構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步驟：（1）制備同源重組載體：（2）ES細胞打靶及篩選；（3）重組干細胞PCR鑒定；（4）嵌合小鼠制備：PCR鑒定獲得同源重組克隆后，將正確同源重組的ES細胞通過囊胚腔注射獲得嵌合體子代；（5）F1代雜合小鼠Kv1.3+/-繁育。此外，本發(fā)明還公開了用于構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kv1.3基因敲除小鼠模型的PCR引物對。
【專利說明】構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kv1.3基因敲除小鼠 模型的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物和醫(yī)學實驗模型的制備技術和細胞構建領域。涉及一種構建與心 肌保護相關的線粒體鉀通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法。

【背景技術】
[0002] 與其它器官相比，缺血/再灌注（I/R)對心臟產(chǎn)生的損傷更迅速更嚴重。心肌細 胞更易出現(xiàn)自由基增多和供能障礙。線粒體早期即出現(xiàn)明顯損傷，顯微鏡下見心肌、冠脈平 滑肌和內皮細胞病變，尤其是線粒體病變。表現(xiàn)為無復流(器官水平的血管痙攣）和心臟失 功?？v觀已知研究結果，線粒體供能障礙、鈣鉀異常導致凋亡啟動和正反饋甚至結構破壞是 主要環(huán)節(jié)。目前鉀通道與心臟保護關系開始成為研究熱點。國內外研究發(fā)現(xiàn)K ATP鉀通道在 缺血預處理中發(fā)揮作用，與心肌保護的關系是肯定的。在我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，阿片受 體激動劑預處理可以產(chǎn)生明顯的心肌保護作用，并且這些作用和線粒體K ATP通道有關（劉 中民，2008)，為進一步探討鉀通道藥物用于心肌保護提供了實驗依據(jù)。隨著研究的展開，我 們發(fā)現(xiàn)，心肌損傷和線粒體Kvl. 3鉀通道關系密切，值得深入研究，其中要著重探索以下主 要方面的問題。
[0003] 哺乳動物細胞線粒體內已知存在兩種涉及調節(jié)鉀內流的鉀通道，KATP和Bkca。淋 巴細胞內線粒體內已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在Kvl. 3鉀通道。心肌內線粒體是否存在Kvl. 3鉀通道對研 究心肌保護至關重要。本發(fā)明涉及該領域。
[0004] 心肌損傷時線粒體Kvl. 3鉀通道的重要性和機制需著重研究：
[0005] 首先，與已知有保護作用的兩個線粒體鉀通道（KATP、Bkca)比較，線粒體Kvl. 3在 心肌損傷中的地位如何？其次，如果關系很重要，這種影響對心肌細胞的影響是否超過對 內皮和冠脈平滑肌的影響？最后，涉及機制方面的研究，該通道的下游信號通道如何，和鄰 近分子的相互作用有那些可以進一步了解？線粒體Kvl. 3與心肌損傷關系問題、只有這些 問題有所了解，才能明確線粒體Kvl. 3與心肌損傷的關系。
[0006] Kvl. 3通道是否在心肌中有表達，它們和MI/RI是否有關？抑或和其它通道協(xié)同 作用尚不清楚，對這些通道的進一步研究將為MI/RI的防治以及藥物的開發(fā)奠定基礎。為 此，我們構建了 Kvl. 3基因敲除小鼠。在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠心房組織表達Kir3. 4 明顯高于其他組織，而Kvl. 3不僅在心房組織有表達，在心室心肌中表達更明顯。心臟三種 實質細胞均見免疫標記的呈現(xiàn)。Kvl. 3基因敲除后，小鼠表現(xiàn)能量代謝顯著變化和抗肥胖、 體型突變等表現(xiàn)。并且引起外周細胞對胰島素增敏效應(表現(xiàn)為脂肪、骨胳肌細胞膜的葡萄 糖轉運蛋白增加，糖攝取增加)。該通道在依賴胰島素的組織普遍表達。心肌是依賴胰島素 的組織，該通道心肌細胞內的詳細定位和作用缺乏研究。
