專利名稱：無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN、其構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中無選擇標記真菌基因組整合技術(shù)，特別是涉 及一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2000年，Zuo等將XVE系統(tǒng)與Cer/lox P剪切系統(tǒng)結(jié)合發(fā)展了一種標記 基因剔除系統(tǒng)CLX(Cer/lox PDNAexcision systerm)。在擬南芥上的研究表明， 經(jīng)P—雌二醇誘導(dǎo)后，CLX對受體植株標記基因區(qū)(包括XVE、重組酶基因 Cre和標記基因叩tll)的切除率達100%。該系統(tǒng)不僅可精確控制切除時間， 而且不依賴于ipt表型篩選。
pX6-GFP無選擇標記系統(tǒng)的作用原理是LB(左邊界)與RB(右邊界)之間 的部分為其T-DNA區(qū)。在其T-DNA區(qū)內(nèi)，主要有XVE、 nptll、 Cer、 GFP 以及兩個loxP位點這幾大組件。XVE是一個融合轉(zhuǎn)錄因子的縮寫，分別表 示細菌轉(zhuǎn)錄抑制子的DNA結(jié)合域(X)、 VP16的轉(zhuǎn)錄激活域、人類雌激素受 體的調(diào)節(jié)亞基。Cre重組酶基因中間用一內(nèi)含子隔開，以防止內(nèi)源順式因子 的影響，其啟動子OLexA-46由8拷貝的LexA結(jié)合位點和35S啟動子的核 心區(qū)構(gòu)成。G10-90是一個人工合成的強組成型啟動子，在植物中其表達活性 要遠高于35S啟動子(Zuo等，2000)。其工作原理為:在G10-90啟動子控制 下，XVE融合轉(zhuǎn)錄因子組成型表達；當(dāng)誘導(dǎo)物P-雌二醇存在時，雌激素和 其受體結(jié)合，導(dǎo)致XVE融合蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，并由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進入核內(nèi)； 在細胞核內(nèi)，LexA的DNA結(jié)合域特異性識別LexA操縱子區(qū)，以至使VP16 的轉(zhuǎn)錄激活域激活OLexA-46 35S啟動子，表達Cre重組酶，從而去除兩個 loxP位點之間的部分，選擇標記基因npt隨之被去除。此時G10-90可以使 下游的GFP報告基因表達，以檢測該系統(tǒng)的去除效率。現(xiàn)己證明，XVE系 統(tǒng)除嚴格依賴于雌激素外，還可根據(jù)雌激素的加入劑量嚴格地控制下游基因 的表達水平。
2001年ZuoJ.等構(gòu)建了載體pX6-GFP—CLX類表達載體。在CLX載體 系統(tǒng)中，Cre能催化具有相同序列位點的兩條DNA鏈間的重組，可識別雙鏈 DNA中由34bp組成的特異性堿基序列(loxp位點)，在loxp位點中，除了 中間的8個堿基對外，其余部分為一個反向平行結(jié)構(gòu)。Cre-DNA復(fù)合物的晶 體學(xué)分析結(jié)果表明，在Cre-loxP復(fù)合體中，4個相同的Cre亞基結(jié)合成一個 環(huán)形結(jié)構(gòu)并與兩個反向平行的loxP結(jié)合，每個Cre亞基與兩個相鄰的Cre亞基和loxP位點相結(jié)合。在轉(zhuǎn)基因植物中，可以在外源基因兩側(cè)分別插入兩個
loxP位點，利用Cre的作用將位于loxP位點，利用Cre的作用將位于loxP 位點之間的外源基因選擇性地切除。
