通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)得到敲除鐵調(diào)素基因斑馬魚(yú)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚(yú)中的鐵調(diào)素 基因技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] CRISPR/Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御， 可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的 片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)CRISPRRNAs(crRNAs)來(lái)指導(dǎo)同源序列的降解，從 而提供免疫性。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通過(guò)堿基配對(duì)與 tracrRNA(trans-activatingRNA)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸 酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。而通過(guò)人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以 改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA(shortguideRNA)，足以引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割。作 為一種RNA導(dǎo)向的dsDNA結(jié)合蛋白，Cas9效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個(gè)統(tǒng)一因子（unifying factor)，能夠共定位RNA、DNA和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無(wú)核酸酶的 Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表達(dá)適當(dāng)?shù)膕gRNA，可革E定任何dsDNA序列，而RNA可 連接到sgRNA的末端，不影響Cas9的結(jié)合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列處帶來(lái)任何融 合蛋白及RNA，這為生物體的研究和改造帶來(lái)巨大潛力。
[0003] 相比于傳統(tǒng)的Talens等敲基因技術(shù)，CRISPR/Cas9具有更高效率，更方便操作，其 具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0004] 1.只需要合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具有特異性，
[0005] 2.編碼sgRNA的序列不超過(guò)100bp，因此比構(gòu)建TALENs和ZFNs更簡(jiǎn)單方便，
[0006] 3.較短的sgRNA序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù)的TALENs編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種敲除鐵調(diào)素基因斑馬魚(yú)的制備方 法，設(shè)計(jì)了新的gRNA序列，設(shè)計(jì)在鐵調(diào)素第一個(gè)外顯子和內(nèi)含子之間，gRNA序列為 CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC，從而對(duì)鐵調(diào)素基因進(jìn)行了敲除。
[0008] 為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)得到敲 除鐵調(diào)素基因斑馬魚(yú)的制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)在鐵調(diào)素基因第一個(gè)外顯子和內(nèi)含子之間設(shè)計(jì)gRNA序列，gRNA序列為 CCAAGCGCCAAGTCACCTTTCC；
[0010] (2)設(shè)計(jì)并合成gRNA引物，引物序列為P3:Forwardsequence(5'to3'）：TAACGTGT TTCTGGCTGCTG,
[0011] P4:Reversesequence(5,to3,)：AAAAGCACCGACTCGGTGCC;
[0012] (3)以上述的引物、gRNA-plasmid為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，
[0013]PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3min，進(jìn)入三步循環(huán)（95°C-20s、58°C-20s、 72°C-20s共30個(gè)循環(huán)），然后72°C-lOmin，最后保溫在16°C;電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行 純化；
[0014] (4)RNA-Free條件下，將上述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA，轉(zhuǎn)錄體系中加入 T7聚合酶和NTP，37°C，lhour反應(yīng)完畢，然后進(jìn)行純化；
[0015] (5)將前述純化后的gRNA和Cas9蛋白顯微注射到單細(xì)胞的斑馬魚(yú)胚胎中，24小 時(shí)后提取DNA進(jìn)彳丁測(cè)序檢測(cè)；
[0016] (6) 3-4個(gè)月后斑馬魚(yú)性成熟后，將突變的斑馬魚(yú)與野生型的斑馬魚(yú)雜交，得到一 定概率的雜合子，將胚胎進(jìn)行RNA提取并逆轉(zhuǎn)錄成DNA送測(cè)序查看是否有突變，這時(shí)候的 DNA還是雙鏈的；