[0007] 對自發(fā)商血壓鼠血管的基因表達研究提不，Kvl. 3與血管張力過商?切有關。血 管平滑肌Kvl. 3通道是否在心臟I/R中產(chǎn)生痙攣致使無復流值得研究。最近還發(fā)現(xiàn)，腦組 織內皮細胞也表達Kvl、2鉀通道，Kvl. 3參與內皮細胞膜電位平衡作用，其阻斷劑對I/R防 止有重要意義。Kvl. 3基因在各種組織的表達提示存在廣泛型和差異性。在心臟組織中，成 肌細胞以及成纖維細胞均表達Kvl. 3通道，并且與成肌細胞間以及成纖維細胞和心肌細胞 之間的偶聯(lián)有關，同時涉及到鈣依賴基因的編程。而此前的文獻報道，一些組織的纖維細胞 表面不表達該基因。這些差異有什么生理意義不知道。
[0008] 由此，啟發(fā)考查心臟三種實質細胞(心肌、血管平滑肌、內皮）內、線粒體內的 Kvl. 3的變化與心肌保護存在的一定關系。目前尚缺乏這方面的研究。因此有必要進一步 研究心臟不同細胞該基因的生理病理情況下的表達規(guī)律。
[0009] 線粒體KV1. 3通道在心肌不同細胞的表達及作用可用通道藥物組合干預：
[0010]目前發(fā)現(xiàn)線粒體存在的鉀通道KATP和BKca都有保護心肌損傷的作用。"線粒體滲 透轉換孔"被活性氧（R0S)激活而大量通透啟動凋亡甚至腫脹破裂。KATP的通道開放有利于 減輕該過程，保護心肌。此外，文獻報道線粒體內膜上鈣依賴鉀通道Bkca也和損傷的保護 有關系。"線粒體滲透轉換孔"的阻斷(環(huán)孢素等）也可能對心肌保護有作用。"線粒體滲透 轉換孔"直接涉及線粒體的膜完整性維持，直接與細胞的壞死和凋亡有關。研究淋巴細胞 的發(fā)育歷程發(fā)現(xiàn)，線粒體內除了存在K ATP和Bkca，還有Kvl. 3三種鉀通道。它們和線粒體的 鉀濃度、線粒體容積、內膜電位、凋亡有關。T淋巴細胞發(fā)育和轉變記憶細胞時候，人們觀察 到Kvl. 3鉀通道分布于淋巴細胞膜，能夠調節(jié)淋巴細胞激活、增殖、分化和細胞因子分泌， 是免疫調節(jié)的靶點。在T淋巴細胞線粒體內膜上的Kvl. 3分子通道對細胞的抗凋亡有重要 作用。K通道的失敏也與缺氧反應和電傳導功能有密切關系。我們前期預實驗也發(fā)現(xiàn)心肌 內存在Kvl. 3通道蛋白。該蛋白是否直接和心肌損傷機理存在聯(lián)系尚未知。由于線粒體內 有KATP和Kvl. 3、Bkca三種鉀通道，共同的作用都是釋放鉀到線粒體內。三者的肽片段感受 器不同，三者的作用不同，下游信號通路不一樣。而三者在心肌線粒體內的神秘關系有待揭 示。故提出整體研究方案，在基因敲除鼠等模型和活體、器官、細胞、信號通路等不同層面上 用三種鉀通道各自特異阻斷劑和開放劑經(jīng)不同組合干預，統(tǒng)計分析分離因素，從而了解不 同的鉀通道在抗損傷的作用。
[0011] 深入研究線粒體Kvl. 3通道參與細胞凋亡、能量代謝的信號通路：
[0012] 目前，鉀通道和心肌保護關系研究已經(jīng)發(fā)展到能夠了解通道下游分子信號聯(lián)系及 其損傷預防設計的層面。線粒體內三種鉀通道下游分子聯(lián)系開始引起關注。這從其它細胞 的研究發(fā)現(xiàn)可以啟發(fā)心肌細胞該通道下游信號通路研究的思路，對下一步研究該通道在心 肌保護時的作用尤其對線粒體鉀通道研究提供了有效的研究思路和手段。（1)在研究淋巴 細胞的該分子部分通路已了解。（2)神經(jīng)元的該分子部分通路已了解。（3)本研究組前期 已經(jīng)開展了心臟表達文庫(美國進口文庫)_酵母雙雜交篩選(鉀通道下游）預實驗，實驗完 成可以指導下一步探索研究心肌細胞Kvl. 3通道下游信號通路明確方向。這些理論和實驗 都為研究信號通路提供了可行性。目前，單通道基因敲除模型小鼠的制備為這類研究提供 了很好的平臺。
[0013] 綜上所述，發(fā)明背景有以下幾點：①在臨床實踐中，MI/RI仍然是威脅高齡、危重 心臟病人治療效果的高危因素，需進一步探討MI/RI的防治方法；②心肌缺血/再灌注損傷 時心肌保護和線粒體損傷程度及鉀離子通道有關，例如K ATP、Bkca。T細胞Kvl. 3鉀通道與 線粒體的鉀濃度、線粒體容積、內膜電位、能量代謝以及凋亡有關。③前期研究發(fā)現(xiàn)腦組織 線粒體Kvl. 3通道參與缺血再灌注損傷。我們研究發(fā)現(xiàn)，Kvl. 3不僅在心房組織有表達，在 心室心肌中表達更明顯。④推測心臟三種實質細胞內、線粒體內的Kvl. 3的變化與心肌保 護可能存在一定關系。
