心完畢；將含結(jié)合柱的收集管放置在一個新的離心管中，加入300-700 μ I洗滌液F到結(jié)合柱中，離心，倒掉收集管中的廢液；將結(jié)合柱重新放回收集管，8000-18000rpm離心1_5分鐘；將結(jié)合柱裝入新的離心管中，室溫放置，以便乙醇揮發(fā)干凈，在膜中央小心加入30-50 μ I洗脫液G，不戳破膜，室溫放置，8000-15000rpm離心1_3分鐘，離心管中即為分離的DNA，貯存于_20°C;其中洗脫液G 為 O.1mM 的 Tris-HCl，ρΗ=9· O。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌液A由20-30mMTris-HCl、l-5mM EDTA、30-50mM NaCl,2-20%的焦磷酸鈉組成，pH = 8. 0，其中焦磷酸鈉的單位為g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞裂解液B由20-30mMTris-HCl、 l-5mM EDTA、30-50mM NaCl、20wt% 葡萄糖和 2mg/ml 溶菌酶組成，pH=8. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液C由20-30mMTris-HCl、l-5mM EDTA、30-50mM NaCl 和 8wt%SDS 溶液組成，pH=8. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液D為3M的NaAc，pH= 4. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA聯(lián)接液E由5-10M異硫氰酸胍、 200-600mM 醋酸鉀組成，pH=4. 5-6. O。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗滌液F由70%乙醇、150mM醋酸鉀組成，pH=5. O。
全文摘要
本發(fā)明公開一種提取枯草芽孢桿菌基因工程菌質(zhì)粒的方法，包括以下步驟1)枯草芽孢桿菌菌體的培養(yǎng)與收集；2)原生體的制備；3)細(xì)胞的裂解和提??；4)質(zhì)粒的純化。應(yīng)用該方法得到的質(zhì)粒DNA可直接用來限制性內(nèi)切酶消化、PCR擴(kuò)增等多種分子生物學(xué)實驗。本發(fā)明操作簡便、安全、質(zhì)量高，可同時適用于多種革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取，因此具有廣泛的適用性。
文檔編號C12N15/10GK103013980SQ201210510549
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者王金斌, 唐雪明, 李文, 陳大超, 祝子坪, 何建華, 蔣瑋, 白藍(lán), 劉華, 李鵬, 吳瀟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院