[0017] (7)將測(cè)序后發(fā)現(xiàn)突變的斑馬魚(yú)的cDNA和19T載體相連接后，將其在培養(yǎng)基中滾 珠圖板，經(jīng)過(guò)12-14小時(shí)后，已經(jīng)連接的質(zhì)粒會(huì)以斑點(diǎn)形式成長(zhǎng)，將其挑斑后，這時(shí)候得到 的是單鏈的DNA，再次送測(cè)序，最終得到單鏈的突變，這時(shí)候?yàn)檎嬲s合的突變體，然后將其 培養(yǎng)長(zhǎng)大；
[0018] (8)經(jīng)過(guò)3-4個(gè)月后性成熟后，第二代的突變成年的雄魚(yú)與雌魚(yú)再次切除尾巴，進(jìn) 行鑒定，突變的斑馬魚(yú)再次交配，從而得到純合的鐵調(diào)素敲除的斑馬魚(yú)。
[0019] 作為本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（3)中PCR的酶為K0D酶。
[0020] 本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，gRNA-plasmid的制備方法如下：
[0021] (1)設(shè)計(jì)并合成gRNA引物，引物序列為P3:Forwardsequence(5't〇3'）：TAACGTGT TTCTGGCTGCTG,
[0022] P4:Reverse sequence(5, to 3, )：AAAAGCACCGACTCGGTGCC ;
[0023] (2)以上述引物及斑馬魚(yú)cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，
[0024]PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3min，進(jìn)入三步循環(huán)（95°C-20s、58°C-20s、 72°C-20s共30個(gè)循環(huán)），然后72°C-lOmin，最后保溫在16°C;
[0025] (3)RNA-Free條件下，將上述的PCR產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到gRNA，轉(zhuǎn)錄體系中加入 T7載體和NTP，37°C，lhour反應(yīng)完畢，然后純化，得到gRNA-plasmid。
[0026] 作為本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，所述步驟（5)中注射體系為：gRNA12. 5(ng/ul)， Cas9為300(ng/ul)，Tris-Hcl 0· 2ul，Phenol-redO. 2ul，DEPC Water補(bǔ)充到2ul〇
[0027] 作為本發(fā)明一優(yōu)選技術(shù)方案，步驟（3)和步驟（4)中的純化方法包括如下步驟：
[0028] (A)加入體積為1 :2-3的水和苯酸/氯仿/異丙醇，混勾后10, 000-15,OOOrpm離 心5min.上層移入新的管子，重復(fù)該步驟一次，
[0029] (B)上層移入新的管子，加入150ul氯仿，離心5min，
[0030] (C)加入1/10體積2· 5M醋酸鈉以及2. 5體積乙醇，-70°C冷凍30min.
[0031] (D)離心10, 000-15, OOOrpm在 4C15min，
[0032] (E)棄掉溶液留沉淀，加入200ul 80%乙醇，離心5min.棄掉溶液，干燥后用 10-20 μ 1 DEPC H20溶解。
[0033] 本發(fā)明主要涉及利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)獨(dú)特的一段gRNA序列，使得斑馬魚(yú) 中的鐵調(diào)素基因被敲除，又不"誤傷"其他基因，得到首例鐵調(diào)素敲除的斑馬魚(yú)（國(guó)內(nèi)外均 無(wú)報(bào)道）。作為首例鐵調(diào)素敲除轉(zhuǎn)基因的模式動(dòng)物斑馬魚(yú)的意義重大，鐵調(diào)素是調(diào)控鐵的 主要因素，一旦被敲除，即成功動(dòng)物模成鐵過(guò)載的模式動(dòng)物，可以排除人為因素干預(yù)，對(duì)于 研究鐵的表達(dá)研究意義重大，同時(shí)與傳統(tǒng)敲除基因的技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有毒性 小，準(zhǔn)確性高，效率高，成功周期短等特點(diǎn)；使得鐵調(diào)素基因更快得被敲除。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0035]圖1為本發(fā)明方法的培育雜交圖系。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明 本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體應(yīng)用條件做進(jìn) 一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0037] 此次實(shí)施例中所用的引物均為蘇州金唯智公司合成。T7載體/聚合酶購(gòu)自 Trizol(Ambion公司），Cas9 購(gòu)TransGen公司。K0D購(gòu)自:S.Y.BR:⑩PremixExTaq?(Tli RNaseHPlus)(大連寶生物公司），19T載體購(gòu)自SYB.K#PremixExTaq?(TliRNaseH Plus)(大連寶生物公司），oligo(dT)(生工公司）定量PCR試劑；酸、氯仿、異戊醇等各類(lèi) 有機(jī)試劑和NaCl等無(wú)機(jī)試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），本發(fā)明中使用的野生型斑馬 魚(yú)為野生型斑馬魚(yú)AB品系購(gòu)自蘇州大學(xué)生物鐘研究中心。
[0038] 本發(fā)明總體的思路是：設(shè)計(jì)gRNA位點(diǎn)-PCR-純化-體外轉(zhuǎn)錄-純化-顯微注射-鑒 定活性-飼養(yǎng)至成年-與野生型交配-檢