[0014] 根據(jù)心肌內存在Kvl. 3通道的前期結果以及掌握足夠特異的通道藥物，在已構建 的Kvl. 3通道基因敲除小鼠模型上做細胞內、外兩種Kvl. 3通道特異阻斷，組合另外兩種線 粒體通道的特異開放、阻斷不同組合干預，可以區(qū)分出線粒體Kvl. 3鉀通道在心肌保護中 的作用。結合力學電學和生化免疫學研究，探索線粒體鉀通道之間的聯(lián)系及心肌和內皮細 胞的損傷程度。并深入研究線粒體Kvl. 3通道參與細胞凋亡、能量代謝的信號通路及其機 制。研究結果為臨床治療提供鉀通道藥物治療和保護心肌的理論基礎，將為臨床治療心衰 提供心肌保護新的途徑。


【發(fā)明內容】

[0015] 本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道 Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法。
[0016] 本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種用于構建與心肌保護相關的線粒體鉀 通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的PCR引物對。
[0017] 具體而言，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種構建與心肌保護相關的線粒體鉀通 道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法，包括如下步驟：
[0018] (1)制備同源重組載體：
[0019] (2) ES細胞打靶及篩選；
[0020] (3)重組干細胞PCR鑒定；
[0021] (4)嵌合小鼠制備：PCR鑒定獲得同源重組克隆后，將正確同源重組的ES細胞通過 囊胚腔注射獲得嵌合體子代；
[0022] (5) F1代雜合小鼠Kvl. 3+/_繁育。
[0023] 作為優(yōu)選的技術方案，步驟（1)具體為：打靶載體使用BAC載體，構建好的質粒用 BanmHI、EcoRI、HindllI酶切，產(chǎn)物電泳照相后鑒定條帶。
[0024] 作為優(yōu)選的技術方案，步驟（2)為：將打靶載體電擊轉化胚胎干細胞，使其與基因 組發(fā)生同源重組。
[0025] 作為優(yōu)選的技術方案，在步驟（3)中，設計如下PCR引物對：P1 : 如 SEQ ID N0. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID N0. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示；P1 和 P2 為一對引物，P3 和 P4 為一對引 物。
[0026] 作為優(yōu)選的技術方案，在步驟（3)中，所述PCR反應條件為：94°C 30s ;67°C 30s ; 72°C 5min ;35 個循環(huán)。
[0027] 作為優(yōu)選的技術方案，步驟（4)中，注射用囊胚采自C57BL/6J近交系小鼠，通過超 數(shù)排卵，自然受孕，胚胎體內發(fā)育至囊胚階段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受體子宮， 假孕受體為C57BL/6J( 6 )與CBA (早）的雜交一代，生育出嵌合率大于50%的嵌合雄鼠。
[0028] 作為優(yōu)選的技術方案，步驟（5)中，將嵌合率大于50 %的成熟小鼠與野生型 C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定，用PCR方法 鑒定基因型，用普通酶短片段PCR擴增法，PCR陽性產(chǎn)物用T載體連接后轉化進大腸桿菌， 電泳結果判斷野生型、雜合子或純合子，產(chǎn)物用T4連接酶連到pMD18T載體，轉化進大腸桿 菌篩選，煮菌PCR初步鑒定后，送測序鑒定。
