一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及黃桿菌遺傳操作系統(tǒng)，具體涉及一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒及 應用，特別涉及一種遺傳操作系統(tǒng)在功能基因敲除和基因缺失弱毒疫苗構建過程中的具體 應用。
【背景技術】
[0002] 柱狀黃桿菌（Flavobacteriumcolumnare)是一種革蘭氏陰性細菌。該菌能夠感 染包括人工養(yǎng)殖或野生魚類在內(nèi)的幾乎所有不同生長階段的淡水魚類。該菌感染魚體后， 在感染部位呈柱狀生長，并導致魚體產(chǎn)生嚴重的鰓部潰爛、背部潰瘍和鰭條壞死等一系列 癥狀，最終引起大量死亡。由該菌所引發(fā)的疾病在在我國稱為細菌性爛鰓病，在國際上統(tǒng) 稱為柱形病。每年春末至秋初為該病的流行盛期。我國人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟魚類如草魚 (Ctenopharyngodonidellus)和繼魚（Sinipercachuatsi)每年由該病引發(fā)的死亡率 可高達100% (湖北省水生生物研宄所魚病研宄室，1975;陳昌福等，1995)。在美國，每年 由該病引起人工養(yǎng)殖斑點叉尾鮰（letaluruspunctatus)的死亡率高達90%(Shotts& Starliper, 1999；ffagneretal. , 2002)〇
[0003] 對于該病病原柱狀黃桿菌的早期研宄主要集中在診斷（Bernardetetal. , 1996 ; Baderetal., 2003)、病理和流行病學（Foott, 2002 ;Stringer_Rothetal., 2002)和 可能的防治（.Dunhametal., 2002 ;Thomas_Jinu&Goodwin, 2004)等方面。近年來， 又有學者開展了該菌的遺傳多樣性的研宄，現(xiàn)已證明該菌有三個基因組型Oarwish& Ismaiel，2005;Schneck&Caslake，2006;Wangetal.，2010)。近年來，盡管柱狀黃桿菌 的基因組序列已經(jīng)公布，研宄人員也嘗試開展可能的毒力因子和致病機理的研宄，但是尚 未取得突破性進展。這主要歸因于在該研宄領域缺乏一套適合柱狀黃桿菌的遺傳操作系 統(tǒng)。
[0004] 目前，在許多致病菌如致病性大腸桿菌、沙門氏菌、愛德華氏菌中，均有一套完善 的可用于毒力因子和致病機理研宄的遺傳操作系統(tǒng)?？赏ㄟ^缺失突變的手段對目的基因進 行敲除和功能互補，從而深入開展對目的基因的功能研宄并闡明其在細菌致病過程中所發(fā) 揮的作用。而在柱狀黃桿菌的研宄過程中，由于缺乏合適的遺傳操作系統(tǒng)，目前只能實現(xiàn)對 目的基因進行同源重組和插入失活（Starosciketal，2008;Zhangetal.，2012)，對于目 的基因進行定向敲除和功能互補一直未能取得成功。因此，也限制和阻礙了對該菌在毒力 因子、致病機理和制備毒力基因缺失弱毒疫苗的研宄。
[0005] 本發(fā)明的目的在于構建一個能夠用于黃桿菌尤其是柱狀黃桿菌目的基因的開放 閱讀框內(nèi)突變、真正實現(xiàn)目的基因的定向敲除和非極性缺失突變的質(zhì)粒，并優(yōu)化一種使用 該質(zhì)粒開展研宄的方法。從而為深入開展對該菌功能基因的研宄、闡明致病機理和制備毒 力基因缺失弱毒疫苗提供一個有利的工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒pMS75(本發(fā)明或稱自殺 質(zhì)粒）。該質(zhì)粒共由7715個堿基對組成（SEQIDNO. 1所示），其中包含了在大腸桿菌中復 制所需的復制區(qū)域和能夠正常表達的抗性基因；在柱狀黃桿菌中能夠正常表達的抗生素抗 性基因和負選擇標記基因（SEQIDN0. 2所不序列包含所述的負選擇標記基因）。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒的應用。運用本 發(fā)明所獲得的質(zhì)粒，通過將待缺失基因的上下游序列克隆至載體并導入柱狀黃桿菌，可在 該菌中發(fā)生兩次同源重組，最終實現(xiàn)對目的基因的框內(nèi)缺失突變和功能敲除。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術措施：
[0009] -種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒，制備方法包括：
[0010] (1)穿梭質(zhì)粒pCP23(Agaral et al，1997)改造為線性載體
[0011] 可通過兩種方法進行：一是將分離純化的穿梭質(zhì)粒PCP23用SacI和Kpnl進行雙 酶切，電泳結束后將大小為6103bp的片段切下，回收后即為pCP23線性載體。二是用引物 擴增穿梭質(zhì)粒PCP23的除黃桿菌復制區(qū)域以外的序列。該載體置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] (2)含負選擇標記的自殺質(zhì)粒的構建
