溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts3及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中溫度敏感型載體PBBR1MCS-2-TS3及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行復(fù)制和表 達(dá)的工具叫載體（Vector)。質(zhì)粒是重組DNA技術(shù)中常用的載體，質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌以及 酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。一個(gè)理想的載體 大致應(yīng)有下列一些特性：（1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；（2)具有多種常用的限制性內(nèi) 切酶的單切點(diǎn)；（3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標(biāo)記，便于鑒定和篩選；（5) 對(duì)宿主細(xì)胞無害。
[0003] 寬宿主質(zhì)粒pBBRlMCS-2是應(yīng)用性很廣的載體，該質(zhì)粒由pBBRl質(zhì)粒改造而來。 pBBRl 質(zhì)粒來源于革蘭氏陰性菌 Bordetella bronchiseptica S87 (Antoine R and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms. Mol Microbiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 個(gè)卡那霉素（kan)抗性篩選標(biāo)記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質(zhì)粒適用于DNA克 隆、蛋白表達(dá)，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。
[0004] 溫度敏感型質(zhì)粒載體可以方便的控制質(zhì)粒在宿主中的存在。當(dāng)溫度比較低時(shí)，質(zhì) ?？梢源嬖谒拗髦?，而當(dāng)溫度提高后，溫度敏感型質(zhì)粒載體將丟失或整合到染色體上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何構(gòu)建溫度敏感型載體。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了構(gòu)建重組載體的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組載體的方法，為構(gòu)建重組載體的方法1，是將SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達(dá)盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBRlMCS-2-Ts3 ;
[0008] 所述目的基因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質(zhì)進(jìn)行A3)的改 造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質(zhì)得到的蛋白質(zhì)，即所述目的 基因表達(dá)盒編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID No. 8所示的蛋白質(zhì)；A3)為將SEQ ID No. 2第86位的 Arg突變?yōu)镃ys。
[0009] 上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒中的目的基因?yàn)閷EQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進(jìn)行B3)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位 核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；B3)為將SEQ ID No. 1第 2049位的C突變?yōu)門。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由5145個(gè)核苷酸組成，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸 為rep的編碼基因，編碼SEQ ID No. 2所示的rep蛋白。
[0011] 上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒的序列可為SEQ ID No. 7。
[0012] 其中，SEQ ID No. 7的第238-900位編碼SEQ ID No. 8所示的蛋白質(zhì)。
[0013] 上述方法1中，所述目的基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進(jìn)行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的 改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變 得到的DNA分子：
[0014] C2)如下 C21)和 / 或 C22):
[0015] C21)將 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突變?yōu)?G ;
[0016] C22)將 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突變?yōu)?T ;
[0017] C3)如下 C31)和 / 或 C32):
[0018] C31)將 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突變?yōu)?T ;
[0019] C32)將 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突變?yōu)?A ;
[0020] C4)將 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突變?yōu)?A ;
[0021] 所述目的基因表達(dá)盒中終止所述目的基因表達(dá)的終止子為SEQ ID No. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0022] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了構(gòu)建重組載體的方法。
[0023] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組載體的方法，為構(gòu)建重組載體的方法2,是將SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達(dá)盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體；
[0024] 所述基因表達(dá)盒中的基因編碼的蛋白質(zhì)為將SEQ ID No. 2所不的蛋白質(zhì)進(jìn)行所述 A3)和下述A4)的改造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質(zhì)得到的蛋 白質(zhì)：
[0025] A4)如下 A41)和 / 或 A42):
[0026] A41)將 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突變?yōu)?Glu ;