[0029] 在本發(fā)明的第二方面，提供了用于構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kvl. 3基 因敲除小鼠模型的PCR引物對，采用以下兩對引物對：P1和P2引物對，P3和P4為引物對； PI :ATGAAACCATTCACATAGCCT AAACAG，如 SEQ ID NO. 1 所示；P2 :CCTCCCCCGTGCCTTCCTTG AdnSEQIDN0.2m*;P3:GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGTjnSEQIDN0.3m* ;P4: CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGAjnSEQIDN0.4K*。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于，本模型可以通過建立和應用基因敲除和野生型小鼠心肌 缺血再灌注損傷模型方法，分別在整體水平、細胞水平、亞細胞水平以及離子單通道水平深 入探討Kvl. 3在心肌保護中的作用和機制，并與KATP、Bkca鉀通道心肌保護效果比較，試圖 揭示實質細胞中線粒體內Kvl. 3、KATP、Bkca通道與MI/RI之間的科學聯(lián)系。小鼠Kvl. 3鉀 通道分子的敲除系制備有一定難度，其檢測尤其困難，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術的難題，提供 了一種構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法及涉及PCR檢 測引物和特定測定方法。
[0031] 傳統(tǒng)基因打靶小鼠的建系多使用小質粒和DNA雜交等方法構建和鑒定。本實驗使 用BAC載體和PCR加測序鑒定獲得同樣效果。用同源重組方法敲除ES干細胞的靶基因，經(jīng) 過嵌合體、雜交生殖繁育工程和篩選鑒定，初步獲得Kvl. 3基因敲除鼠。改進方法產(chǎn)生的首 建鼠尾組織DNA鑒定證實該方法也能獲得敲除小鼠個體群。敲除小鼠個體特征符合國外文 獻報道的個體特征。盡管尚需要進一步生化鑒定和進一步繁育回交到C57近交系才能獲 得穩(wěn)定種群，但是，快速獲得首建的方法經(jīng)過基因檢測初步獲得證實，方法值得應用。該小 鼠的繁育成功，為建立了穩(wěn)定的鉀離子通道病研究模型和先進的研究方法，對心肌保護的 病理生理機制等打下了基礎。小鼠基因Kvl. 3又叫Kcna3,是電壓依賴性鉀通道。2005年 Ildik Szab發(fā)現(xiàn)淋巴細胞的線粒體中的Kvl. 3通道和免疫細胞的進化發(fā)育以及功能密切 相關，是T淋巴細胞細胞膜的主要鉀通道。電鏡和免疫組化研究顯示定位在線粒體膜上。 研究發(fā)現(xiàn)Kvl. 3基因的分子高表達在自身免疫病人的記憶T和M細胞上，提示和免疫疾病 也存在很大關系。有報道稱，該鉀通道甚至與癌癥也有關系。最近還有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體 的鉀通道中，Kvl. 3分子在細胞凋亡途徑中是重要的成份。線粒體去極化并釋放細胞凋亡 標記蛋白CYTC與Kvl. 3鉀通道有關。另有文獻討論，Kvl. 3與能量代謝和體重調節(jié)有關， 用藥物阻斷該通道可以調節(jié)能量代謝[1°]。心肌損傷與線粒體早期受損以及能量代謝有著 不可分割的聯(lián)系。開展該模型的研究，對心肌保護研究將提供有益的先進模型。該分子敲 除后動物主要大體表現(xiàn)主要有體重減小很明顯，生成超級小體重鼠 [11]。味蕾細胞膜的該分 子作用可能是主要原因之一。該分子剔除后還表現(xiàn)陰離子通道代謝性表達增強[12]。它對 細胞的胰島素敏感性這個涉及能量代謝的環(huán)節(jié)也存在調節(jié)作用 [13，14]。總之，該模型的建 立，為研究免疫、細胞調亡、心肌保護等和線粒體鉀通道的關系甚至研究代謝綜合癥提供了 一種新的方法。
[0032] 以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是， 這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā) 明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是本發(fā)明實施例1的小鼠Kcna3基因敲除示意圖。
[0034] 圖2是本發(fā)明實施例1的小鼠Kcna3基因打靶載體示意圖。
[0035] 圖3是本發(fā)明實施例1的小鼠Kcna3基因打靶質粒限制性內切酶鑒定電泳圖譜。
[0036] 圖4A和圖4B是本發(fā)明實施例1的小鼠129胚胎干細胞基因打靶藥物篩選后PCR 鑒定瓊脂糖電泳結果示意圖，其中，圖4A見4. 8kbp為陽性條帶，圖4B見4. 2kbp為陽性條 帶。