在pX6-GFP載體中，Cre基因的表達受"雌激素受體反式激活因子"XVE 的嚴格控制，XVE受P-雌二醇誘導(dǎo)。由于OLex-46啟動子在細菌中能部分 表達，因此在Cre編碼序列中插入了一段短的內(nèi)含子序列阻止其在細菌中發(fā) 生非誘導(dǎo)的背景表達。Cre-int嵌合基因使由在Cre編碼系列的第144個密碼 子和145個密碼子之間插入擬南芥KOR1基因的第五內(nèi)含子元件構(gòu)成，其中 +4-+6核苷酸序列由TTG突變?yōu)門AQ使其更能與擬南芥的剪接區(qū)相比配。 Kan基因被置于XVE和Cre轉(zhuǎn)錄單元之間，這三個轉(zhuǎn)錄單元機密相連并共 同處于兩正確排列的loxP序列之間。因此，當(dāng)用P-雌二醇誘導(dǎo)XVE表達時， Cre被XVE激活，loxP序列之間的3個轉(zhuǎn)錄單元就被刪除。下游的GFP報 告基因就在啟動子G10-90的控制下表達。用此系統(tǒng)轉(zhuǎn)化擬南芥獲得43個kan 愈傷，將其中五個轉(zhuǎn)到P-雌二醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，其余38個轉(zhuǎn)到MS 培養(yǎng)基。兩周后，5個被誘導(dǎo)的外植體都表達了GFP活性，而MS培養(yǎng)基上 的38個愈傷均不表現(xiàn)GFP活性。分子檢測證明這是由于P-雌二醇誘導(dǎo)發(fā)生 位點轉(zhuǎn)移重組使loxP位點轉(zhuǎn)移重組使loxP位點間的序列發(fā)生刪除所致，GFP 在啟動子G10-90控制下表達的結(jié)果。
C.Sreekala等人2005年成功的將pX6-GFP載體進行改造，將其G10-90 啟動子替換成玉米泛素蛋白啟動子，并轉(zhuǎn)如水稻中。在86株基因植物中有 10株在TO代就出現(xiàn)了標記基因消除的現(xiàn)象，17株在Tl代分離出MGTPs。
ZhangY.等人亦于2006年改建了 pX6-GFP替換成了內(nèi)毒素基因crylAc， 轉(zhuǎn)入番茄中進行表達。15%的丁1子代出現(xiàn)了標記基因消除的現(xiàn)象。
國外糖化酶的生產(chǎn)公司主要是丹麥Novozymes和美國Genencor，其生產(chǎn) 菌株均為基因工程菌，發(fā)酵液酶活力在50,000U/mL以上，其酶制劑產(chǎn)品占 世界市場份額的44%和29%，再加之日本等國家產(chǎn)品的進入，我國民族工業(yè) 產(chǎn)品市場占有率不足5%，因此我國酶制劑工業(yè)有很大的發(fā)展空間。
目前我國糖化酶活力僅在32，000u/ml左右，且大多含有轉(zhuǎn)苷酶；不含轉(zhuǎn) 苷酶產(chǎn)品只有四川省山野生物科技有限公司、棗莊市杰諾生物酶有限公司、 邢臺新欣翔宇生物有限公司、津市市新新型發(fā)酵有限公司等幾家企業(yè)，它們 的生產(chǎn)菌種都是從國外引進的基因工程菌，發(fā)酵液酶活力只有30000—50000 U/mL。這些公司雖然有液體糖化酶出口，但生產(chǎn)成本高，利潤空間很小，缺 乏市場競爭力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN、其構(gòu)建方法及在在黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)基因的敲除糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)高產(chǎn) 工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用，通過本方法所獲得的基因工程菌株無抗性選擇標記， 糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)基因的拷貝數(shù)增加，同時不需要去除轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)。 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN，其主要結(jié)構(gòu)是RB— MCS1—LoxP—hER—hpt—ERE-Pura~Cre—LoxP—MCS2—LB.