[0013] 將SEQIDN0. 2所示核苷酸序列（含有負選擇標記基因片段）與pCP23線性載體 定向連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用氨芐青霉素的LB平板篩選目的菌落。挑取目的 菌落在氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，即得一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒 PMS75,本發(fā)明或稱為自殺質(zhì)粒，其序列為SEQIDNO. 1所示。
[0014] 一種柱狀黃桿菌基因定向敲除質(zhì)粒的應用，包括利用該質(zhì)粒定向敲除柱狀黃桿菌 的目的基因構建基因缺失株；或構建柱狀黃桿菌基因缺失弱毒疫苗。
[0015] 具體操作過程包括：
[0016] (1)確定待缺失DNA序列
[0017] 通過生物信息學分析以確定待缺失的基因的功能結構域，并初步確定待缺失的 DNA片段長度。
[0018] (2)待缺失DNA序列的上游序列選擇（本發(fā)明或稱為A片段）
[0019] 用于同源重組的待缺失DNA的上游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中目的基因開放閱讀框的第一個堿基至待缺失DNA序列之前的最后一個堿基應為3的倍 數(shù)。
[0020] (3)待缺失DNA序列的下游序列選擇（本發(fā)明或稱為B片段）
[0021] 用于同源重組的待缺失DNA的下游序列需大于或等于1.8kb且小于或等于2.5kb， 其中待缺失DNA序列之后的第一個堿基至目的基因開放閱讀框的最后一個堿基應為3的倍 數(shù)。
[0022] (4)將待缺失DNA區(qū)域的上下游序列克隆至含負選擇標記的自殺質(zhì)粒
[0023] 通過酶切連接法將待缺失DNA序列的上下游序列（A、B片段）克隆至自殺質(zhì)粒。
[0024] 具體的，將A、B片段克隆至自殺質(zhì)粒的方法包括：PCR方法擴增A片段時，在A片段 的正反向引物上各引入一個酶切位點，這兩個酶切位點應不相同；在擴增B片段時，在B片 段的正反向引物上也分別引入一個酶切位點，其中B片段的正向引物的酶切位點應與A片 段反向引物的酶切位點相同。通過酶切連接的方法將A或B片段通過酶切、連接的方法連 入自殺質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將篩選得到的陽性克隆提取質(zhì)粒后，同法將B或A片段連入 該質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過氨芐青霉素平板篩選和PCR檢測確定含A、B片 段的自殺質(zhì)粒的大腸桿菌陽性菌株。將該大腸桿菌菌株大量培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒即可得到含 待缺失DNA上下游同源序列的自殺質(zhì)粒。
[0025] (5)將含待缺失DNA序列上下游同源序列的自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入柱狀黃桿菌
[0026] 將上一步提取到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到能夠進行接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌（Escherichia coli)菌株如SM10或S17-1A中。將該含該質(zhì)粒的大腸桿菌菌株與柱狀黃桿菌等體積培養(yǎng) 至對數(shù)生長早期，離心收集菌體。用Shieh培養(yǎng)基將兩種菌體分別洗滌兩次后混合重懸，懸 液滴至預先鋪有滅菌NC膜的Shieh平板上。將該平板在28°C靜置培養(yǎng)20-24h。
[0027] (6)篩選在柱狀黃桿菌中發(fā)生第一次同源重組的菌株
[0028] 將完成接合轉(zhuǎn)移的細菌混合物從NC膜上刮下來，并用不含抗生素的Shieh培養(yǎng)基 重懸。懸液涂布含抗生素的Shieh平板，28°C靜置培養(yǎng)至有菌落長出。此時長出的菌落即 為發(fā)生第一次同源重組后的菌株。
[0029] (7)篩選在柱狀黃桿菌中發(fā)生第二次同源重組的菌株
[0030] 將發(fā)生第一次同源重組的菌株在無抗生素的Shieh液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生 長期，用該菌液涂布含10%蔗糖的Shieh平板。待菌落長出后，挑選單菌落培養(yǎng)至對數(shù)生長 期。將該培養(yǎng)物分別在含四環(huán)素和不含四環(huán)素的平板上劃線培養(yǎng)。在兩種平板上都能生長 的菌株丟棄；將只能在不含四環(huán)素的Shieh平板上生長的該菌株保留供進一步篩選。
[0031] (8)缺失突變株篩選和確認
[0032] 用待缺失DNA區(qū)域的序列為模板設計引物，菌液PCR方法擴增發(fā)生同源重組的菌 株，如果擴增到目的條帶，表明該菌株回復野生型，應丟棄；如果未能擴增到目的條帶，表明 該菌株可能已發(fā)生缺失突變，保留該菌株供進一步檢測和確認。
[0033] 用待缺失DN