[0037] 圖5是本發(fā)明實施例2中顯微鏡示意圖；
[0038] 圖6是本發(fā)明實施例2中C57新生（2d)小鼠原代心肌細胞培養(yǎng)爬片上見四種主 要功能細胞(心肌細胞、冠脈內皮細胞、冠脈平滑肌細胞、傳導(大核）細胞）的Kvl. 3鉀通道 免疫染色示意圖（200X)。

【具體實施方式】
[0039] 以下通過具體的實施例進行示例，其中所用試劑均可通過市場渠道購買，如有未 盡之處，可以參考相應的PCR和基因測序的實驗手冊。
[0040] 實施例1
[0041] 1. Kvl. 3基因敲除小鼠的制備：
[0042] 1. 1?制備同源重組載體
[0043] 設計和構思基因組中對Kcna3的打祀原理。Kcna3打祀載體使用BAC (Geneserve Co，U.K.)載體（BAC:bMQ42P18)。參照文獻（Otani H.The role of nitric oxide in myocardial repair and remodeling. Antioxid Redox Signal,2009,11(8):1913-28 ;和 Halestrap AP, Clarke SJ, Khaliulin I.The role of mitochondria in protection of the heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta. ,2007,1767 (8): 1007 - 1031)。構 建好的質粒用BanmHI、Ec〇RI、HindIII酶切，產(chǎn)物電泳照相后鑒定條帶。
[0044] 1. 2. ES細胞打靶及篩選
[0045] 基因打祀：100 u g Kcna3-K0_vector 質粒 DNA 用 Notl (酶用量：300U)線性化。 打靶載體線性化酶切體系為250 y L、37°C消化過夜，等體積酚氯仿、氯仿處理后，無水乙醇 沉淀，100 U L 無菌 PBS 重懸備用。35 u g 線性化 Kcna3-K0_voctor DNA 在 Bio - Rad Gene Pulser電轉儀上對129/S6/SvEv鼠胚胎干細胞SCR012電穿孔。電穿孔條件：電壓256v，電 容500 ii F,通電時間9. 6ms。打靶后用300 ii g/mL G418和2 ii Mol/L GanC雙藥篩選8d后 挑克隆，并進行跨5'或3'臂和插入片段的DNA鑒定，使用長鏈PCR酶（Fermentas Co,立 陶宛)。
[0046] 1. 3?重組干細胞鑒定：
[0047] 設計 PCR 引物：Pl(5' 臂）：ATGAAACCAITCACATAGCCT AAACAG (如 SEQ ID NO. 1 所示）；P2(Neo F) :CCTCCCCCGTGCCTTCCTTG AC (如 SEQ ID N0.2 所示）；P3(3 '臂）： GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT (如 SEQ ID N0.3 所示）；P4(Ne〇-R) :CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA (如 SEQ ID NO. 4 所示）；5' 臂用 PI 和 P2 檢測。PCR 條件：94°C 30s ;67°C 30s ; 72°C 5min ;35 個循環(huán)。PCR 儀使用 Eppendorf AG22331(Hamburg，德國）。試劑：TaKaRa La Taq EcoRI 來自寶生物工程（大連)有限公司。Marker:MBI GeneRuler;lkb DNA Ladder(晶 美生物有限公司，上海）。電泳見4.8kbp陽性條帶。3'臂用P3和P4檢測。PCR條件： 94°C 30秒；63°C 30秒；72°C 5分；35個循環(huán)。電泳見4. 2kbp陽性條帶。
[0048] 1. 4?實驗動物：
[0049] SPF級C57BL/6J(古）與CBA (早）小鼠來源于上海實驗動物資源中心 【SyXK (滬）2008-0035】。無菌手術在上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障動物實驗設施進行 【SyXK (滬）2009-0069】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。