而且，所述整合質(zhì)粒pUNFIN的LB和RB為左臂和右臂，并能將其間 的DNA序列隨機整合到真菌的基因組中；Cre/LoxP系統(tǒng)能將兩個LoxP位點 之間的DNA序列刪除；hER為人雌激素受體；hpt為潮霉素抗性篩選標記基 因；ERE-Pura為雌激素反應(yīng)元件調(diào)控的尿素酶啟動子；MCS1及MCS2均為 多克隆位點。
而且，所述整合質(zhì)粒pUNFIN的LB和RB將其間的DNA序列整合到真 菌的基因組中，并能經(jīng)雌激素誘導(dǎo)，啟動子ERE-Pura激活并表達重組酶Cre， 從而去除兩個loxP位點之間的部分，篩選標記基因hpt隨之被去除，此時目 的基因啟動子使下游的結(jié)構(gòu)基因及其終止子組成型表達。
一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的構(gòu)建方法，其構(gòu)建方法 包括以下步驟
(1) .制備hER、 ERE-Pura、 hpt、多克隆位點MCS1和多克隆位點mcs2 的PCR產(chǎn)物；
(2) .用酶切連接的方法分別將質(zhì)粒pX6-GFP中的XVE替換為hER， KAN 替換為hpt， OLexA-46替換為ERE-Pura， P10-90替換為多克隆位點MCS1， GFP替換為多克隆位點MCS2;
(3) .進行PCR驗證。
一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN構(gòu)建方法在黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶 基因的敲除糖化酶高產(chǎn)工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用包括以下步驟
(1) .基因克隆根據(jù)已知黑曲霉基因組序列設(shè)計引物，克隆出黑曲霉中的 糖化酶基因序列及其啟動子及終止子；
(2) . pUNFIN-TG質(zhì)粒的構(gòu)建將糖化酶基因連接到質(zhì)粒pUNFIN中；
(3) .糖化酶基因的敲入重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，再以上述重組農(nóng)桿
菌感染黑曲霉，由此糖化酶基因和篩選標記基因被敲入，通過篩選標記來篩
選重組菌株，并用PCR進行驗證；
(4) .篩選標記的刪除加入雌激素誘導(dǎo)Cre表達，Cre和loxP位點結(jié)合， 特異性地刪除標記基因，通過負篩選法篩選出篩選標記刪除的工程菌株；
(5) .高產(chǎn)糖化酶；工程菌的篩選通過初篩和復(fù)篩，篩選出無轉(zhuǎn)苷酶、活 性、糖化酶高產(chǎn)的工程菌株。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是
本發(fā)明以工業(yè)糖化酶生產(chǎn)菌株黑曲霉為基礎(chǔ)，運用Cre/loxP定位重組系 統(tǒng)敲出轉(zhuǎn)苷酶基因，同時敲入糖化酶基因及其上游調(diào)控序列，這樣獲得的基 因工程菌株不僅不產(chǎn)轉(zhuǎn)苷酶，而且糖化酶基因的拷貝數(shù)也增加了；同時運用 發(fā)酵工程技術(shù)進行發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以提高產(chǎn)量，同時不需要去除轉(zhuǎn)苷酶這 一過程，可以有效減少糖化酶的損失，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，增強 并提升產(chǎn)品市場競爭力。


圖1為本發(fā)明無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的結(jié)構(gòu)圖2為本發(fā)明無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的核心結(jié)構(gòu)圖3為本發(fā)明無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的作用原理示意
圖4為本發(fā)明無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的構(gòu)建流程圖； 圖5為本發(fā)明黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)基因敲除糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)高產(chǎn) 工程菌的構(gòu)建流程圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明；下述實施例是說明性的，不是 限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
實施例1、無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN的構(gòu)建方法
1、設(shè)計引物PhERi、 PhER2從質(zhì)粒phERpvr4中擴增出hER， Phptl、 P—從