[0027] A42)將 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突變?yōu)?Val。
[0028] 上述方法2中，所述目的基因表達(dá)盒中的目的基因?yàn)閷EQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進(jìn)行所述B3)和下述M)的改造、保持SEQ ID No. 1的 第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子：
[0029] B4)如下 B41)和 / 或 B42):
[0030] B41)將 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突變?yōu)?G ;
[0031] B42)將 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突變?yōu)?G。
[0032] 上述方法2中，所述目的基因表達(dá)盒中啟動(dòng)所述目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進(jìn)行所述C2)、所述C3)和所述C4)這三種中至 少一種的改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷 酸均不變得到的DNA分子；
[0033] 所述基因表達(dá)盒中終止所述基因表達(dá)的終止子為SEQ ID No. 1的第2457-2526位 所示的DNA分子。
[0034] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了由所述方法1或所述方法2構(gòu)建的重組載 體。
[0035] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有所述重組載體的重組微生物或重組細(xì) 胞系。
[0036] 所述重組微生物具體可為細(xì)菌、酵母、藻和真菌。其中，所述細(xì)菌可為大腸桿 菌或類球紅細(xì)菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌 Escherichia coli DH5a、大腸桿菌 Escherichia coli BW25113 或大腸桿菌 Escherichia coli S17-1。所述類球紅細(xì)菌具體可為類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0037] 所述重組細(xì)胞系不包括繁殖材料。
[0038] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一產(chǎn)品：
[0039] Pl、所述蛋白質(zhì)；
[0040] P2、所述目的基因；
[0041] P3、DNA分子，為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進(jìn)行所述C3) 或下述Z34)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它 核苷酸均不變得到的DNA分子；
[0042] Z34)為所述C3)和所述C4)。
[0043] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0044] L1、所述目的基因或所述DNA分子在制備溫度敏感載體中的應(yīng)用；
[0045] L2、所述DNA分子在作為啟動(dòng)子中的應(yīng)用；
[0046] L3、所述重組載體在作為溫度敏感載體中的應(yīng)用。
[0047] 上述L3所述應(yīng)用可為所述重組載體在大腸桿菌或類球紅細(xì)菌中作為溫度敏 感載體中的應(yīng)用。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌 Escherichia coli DH5a、大腸桿菌 Escherichia coli BW25113 或大腸桿菌 Escherichia coli S17-1。所述類球紅細(xì)菌具體可為類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0048] 本申請(qǐng)中，所述溫度敏感載體為所述載體在一定溫度下可存在于宿主中，而改變 溫度后，所述載體不能存在于所述宿主中。具體可為所述載體在30°C下可存在于宿主中，當(dāng) 溫度為37°C -42°C時(shí)，所述載體不能存在于所述宿主中。
[0049] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts3為溫度敏感載體：在宿主菌 分別為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌Escherichia coli DH5a、大腸桿 菌 Escherichia coli BW25113 和大腸桿菌 Escherichia coli S17-1 時(shí)，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts3在30°C LB液體培養(yǎng)基和30°C LB+kan液體培養(yǎng)基中的丟失率以及 pBBRlMCS-2在42°C LB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在10%以下，而pBBRlMCS-2-Ts3在42°C LB 液體培養(yǎng)基中的丟失率均達(dá)到99. 99%;在宿主菌為類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1 時(shí)，pBBRlMCS-2 和 pBBRlMCS-2-Ts3 在 30°C LB 液體培養(yǎng)基和 30°C LB+kan 液體培 養(yǎng)基中的丟失率以及PBBR1MCS-2在37°C LB液體培養(yǎng)基中的丟失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Ts3在37°C LB液體培養(yǎng)基中的丟失率均達(dá)到80. 53%。
[0050] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts3為溫度敏感載體可應(yīng)用于：（1)載 體消除，即通過提高溫度移去載體；（2)單交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA整合 到染色體的同源區(qū)域；（3)雙交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA替換染色體上一 段 DNA。
【附圖說明】
[0051] 圖 1 為 pBBRlMCS-2 的圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0052] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0053] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0054] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055] 下述實(shí)施例中的寬宿主載體pBBRlMCS-2為Biovector中國質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株 基因保藏中心產(chǎn)品。
[0056] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌Escherichia coli Tl為北京全式金生物技術(shù)有限公司 產(chǎn)品，目錄號(hào)為CD501-01。
[0057] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌Escherichia coli