專利名稱：優(yōu)化的斑馬魚(yú)卵黃蛋白原基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工改造合成的編碼完整的斑馬魚(yú)(Danio rerio)卵黃蛋白原 VTG的新基因nvtgl以及依其構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒及其含該表達(dá)質(zhì)粒的工程菌，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雌激素(Estrogen)可分為內(nèi)源性雌激素和外源性雌激素，內(nèi)源性雌激素主要指人體卵巢合成分泌的激素，而外源性雌激素也叫環(huán)境雌激素，它們可以進(jìn)入生物體內(nèi)，通過(guò)干擾生物體內(nèi)源性雌激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解或產(chǎn)生類似生物體內(nèi)源性雌激素的作用。環(huán)境雌激素種類很多，主要包括人工合成雌激素、植物性雌激素、 真菌性雌激素、有激素效應(yīng)的環(huán)境化學(xué)污染物等等。環(huán)境雌激素污染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。一些研究環(huán)境雌激素生態(tài)毒性的動(dòng)物模型的建立，如斑馬魚(yú)(Danio rerio)，唐魚(yú)等，對(duì)環(huán)境雌激素污染的研究和監(jiān)控具有重要的意義。雌激素的體內(nèi)信號(hào)通路的研究使人們認(rèn)識(shí)到卵黃蛋白原(Vitel logenin, VTG)等蛋白是是雌激素和雌激素受體Estrogen receptors,ER)調(diào)控的下游蛋白，因此VTG可以作為一種重要的、可反應(yīng)雌激素水平的生物標(biāo)志物。檢測(cè)環(huán)境雌激素污染模式生物體內(nèi)的VTG蛋白含量需要有效的定量和定性研究的技術(shù)，其具體使用的蛋白檢測(cè)方法為Western Blot和Elisa, Western Blot和Elisa的使用的前提條件是需要有VTG蛋白標(biāo)品。目前，VTG蛋白標(biāo)品主要來(lái)自模式生物的天然VTG 蛋白(natural VTG，nVTG)，但其天然含量少，給分離純化帶來(lái)很大的難度，而使用基因工程重組技術(shù)生產(chǎn)VTG(recombinant VTG, rVTG)是先進(jìn)而有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種人工改造合成的，可在大腸桿菌中高效表達(dá)的編碼完整的斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG的新基因rwtgl，該人工改造合成的nvtgl基因，具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列使用了大腸桿菌偏愛(ài)性密碼子。使用所述斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG基因nvtgl構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述表達(dá)載體為胞內(nèi)表達(dá)載體，優(yōu)選以pET48a(+)為骨架。使用所述斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG基因nvtgl或表達(dá)載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或基因工程菌均屬于本專利的保護(hù)范圍。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種所述斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG基因 nvtgl或含有斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG基因nvtgl的表達(dá)載體在環(huán)境檢測(cè)，食品檢測(cè)、醫(yī)學(xué)研究和VTG抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成了編碼斑馬魚(yú)卵黃蛋白原的新基因rwtgl，構(gòu)建了適用于魚(yú)卵黃蛋白原表達(dá)的工程菌。表達(dá)結(jié)果表明，VTG蛋白產(chǎn)量可以達(dá)到3mg/ml，Western實(shí)驗(yàn)表明其抗原性顯著，實(shí)現(xiàn)了 VTG蛋白在原核生物大腸桿菌中高效率表達(dá)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖 lnvtgl/pEI^8a(+)物理圖譜圖2重組表達(dá)VTG的SDS-PAGE圖譜和Western圖譜a.重組表達(dá) rVTG 的 SDS-PAGE1.蛋白 Marker ；2.雌性斑馬魚(yú) VTG 樣品；3. pET_28a(+)/BL21 (DE3)的胞內(nèi)沉淀； 3.未用 IPTG 誘導(dǎo)的 nvtgl/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；4.未用 IPTG 誘導(dǎo)的 nvtgl/ pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；nVTG代表天然的VTG蛋白；rVTG代表重組表達(dá)的VTG蛋白。b.重組表達(dá)rVTG的Western鑒定1.蛋白 Marker ；2.雌性斑馬魚(yú) VTG 樣品；3. pET_28a(+)/BL21 (DE3)的胞內(nèi)沉淀； 3.未用 IPTG 誘導(dǎo)的 nvtgl/pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；4.未用 IPTG 誘導(dǎo)的 nvtgl/ pET28a(+)/BL21(DE3)的沉淀；nVTG代表天然的VTG蛋白；rVTG代表重組表達(dá)的VTG蛋白。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，下列實(shí)施例用于說(shuō)明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，基本上都按照常見(jiàn)的分子克隆手冊(cè)所述的條件進(jìn)行操作。實(shí)施例1 nvtgl基因設(shè)計(jì)以斑馬魚(yú)(Danio rerio)卵黃蛋白原 vtgl 全基因(Danio rerio, vitellogenin 1, NCBIaccession :NP_001038362 NP_739573 XP_691311)序列為起始序，利用大腸桿菌優(yōu)化密碼子替換其19個(gè)大腸桿菌稀有密碼子，消除其內(nèi)部10個(gè)的NdeI，EColi I,NotI, SacI 和BamHI等核酸限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，得到新的人工改造設(shè)計(jì)的斑馬魚(yú)卵黃蛋白原基因nvtgl，消除其內(nèi)部的NdeI，Ecoli I，NotI，SacI，BamHI等酶切位點(diǎn)，序列如SEQ ID NO. 1 所示，全長(zhǎng)4095bp，上游含Nde I酶切位點(diǎn)CATATG，下游含Mil酶切位點(diǎn)GTCGAC。實(shí)施例2 nvtgl基因合成與克隆由于nvtgl基因與原vtgl基因相比，變動(dòng)較大，不便于使用RT-PCR技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)，因此使用化學(xué)合成法或常規(guī)的Over-Lap PCR技術(shù)合成nvtgl基因，將合成的nvtgl 基因與PMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)過(guò)37°C培養(yǎng)過(guò)夜，得到單克隆轉(zhuǎn)化子rwtgl/PMD18T/JM109，經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定，表明新合成的nvtgl基因全長(zhǎng)為4095bp，編碼1364個(gè)氨基酸，測(cè)定的序列和設(shè)計(jì)序列完全相同。實(shí)施例3表達(dá)VTG蛋白的載體構(gòu)建nvtgl基因在大腸桿菌中表達(dá)的載體優(yōu)選為pET18a(+)，該載體帶有His-tag標(biāo)簽，將pET-28a(+)質(zhì)粒和nvtgl/PMD18T用Nde I和Sac I切，酶切產(chǎn)物切膠回收，再用T4 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑選轉(zhuǎn)化子，通過(guò)菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定和測(cè)序鑒定，保存鑒定的nvtgl/pETj8a(+)/E. coli JM109菌，提取 nvtgl/pETj8a(+)備用。實(shí)施例4表達(dá)VTG蛋白的工程菌構(gòu)建將質(zhì)粒nvtgl/pETj8a (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主BL21 (DE3)，再在100 μ g/mL氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)過(guò)37°C培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)過(guò)菌落PCR鑒定，得到單克隆轉(zhuǎn)化子rwtgl/ pET-28a(+) /BL21(DE3)。實(shí)施例5 VTG蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)與分離純化1、發(fā)酵生產(chǎn)將nvtgl/pETj8a(+)/BL21(DE;3)接種在LB培養(yǎng)基中37 °C液體培養(yǎng)過(guò)夜，后接入 TB (甘油 5g/L，蛋白胨 12g/L，酵母膏 24g/L, K2HPO4 12. 54g/L, KH2PO4 2. 31g/L)發(fā)酵液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)到細(xì)菌0D_到0. 8，用0. 5mM IPTG (異丙基硫代β D半乳糖苷)誘導(dǎo)， 25-37°C培養(yǎng)，24h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)3mg/mL左右。2、分離純化將表達(dá)后的一定量的培養(yǎng)液離心，得到細(xì)胞，用1/10培養(yǎng)液體積的IOmM Tris-HCL, Ph7. 5，清洗3次，然后在冰浴條件下，在1/10培養(yǎng)液體積的IOmM Tris-HCL, Ph7. 5，中，用超產(chǎn)波破碎，工作條件為IOS工作，20S停滯，超產(chǎn)30min。IOOOOrpm, 4°C，離心 20min，得到沉淀。沉淀用的TritonlOO清洗3次，然后再用IOmM Tris-HCL, Ph7. 5，清洗；清洗后，IOOOOrpm, 4°C，離心20min,得到rVTG蛋白。實(shí)施例6 SDS PAGE和Western鑒定重組表達(dá)的VTG (rVTG)用常規(guī)的SDS PAGE程序，制備2塊蛋白電泳膠，電泳后，一塊做考馬斯亮藍(lán)染色另一塊做western blotting。電泳條件80V 40min ； 150V 50min。電泳結(jié)束后，一塊膠考馬斯亮藍(lán)染色2-4h、另一塊做wester blotting，轉(zhuǎn)膜條件100V、90min ；膜轉(zhuǎn)成功后浸5% BSA 中封閉lh，一抗(1 1000)液反應(yīng)60min，TTBS洗滌6次，每次lOmin，在二抗(1 250000) 與HRP-交聯(lián)劑試劑中反應(yīng)(1 50000)60min, TTBS洗滌6次，每次IOmin ；化學(xué)發(fā)光交聯(lián)試劑1 1混勻避光保存，5min,拍照。Western為陽(yáng)性，鑒定VTG已被重組表達(dá)而且具有抗原性。實(shí)施例7 nvtgl基因在環(huán)境檢測(cè)和食品檢測(cè)和醫(yī)學(xué)研究與疾病診斷中的應(yīng)用用rwtgl基因構(gòu)建VTG表達(dá)工程菌，通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)VTG蛋白。VTG蛋白是環(huán)境檢測(cè)和食品檢測(cè)和醫(yī)學(xué)研究與疾病診斷的重要生物學(xué)試劑。利用rVTG代替天然VTG(nVTG)蛋白作為標(biāo)品，基于Elisa方法，可定量檢測(cè)生物體內(nèi)的VTG蛋白含量，為生物體內(nèi)激素狀況評(píng)價(jià)提供根據(jù)。可以理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.優(yōu)化的斑馬魚(yú)(Daniorerio)卵黃蛋白原基因nvtgl，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的基因rwtgl，其特征在于所述核苷酸序列使用大腸桿菌的偏愛(ài)性密碼子。
3.含有權(quán)利要求1所述卵黃蛋白原的新基因rwtgl的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為胞內(nèi)表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于優(yōu)選以pET18a(+)為骨架。
6.含有權(quán)利要求1所述卵黃蛋白原的新基因rwtgl或5所述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求1所述卵黃蛋白原的新基因rwtgl或5所述的表達(dá)載體的基因工程菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因工程菌，其特征在于優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3)。
9.權(quán)利要求1所述卵黃蛋白原的新基因rwtgl或5所述的表達(dá)載體在環(huán)境監(jiān)察、食品檢測(cè)、醫(yī)學(xué)研究和卵黃蛋白原抗體制品生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了優(yōu)化的斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG全基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是以斑馬魚(yú)(Danio rerio)卵黃蛋白原vtg1全基因(Danio rerio，vitellogenin 1，NCBI accessionNP_001038362 NP_739573 XP_691311)序列為模板，利用大腸桿菌優(yōu)化密碼子替換其19個(gè)大腸桿菌稀有密碼子，消除其內(nèi)部10個(gè)的NdeI，EcoliI，NotI，SacI和BamHI等核酸限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成了編碼完整的斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG的新基因nvtg1，構(gòu)建了含該nvtg1基因的表達(dá)質(zhì)粒和含該質(zhì)粒的工程菌。首次實(shí)現(xiàn)斑馬魚(yú)卵黃蛋白原VTG的重組表達(dá)，VTG蛋白產(chǎn)量可以達(dá)到3mg/ml，Western實(shí)驗(yàn)表明其抗原性顯著，實(shí)現(xiàn)了VTG蛋白在原核生物大腸桿菌中高效率表達(dá)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102352362SQ20111030126
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月8日
發(fā)明者單正軍, 成秀梅, 焦少俊, 趙慶新, 韓志華 申請(qǐng)人:環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所, 鹽城師范學(xué)院