質(zhì)粒pAN7-l中擴增出hpt， PERE-Pural、 PERE-Pura2從質(zhì)粒pZRM2059中擴增出
ERE-Pura， PMCS1、 PMCS1，擴增多克隆位點MCS1， PMCS2、 PMCS2，擴增多 克隆位點MCS2。 (1).設(shè)計引物
P隨5， CGACGCGTCGGAATTCCAAAATTGTGATGTTTC3，酶切位
點為Mlul。
PhER2:5， TCCCCCGGGGGAGCCAGGGAGCTCTCAGACT3，酶切位點 為Smal。
Phptl: 5， TCCCCCGGGGGAATGCCTGAACTCACCGCG3， 酶切位點 為Sma'。
Phpt2: 5'TCCCCGCGGGGATCTATTCCTTTGCCCTCGG3，酶切位點為 SacII。
PERE國Pumi: 5' TCCCCGCGGGGAGGTTnTGTTCTGTGCAGTTG3'酶 切位點為SacII。
PERE-Pura2: 5， GCGGGCCCGCATGCAGTTGGACGATAGCTT3 ，酶切位點
6為- Apal。
(2). PCR擴增
a. 選用50ki1的PCR體系
Buffer 5^1 、 dNTP 4pl 上游引物4^1 下游引物4pl 模板 2^1 聚合酶 1^1 無菌水30nl y
b. 用于擴增hER的PCR條件
95 。C 5min 95 °C 45s 55°C 45s >
72 °C 90s 72 °C lOmin
c. 用于擴增hpt的PCR條件
、
乂
95 °C5min
95 °C45s 、
55 °C45s
72。C90s
72 °ClOmin
d.用于擴增ERE-Pura的PCR條件: 95 °C 5min
30 cycles
30 cycles<formula>formula see original document page 8</formula>
(3).電泳、切膠回收hER、 hpt、 ERE-Pura的PCR產(chǎn)物。
2、 合成多克隆位點
多克隆位點MCS1 (Afl m—Asc l—Aa川一Acclll—Afel—Ava I): CCACATGTGGCGCGCCGACGTCTCCGGAAGCGCTCCCGGGGG 多克隆位點MCS2 ( BssH ll—BstX l—Hae川一Funl—Mrol—Pac I): TTGGCGCGCCCAATGCATTGGGGCCAGCGCT丁CCGGATTAATTAAG G
3、 對質(zhì)粒pX6-GFP和hERPCR產(chǎn)物進行MluI/SacII雙酶切，將其中的 XVE替換為hER,然后電泳、切膠回收酶切后的質(zhì)粒pX6-GFP和hER，均 選用50|il酶切體系-
Mlul酶 2jal ^
SacII酶 2^1 緩沖液 5pl 質(zhì)粒pX6-GFP或PCR產(chǎn)物 20pil 無菌水 21^1^ 4、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。 (1).均選用10nl連接體系solutionl 5U1
質(zhì)粒pX6-GFP 1^1 hER 4pil
> 50jil 37。C 20h
1 14°C 15h
(2).熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌
a, 從-7(TC冰箱中取200^1感受態(tài)細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即 置冰上。加入質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過lOjnl)，輕輕搖勻， 冰上放置30分鐘后。
b. 42。C水浴中熱擊90秒或37。C水浴5分鐘,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-:分鐘。
c. 向管中加入lmlLB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，混勻后37'C振蕩培養(yǎng)1 小時,使細菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。
d. 將上述菌液搖勻后取lOOpl涂布于含抗生素的篩選平板上,正面向上放 置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37"C培養(yǎng)16-24小時。
5、菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子。電泳出hER基因大小條帶的菌落即為陽 性轉(zhuǎn)化子。選用20pl的PCR體系
Buffer
dNTP 30pl 上游引物4.5pl 下游引物4.5pl
聚合酶 3|Lll
15管
300|iil-^ 20^1 (每菌挑十個轉(zhuǎn)化子驗證)
無菌水 228^
6、用同樣的方法將pX6-GFP中的KAN、 OLexA-46、 P10-90和GFP分 別替換為hpt、 ERE-Pura、多克隆位點MCS1和多克隆位點MCS2，構(gòu)建出 質(zhì)粒pUNFIN。