[0050] 1.5?嵌合小鼠制備：
[0051] 參照以下文獻（Facundo HT, Fornazari M, Kowaltowski AJ.Tissue protection mediated by mitochondrial K + channels. Biochim Biophys Acta.，2006, 1762 (2) : 202-12..)記載的方法。藥物篩選挑取的陽性克隆，PCR鑒定獲得同 源重組克隆后，將正確同源重組的ES細胞通過囊胚腔注射獲得嵌合體子代。注射用囊胚采 自C57BL/6J近交系小鼠，通過超數(shù)排卵，自然受孕，胚胎體內發(fā)育至囊胚階段，用于注射。 注射后移植入假孕小鼠受體子宮，假孕受體為C57BL/6J( 6 )與CBA (早）的雜交一代。生 育出嵌合率大于50 %的嵌合雄鼠。
[0052] 1. 6.F1代雜合小鼠Kvl. 3+繁育：
[0053] 將嵌合率大于50 %的成熟小鼠與野生型C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代灰色 小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定。用PCR方法鑒定基因型。用普通酶短片段PCR擴 增法。PCR陽性產(chǎn)物用T載體連接后轉化進大腸桿菌。電泳結果判斷野生型、雜合子或純合 子。產(chǎn)物用T4連接酶連到pMD18T載體，轉化進大腸桿菌篩選。煮菌PCR初步鑒定后，送測 序鑒定。
[0054] 2?結果
[0055] 2. 1構建好的質粒用BanmHI、EcoRI、Hindlll限制性內切酶反應后電泳鑒定圖譜 和基因打靶設計圖見圖1，圖2,圖3。如圖1所示，分別是小鼠Kcna3基因野生型、打靶突變 型基因座位、打靶雙臂位置示意圖。如圖2所示，載體中插入序列小鼠Kcna3基因的5'端 4410bp、3'端3744bp和中間Pgk啟動NE0表達讀框（1926bp)。如圖3所示，M代表DNA大 小參照標準；（_)代表陰性對照；1泳道代表BamHI內切酶反應，10388bp和5654bp ;2泳道 代表 EcoRI 內切酶反應，5653&口、395(^口、3255&口、159(^口、148(^口、48&口和16&口 ；3泳道代表 Hindlll內切酶反應，8952bp、6341bp和699bp。圖1-圖3結果提示檢測片段正確。基因打 靶后，做ES克隆鑒定。將pGK啟動子指導的NE0表達框敲進并替代到Kvl. 3第三外顯子部 位。上游臂3. 2k，下游臂為5. 0k，下游臂側翼接pGK啟動子指導的TK表達框。PCR鑒定藥 物抗性ES細胞克隆96個，其中9個ES克隆發(fā)生雙臂同源重組。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA序列測定 進一步證實。9個ES克隆PCR電泳圖如圖4A和圖4B所示。如圖4A所示，5'端陽性PCR 條帶4. 8kbp見于1、2、4、6、7、8、9、10、11孔道；如圖4B所示，3'端陽性PCR條帶4. 2kbp見 于1、6、12、13、16、20、21孔道；每對有一個引物在插入片段中。
[0056] 2. 2超排了 80只C57BL/6J小鼠，共注射了 151枚囊胚，移植了 9個假孕母鼠，出生 了 17只小鼠，其中4只為嵌合率大于50%的嵌合雄鼠。嵌合雄鼠經(jīng)C57BL/6J小鼠交配繁 殖后獲得40只灰鼠，經(jīng)基因型鑒定分析，有8只為雜合子小鼠，為5雄3雌（F1代)。
[0057] 2. 3基因敲除F1代雜合小鼠。對繁育的F1代后代做基因型鑒定。用PCR法對構 建載體測序報告的結果提示PCR為基因組DNA序列敲除原設計部位的特異產(chǎn)物。排除了非 特異擴增現(xiàn)象，提示結果可靠。雜合小鼠經(jīng)過繁育現(xiàn)已獲得純合子個體。
[0058] 2. 4,經(jīng)過7代以上回交，基因型穩(wěn)定在近交系動物群內。
[0059] 實施例2心肌線粒體內膜Kvl. 3鉀通道的發(fā)現(xiàn)
[0060] 1. C572D鼠消毒后采取心臟，剪碎；
[0061] 2?胰酶消化心?。?br> [0062] 3?培養(yǎng)三天后傳代到載玻片室，48H換液，72小時換液；
[0063] 4.去培液，DPBS洗兩次，冷95%固定5分鐘，送公司處理；
[0064] 5.大概處理：4%多聚甲醛固定15分，待穿膜的PBS洗兩次，放在4°C溫度下保 存。
[0065] 6.染熒光：
[0066] (1)封閉15分后，
[0067] (2) -抗：染15分鐘，洗兩次，
[0068] (3)二抗：染15分鐘，洗兩次，
[0069] 7.加PI染十分鐘后，放在4°C溫度下待測；
[0070] 8.顯微鏡下采取圖像，見圖5 :
[0071] 一，見培養(yǎng)細胞均有染色，主要集中在心肌線粒體上；心臟傳導細胞內線粒體少， 核大，但是細胞膜Kvl. 3染色弱陽性。
[0072] 二，心肌四種細胞(心肌細胞、冠脈內皮細胞、冠脈平滑肌細胞、傳導(大核）細胞） 中，Kvl. 3分布有差異：心肌多，內皮也很多，平滑肌相對少些，而傳導細胞（大核）很 少(見圖6)。
【權利要求】
1. 一種構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的方法，其特征 在于，包括如下步驟：（1)制備同源重組載體：（2)ES細胞打靶及篩選；（3)重組干細胞PCR 鑒定；（4)嵌合小鼠制備：PCR鑒定獲得同源重組克隆后，將正確同源重組的ES細胞通過囊 胚腔注射獲得嵌合體子代；（5) F1代雜合小鼠 Kvl. 3+繁育。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)具體為：打靶載體使用BAC載體，構 建好的質粒用BanmHI、Ec〇RI、HindIII酶切，產(chǎn)物電泳照相后鑒定條帶。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2)為：將打靶載體電擊轉化胚胎干細 胞，使其與基因組發(fā)生同源重組。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，設計如下PCR引物對：P1 : 如 SEQ ID NO. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID NO. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示；P1 和 P2 為一對引物，P3 和 P4 為一對引 物。
5. 如權利要求1或4所述的方法，其特征在于，在步驟（3)中，所述PCR反應條件為： 94°C 30s ;67°C 30s ;72°C 5min ;35 個循環(huán)。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4)中，注射用囊胚采自C57BL/6J近 交系小鼠，通過超數(shù)排卵，自然受孕，胚胎體內發(fā)育至囊胚階段，用于注射；注射后移植入假 孕小鼠受體子宮，假孕受體為C57BL/6J( 6 )與CBA (早）的雜交一代，生育出嵌合率大于 50%的嵌合雄鼠。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5 )中，將嵌合率大于50 %的成熟小鼠 與野生型C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定， 用PCR方法鑒定基因型，用普通酶短片段PCR擴增法，PCR陽性產(chǎn)物用T載體連接后轉化進 大腸桿菌，電泳結果判斷野生型、雜合子或純合子，產(chǎn)物用T4連接酶連到pMD18T載體，轉化 進大腸桿菌篩選，煮菌PCR初步鑒定后，送測序鑒定。
8. 用于構建與心肌保護相關的線粒體鉀通道Kvl. 3基因敲除小鼠模型的PCR引 物對，其特征在于：采用以下兩對引物對：P1和P2引物對，P3和P4為引物對；P1 : 如 SEQ ID NO. 2 所示；P3 :GGCAAAGCTAATGGTTACTGGCAAATGT，如 SEQ ID NO. 3 所示；P4 : CTGAGCCCAGAAAGC GAAGGA，如 SEQ ID NO. 4 所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450759SQ201310443449
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】劉中民, 范慧敏, 張良平 申請人:上海市東方醫(yī)院