溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts4及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域中溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts4及其應用。
【背景技術】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術，送進受體細胞中去進行復制和表 達的工具叫載體（Vector)。質粒是重組DNA技術中常用的載體，質粒存在于許多細菌以及 酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子。一個理想的載體 大致應有下列一些特性：（1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；（2)具有多種常用的限制性內 切酶的單切點；（3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標記，便于鑒定和篩選；（5) 對宿主細胞無害。
[0003] 寬宿主質粒pBBRlMCS-2是應用性很廣的載體，該質粒由pBBRl質粒改造而來。 pBBRl質粒來源于革蘭氏陰性菌BordetellabronchisepticaS87(AntoineRandLocht C.Isolationandmolecularcharacterizationofanovelbroad-host-rangeplasmid fromBordetellabronchisepticawithsequencesimilaritiestoplasmidsfrom Gram-positiveorganisms.MolMicrobiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 個卡那霉素（kan)抗性篩選標記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質粒適用于DNA克 隆、蛋白表達，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。
[0004] 溫度敏感型質粒載體可以方便的控制質粒在宿主中的存在。當溫度比較低時，質 ?？梢源嬖谒拗髦校敎囟忍岣吆?，溫度敏感型質粒載體將丟失或整合到染色體上。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何構建溫度敏感型載體。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了構建重組載體的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的構建重組載體的方法，是將SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示 的DNA片段替換為目的基因表達盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不變，得到的重組 DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBRlMCS-2-Ts3;
[0008] 所述目的基因表達盒編碼的蛋白質為將SEQIDNo. 2所示的蛋白質進行A4)的改 造、保持SEQIDNo.2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質得到的蛋白質，即所述目的基 因表達盒編碼的蛋白質為SEQIDNo. 10所示的蛋白質；所述A4)為如下A41)和/或A42):
[0009]A41)將 SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys 突變?yōu)镚lu;
[0010] A42)將 SEQIDNo. 2 第 146 位的lie突變?yōu)閂al。
[0011] 上述方法中，所述目的基因表達盒中的目的基因為將SEQIDNo. 1的第1794-2456 位核苷酸所示的DNA分子進行B4)的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；所述B4)為如下B41)和/或M2):
[0012] B41)將 SEQIDNo. 1 第 1866 位的A 突變?yōu)镚;
[0013] B42)將 SEQIDNo. 1 第 2229 位的A 突變?yōu)镚。
[0014] 其中，SEQIDNo. 1由5145個核苷酸組成，SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸 為rep的編碼基因，編碼SEQIDNo. 2所示的rep蛋白。
[0015] 上述方法中，所述目的基因表達盒的序列可為SEQIDNo. 9。
[0016] 其中，SEQIDNo. 9的第238-900位編碼SEQIDNo. 10所示的蛋白質。
[0017] 上述方法中，所述目的基因表達盒中啟動所述目的基因表達的啟動子為將SEQID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的改 造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得 到的DNA分子：
[0018] C2)如下C21)和 / 或C22):
[0019] C21)將 SEQIDNo. 1 第 1732 位的 A突變?yōu)镚 ;
[0020] C22)將 SEQIDNo. 1 第 1780 位的 G突變?yōu)門 ;
[0021] C3)如下C31)和 / 或C32):
[0022] C31)將 SEQIDNo. 1 第 1747 位的 C突變?yōu)門 ;
[0023]C32)將 SEQID No. 1第 1776 位的 T突變?yōu)锳;
[0024] C4)將SEQIDNo. 1 第 1751 位的T突變?yōu)锳;
[0025] 所述目的基因表達盒中終止所述目的基因表達的終止子為SEQIDNo.1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0026] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了由所述方法構建的重組載體。
[0027] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了含有所述重組載體的重組微生物或重組細 胞系。
[0028] 所述重組微生物具體可為細菌、酵母、藻和真菌。其中，所述細菌可為大腸桿 菌或類球紅細菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌 EscherichiacoliDH5a、大腸桿菌EscherichiacoliBW25113 或大腸桿菌Escherichia coliS17-1。所述類球紅細菌具體可為類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。
[0029] 所述重組細胞系不包括繁殖材料。
[0030] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質。
[0031] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述目的基因。
[0032] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了DNA分子。
[0033] 本發(fā)明所提供的DNA分子，為將SEQIDNo.1的第1557-1793位所示的DNA分子 進行所述C4)的改造、保持SEQIDNo.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其 它核苷酸均不變得到的DNA分子。
[0034] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述目的基因或所述DNA分子在制備溫度 敏感載體中的應用。
[0035] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述任一應用：
[0036] L1、所述DNA分子在作為啟動子中的應用；
[0037] L2、所述重組載體在作為溫度敏感載體中的應用。
[0038]上述L2所述應用可為所述重組載體在大腸桿菌或類球紅細菌中作為溫度敏 感載體中的應用。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌 EscherichiacoliDH5a、大腸桿菌EscherichiacoliBW25113 或大腸桿菌Escherichia coliS17-1。所述類球紅細菌具體可為類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1。
[0039] 本申請中，所述溫度敏感載體為所述載體在一定溫度下可存在于宿主中，而改變 溫度后，所述載體不能存在于所述宿主中。具體可為所述載體在30°C下可存在于宿主中，當 溫度為37°C-42°C時，所述載體不能存在于所述宿主中。
[0040] 實驗證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts4為溫度敏感載體：在宿主菌 分別為大腸桿菌EscherichiacoliT1、大腸桿菌EscherichiacoliDH5a、大腸桿 菌EscherichiacoliBW25113 和大腸桿菌EscherichiacoliS17-1 時，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts4在30°CLB液體培養(yǎng)基和30°CLB+kan液體培養(yǎng)基中的丟失率以及 pBBRlMCS-2在42°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在10%以下，而pBBRlMCS-2-Ts4在42°CLB 液體培養(yǎng)基中的丟失率均達到99. 99%;在宿主菌為類球紅細菌Rhodobactersphaeroides 2. 4. 1 時，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts4 在 30°CLB液體培養(yǎng)基和 30°CLB+kan液體培 養(yǎng)基中的丟失率以及PBBR1MCS-2在37°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Ts4在37°CLB液體培養(yǎng)基中的丟失率均達到78. 57%。
[0041] 實驗證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts4為溫度敏感載體可應用于：（1)載 體消除，即通過提高溫度移去載體；（2)單交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA整合 到染色體的同源區(qū)域；（3)雙交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA替換染色體上一 段DNA。
【附圖說明】
[0042] 圖 1 為pBBRlMCS-2 的圖譜。
【具體實施方式】
[0043] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0044] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實施例中的寬宿主載體pBBRlMCS-2為Biovector中國質粒載體菌株細胞株 基因保藏中心產品。
[0047] 下述實施例中的大腸桿菌Escherichia coli T1為北京全式金生物技術有限公司 產品，目錄號為CD501-01。
[0048] 下述實施例中的大腸桿菌EscherichiacoliDH5a為寶生物工程（大連）有限 公司，目錄號為9057。
[0049] 下述實施例中的大腸桿菌EscherichiacoliBW25113為Biovector中國質粒載 體菌株細胞株基因保藏中心產品。
[0050] 下述實施例中的大腸桿菌EscherichiacoliS17-1為Biovector中國質粒載體 菌株細胞株基因保藏中心產品。
[0051] 下述實施例中的類球紅細菌Rhodobactersphaeroides2. 4. 1為美國模式菌種收 集中心（ATCC)產品，菌株號為17023。
[0052] 下述實施例中的Sistrom培養(yǎng)基在文獻（SistromWR.Thekineticsof the synthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Gen. Microbiol. 1962. 28:607-616)中報道過。
[0053] 下述實施例中的LB液體培養(yǎng)基為由溶質和溶劑組成無菌培養(yǎng)基，溶劑為水，溶質