實施例2、無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN在黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶基 因敲除糖化酶高產(chǎn)工程菌的構(gòu)建中應(yīng)用的方法，包括以下步驟 1、 CTAB法提取黑曲霉基因組
(1) .2XCTAB提取液的配制0.01mol/LTris-HCl (pH8.0), 0.02 mol/L EDTA (pH8.0)， 1.4mol/LNaCl， 2%(w/v)CTAB，臨用前65。C提前水浴，然 后再根據(jù)所用體系加2%的P -巰基乙醇。
(2) .提取步驟
a. 接入PDA液體培養(yǎng)基中28。C至有適宜的菌體量；
b. 用蒸餾水沖洗菌絲體，在液氮中研磨至粉末(白色)狀；
c. 加入0.5ml2XCTAB提取液，65。C水浴至少30 min，每隔10min輕微 顛倒離心管數(shù)次；(注意，操作要輕微，基因組易碎)
d. 冷卻至室溫后，加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，緩慢混勻， 12000rpm離心15min;
e. 吸取上清轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，再用氯仿:異戊醇(24:1)抽提一
次；
f. 吸取上清轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/LNaAc混
9勻后，再加入2倍體積的無水乙醇，小心顛倒離心管，混勻，置于-20。C沉淀 15-30min;
g.4。C、 12000rpm離心15min; h.棄上清，用70%乙醇中洗滌兩次，室溫干燥。用適量TE溶解，加入RNA 酶處理，重復(fù)乙醇沉淀，離心，干燥過程。
2、根據(jù)已報道的黑曲霉基因組序列設(shè)計引物，PCR擴增出糖化酶的啟 動子、結(jié)構(gòu)基因及終止子。
(1) .設(shè)計引物Pp^、 Ppr。2擴增糖化酶啟動子，Ptgl、 Ptg2擴增糖化酶結(jié)構(gòu)基
因及終止子。
Pprol: 5' agcttt GTTTAAAC ggcgcgccgg GGATCCGAACTCCAATCG3' 酶切位點為Pmel。
Ppr。2: 5'cgCCTGCAGGcgGGCTGAGGTGTAATGATGCTG3'酶切位點
為Sbfl。
Ptgl: 5'ccg CTCGAG cggATGTCGTTCCGATCTCTACTCG3，酵切位點
為Xhol。
Ptg2: 5'gg ACTAGTccGATATCCTCAATTCCGTCGG3，酶切位點為Spel。
(2) .PCR擴增
a. 擴增糖化酶啟動子、結(jié)構(gòu)基因及終止子均選用50^1的PCR體系。
b. 用于擴增糖化酶啟動子的PCR條件
95 °C5min
95 °C45s 、
53 。C45s>~ 30 cycles
72 °C90s
72 °ClOmin
化酶結(jié)構(gòu)基因及終止子的PCR條件:95 °C5min
95 °C45s 、
55 °C45s> 30 cycles
72°C2min
72°C30min(3).電泳、切膠回收糖化酶啟動子、結(jié)構(gòu)基因及終止子的PCR產(chǎn)物。
3、 對糖化酶啟動子的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pUNFIN進行Pmel和Sbfl雙酶 切，然后電泳、切膠回收酶切后的糖化酶啟動子和質(zhì)粒pUNFIN。
4、 連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
5、 菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子。采用20pl的PCR體系，電泳出糖化酶 啟動子基因大小條帶的菌落即為陽性轉(zhuǎn)化子。
6、 用同樣的方法將糖化酶結(jié)構(gòu)基因及終止子連接到質(zhì)粒pUNFIN的多 克隆位點MCS2，構(gòu)建出pUNFIN-TG質(zhì)粒。
7、 重組質(zhì)粒通過三親雜交的方法轉(zhuǎn)化膿桿菌株，再以上述重組膿桿菌感 染黑曲霉。因此，糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)基因和篩選標記基因被敲入，可以通過 篩選標記來篩選重組菌株，并用PCR進行驗證。
(1) .三親雜交
各取培養(yǎng)好的LBA4404、HB101(pRK2013)、E "oli DH5 a (pUNFIN-TG)3 種菌液100 U L混合入eppendrof管中，5 000 r min"離心10 min，收集菌體， 用LB培養(yǎng)基洗滌2次,再離心,收集菌體,重新懸于100 P L LB中。轉(zhuǎn)移到放 有纖維素酯的微孔濾膜(孔徑為0.45 li m)的LB平板上,28"C培養(yǎng)過夜。取一接 種環(huán)混合培養(yǎng)物,懸浮于100 u L LB中,稀釋100倍,取各稀釋液100 u L涂布于 含有Rif、 Str、 Km、 hpt的LB平板上,28。C培養(yǎng)2 d,挑取平板上的抗性單菌落 到相同的平板上。與此同時，把三種菌液分別涂布在含3種抗性的平板上。
(2) .重組膿桿菌感染黑曲霉
a. 接種轉(zhuǎn)化好的農(nóng)桿菌單菌落到5mL液體MM中(rif; kan)， 200r/min ,28 "C搖床培養(yǎng)48h。
b. 接lmL至5mL IMAS培養(yǎng)基中，200r/min、 28°C、 10-12h至OD600 為0.8-1.0。
c. 取100 y L孢子懸浮液和等體積上述膿桿菌菌液到一無菌1.5mL離心管 中，混勻。
d. 取上述混合物200 u L涂布在固體IMAS培養(yǎng)基上(已鋪有微孔濾膜)， 28。C共培養(yǎng)48h。
e. 將微孔濾膜轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上28°C, 4-7d至抗性菌落生長將抗性菌 落轉(zhuǎn)到同樣的選擇培養(yǎng)基上，進行二次篩選。
(3) . PCR驗證
采用2(^1的PCR體系，電泳出糖化酶基因大小條帶的菌落即為陽性轉(zhuǎn) 化子。
8、 將上述陽性轉(zhuǎn)化子分別轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基1 (基本培養(yǎng)基+l nM雌激 素)和誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 (基本培養(yǎng)基+10mg/l潮霉素+lnM雌激素)平板上，能夠在誘導(dǎo)培養(yǎng)基1上生長而不能在誘導(dǎo)培養(yǎng)基2上生長的菌即為無選擇標 記的工程菌株。
9、用糖化酶基因的上游引物(下游引物)和轉(zhuǎn)苷酶基因的下游引物(上 游引物)對重組黑曲霉基因組進行PCR，電泳出糖化酶基因大小條帶的菌即 為無轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)活性，糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)高產(chǎn)的工程菌株。
(1) .引物
糖化酶基因的上游引物5 ， ATGTCGTTCCGATCTCTACTCG3 ， 轉(zhuǎn)苷酶基因的下游弓l物5，TCACCATTTCAGTACCCAGTCC3,
(2) .PCR體系
采用20ili1的PCR體系。
(3) .PCR條件
<formula>formula see original document page 12</formula><110〉天津科技大學(xué)
〈120>無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
〈130〉 20081110
〈140〉 200810152913X
〈141〉 2008-11-10
〈勝 14
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211〉 33 <212> DNA <213> 引物PhERl <400〉 1
cgacgcgtcg gaattccaaa attgtgatgt ttc
<210> 2 <211> 31 〈212〉 腿 〈213〉 引物PhER2 <400〉 2
tcccccgggg gagccaggga gctctcagac t
<210> 3 〈211〉 30 〈212〉 DNA <213> 引物Phptl <400〉 3
tcccccgggg gaatgcctga actcaccgcg〈210> 4
〈211〉 31
〈212> DNA
〈213> 引物Phpt2
〈400〉 4
tccccgcggg gatctattcc tttgccctcg g 31
<210> 5
<211> 33
〈212> DNA
〈213〉 引物PERE-Pural
<400〉 5
tccccgcggg gaggtttttg ttctgtgcag ttg 33
〈210〉 6
〈211〉 30
〈212> DNA
<213> 引物PERE-Pura2
<400> 6
gcgggcccgc atgcagttgg acgatagctt 30
〈210> 7
〈211〉 42
〈212〉 廳
〈213〉 多克隆位點MCS1
〈400〉 7
ccacatgtgg cgcgccgacg tctccggaag cgctcccggg gg 42
<210> 8
<211> 47
〈212> 腿
<213〉多克隆位點MCS2〈400〉 8
ttggcgcgcc caatgcattg gggccagcgc ttccggatta attaagg 47
〈210〉 9 <211> 42 〈212〉 腿 〈213>引物Pprol 〈400〉 9
agctttgttt aaacggcgcg ccggggatcc gaactccaat eg 42
〈210〉 10 〈211〉 33 <212> ■ 〈213> 引物Ppro2 <400> 10
cgcctgcagg cgggctgagg tgtaatgatg ctg 33
<210> 11 〈211〉 34 〈212〉 DNA 〈213>引物Ptgl <400> 11
ccgctcgagc ggatgtcgtt ccgatctcta ctcg 34
〈210> 12
〈211〉 30
<212> DNA 〈213〉引物Ptg2
<400> 12
ggactagtcc gatatcctca attcegtegg 30
<210> 13<211〉 22 <212〉 ■
〈213〉糖化酶基因的上游引物 <400〉 13
atgtcgttcc gatctctact eg 22
〈210〉 14 〈211〉 22 〈212〉 DNA
〈213〉轉(zhuǎn)苷酶基因的下游引物 <400> 14
tcaccatttc agtacccagt cc 2權(quán)利要求
1、一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN，其特征在于主要結(jié)構(gòu)是RB—MSC1—LoxP—hER—hpt—ERE-Pura—Cre—LoxP—MSC2—LB。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN，其 特征在于所述整合質(zhì)粒pUNFIN的LB和RB為左臂和右臂，并能將其間 的DNA序列隨機整合到真菌的基因組中；Cre/LoxP系統(tǒng)能將兩個LoxP位點 之間的DNA序列刪除；hER為人雌激素受體；hpt為潮霉素抗性篩選標記基 因；ERE-Pura為雌激素反應(yīng)元件調(diào)控的尿素酶啟動子；MCS1及MCS2均為 多克隆位點。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN， 其特征在于所述整合質(zhì)粒pUNFIN的LB和RB將其間的DNA序列整合到 真菌的基因組中，并能經(jīng)雌激素誘導(dǎo)，啟動子ERE-Pura激活并表達重組酶 Cre，從而去除兩個loxP位點之間的部分，篩選標記基因hpt隨之被去除， 此時目的基因啟動子使下游的結(jié)構(gòu)基因及其終止子組成型表達。
4、 一種如權(quán)利要求1所述的無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN 的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括以下步驟(1) .制備hER、 ERE-Pura、 hpt、多克隆位點MCS1和多克隆位點MCS2 的PCR產(chǎn)物；(2) .用酶切連接的方法分別將質(zhì)粒pX6-GFP中的XVE替換為hER， KAN 替換為hpt， OLexA-46替換為ERE-Pura， P10-90替換為多克隆位點MCSl， GFP替換為多克隆位點MCS2;(3) .進行PCR驗證。
5、 一種如權(quán)利要求4所述的無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN 構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征在于無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN在 黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶基因的敲除糖化酶高產(chǎn)工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用包括以下步驟a).基因克隆根據(jù)已知黑曲霉基因組序列設(shè)計引物，克隆出黑曲霉中的 糖化酶基因序列及其啟動子及終止子；(2) . pUNFIN-TG質(zhì)粒的構(gòu)建將糖化酶基因連接到質(zhì)粒pUNFIN中；(3) .糖化酶基因的敲入重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株，再以上述重組農(nóng)桿 菌感染黑曲霉，由此糖化酶基因和篩選標記基因被敲入，通過篩選標記來篩 選重組菌株，并用PCR進行驗證；(4) .篩選標記的刪除加入雌激素誘導(dǎo)Cre表達，Cre和loxP位點結(jié)合， 特異性地刪除標記基因，通過負篩選法篩選出篩選標記刪除的工程菌株；(5) .高產(chǎn)糖化酶；工程菌的篩選通過初篩和復(fù)篩，篩選出無轉(zhuǎn)苷酶、活 性、糖化酶高產(chǎn)的工程菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無選擇標記真菌基因組整合質(zhì)粒pUNFIN、其構(gòu)建方法及其在黑曲霉轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)基因的敲除糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)高產(chǎn)工程菌構(gòu)建中的應(yīng)用，通過本方法所獲得的基因工程菌株無抗性選擇標記，糖化酶(轉(zhuǎn)苷酶)基因的拷貝數(shù)增加，同時不需要去除轉(zhuǎn)苷酶(糖化酶)，有效減少糖化酶的損失，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，增強并提升產(chǎn)品市場競爭力。
文檔編號C12N9/26GK101429520SQ20081015291
公開日2009年5月13日 申請日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者張俊環(huán), 濤 牛, 王春霞, 路福平, 明 黎 申請人:天津科技大學(xué)