斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因、重組表達(dá)載體、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種去飽和酶基因及編碼蛋白，及其實現(xiàn)的提高家蠶亞油酸或a-亞 麻酸含量方法。屬于基因工程、轉(zhuǎn)基因動物育種領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物體內(nèi)，許多代謝過程都在膜上進(jìn)行或與膜有關(guān)，而不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜 磯脂的重要組成成分。由于脂肪酸的凝固點(diǎn)隨其不飽和度升高而降低，因此膜脂中的不飽 和脂肪酸含量越高，其相變溫度越低，流動性越大。進(jìn)而，細(xì)胞膜的各種功能，如細(xì)胞識別、 轉(zhuǎn)運(yùn)作用和膜結(jié)合酶的活性等等都和細(xì)胞膜的流動性密切相關(guān)，因此不飽和脂肪酸在生物 體內(nèi)直接或間接的發(fā)揮著重要的功能，如抗癌抗腫瘤活性、免疫調(diào)節(jié)活性、促生長發(fā)育活性 和降低膽固醇活性等。
[0003] 家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。蠶蛹不僅是優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白源，而且富含豐富的不飽和 脂肪酸。家蠶組織內(nèi)，脂肪酸占干重的約30%，其中不飽和脂肪酸約占70%，wa-亞麻酸 為主。但是目前蠶蛹的加工利用方式主要是用于家畜飼料的蛋白源添加組分，其組織中脂 肪酸成分利用非常有限。因此，提高蠶蛹不飽和脂肪酸含量尤其是主要的亞油酸和a亞麻 酸含量對蠶蛹的進(jìn)一步綜合利用有著重要意義。近幾年來，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的建立W及成 熟使家蠶成為了新型的真核生物反應(yīng)器，已有研究者通過將家蠶作為反應(yīng)器成功的表達(dá)了 多種高附加值產(chǎn)物，如人成纖維細(xì)胞生長因子、貓干擾素和人III型前膠原蛋白等。然而用家 蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶體內(nèi)表達(dá)外源脂肪酸去飽和酶基因，進(jìn)而通過外源脂肪酸去飽和酶基 因的表達(dá)而改變脂肪酸含量的研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是提供一種斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因、由該基因指導(dǎo)編碼的蛋 白，W及由該基因重組表達(dá)載體實現(xiàn)的提高家蠶亞油酸或a-亞麻酸含量方法。為實現(xiàn)上 述目的，本發(fā)明技術(shù)方案分別如下：
[0005]本發(fā)明首先提供一種斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因。
[0006] 一種斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因，命名為化Des基因，其特征在于；核巧酸序列如 沈QIDNo. 1。
[0007] 上述斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因DrDes是根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中編碼基因 表達(dá)序列密碼子的偏好性，對來源于斑馬魚的脂肪酸去飽和酶基因序列（NCBI登陸號為： NP_571720. 2)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，優(yōu)化后獲得新的去飽和酶基因，命名為化Des，其核巧酸序列 如SEQIDNo. 1 所示。
[000引由上述斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因化Des指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其技術(shù)方案如下：
[0009] 一種由上述斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因DrDes指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于： 氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 上述由化Des基因指導(dǎo)編碼的蛋白由444個氨基酸組成，具有由8個保守的組氨 酸殘基構(gòu)成3個組氨酸富集區(qū)，另外其N端含有一個細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域，使其酶活更高。
[0011] 利用上述化Des基因可W得到重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系統(tǒng)或重組菌株，其 技術(shù)方案如下：
[0012] 一種包含核巧酸序列如SEQIDNo. 1的重組表達(dá)載體或基因表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌株。
[0013] 上述重組表達(dá)載體，其表達(dá)框的啟動子是BmNPV極早期啟動子IE1或家蠶脂肪體 組織特異性啟動子Lp3。
[0014] 進(jìn)一步地，上述重組表達(dá)載體是W眼和神經(jīng)特異的啟動子3XP3啟動的紅色巧光 蛋白DsRed作為表達(dá)盒，紅色巧光蛋白作為篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記后帶有WIE1啟動子啟動優(yōu) 化后的化Des基因；或者是W加強(qiáng)型綠色巧光蛋白EGFP作為表達(dá)盒，加強(qiáng)型綠色巧光蛋白 作為篩選標(biāo)記，篩選標(biāo)記后含有WLp3啟動子啟動優(yōu)化后的化Des基因。
[0015] 本發(fā)明還提供構(gòu)建上述包括核巧酸序列如SEQIDNo. 1的重組表達(dá)載體的方法。
[0016] 構(gòu)建包括核巧酸序列如SEQ IDNo.1的重組表達(dá)載體的方法，其特征在于；是將所 述化Des基因插入到出發(fā)載體PSL1180的多克隆位點(diǎn)得到中間載體，然后再將完整的含有 DrDes基因的表達(dá)盒IEl-DrDes-SV40插入到最終載體地ac [3 X P3-DsRed]得到重組表達(dá)載 體；或者，是將所述DrDes基因插入到出發(fā)載體的L1180的多克隆位點(diǎn)得到中間載體，然后 再將完整的含有化Des基因的表達(dá)盒Lp3-DrDes-SV40插入到最終載體地ac巧XP3-EGFP] 得到重組表達(dá)載體。
[0017] 上述重組表達(dá)載體在獲得高亞油酸或a-亞麻酸含量家蠶轉(zhuǎn)基因品系中的應(yīng)用。 [001引本發(fā)明還提供提高家蠶組織中亞油酸或a-亞麻酸含量的方法，其技術(shù)方案如 下：
[0019] 提高家蠶組織中亞油酸或a-亞麻酸含量的方法，其特征在于：將斑馬魚脂肪酸 去飽和酶化Des基因?qū)爰倚Q胚胎中，經(jīng)篩選，得到目標(biāo)家蠶轉(zhuǎn)基因系。
[0020] 進(jìn)一步地，上述方法，是利用piggyBac重組表達(dá)載體將化Des基因整合入 家蠶基因組，piggyBac重組表達(dá)載體是將含有化Des基因的表達(dá)盒插入到出發(fā)載體 地ac巧XP3-DsRed]或地ac巧XP3-EGF門的BglII酶切位點(diǎn)得到的載體。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是；（1)設(shè)計優(yōu)化并人工合成了適用于家蠶 體內(nèi)表達(dá)的斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因值rDes)。（2)根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中內(nèi)源編 碼序列密碼子的偏好性，對斑馬魚去飽和酶基因值rDes)序列進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計，使人工合 成的化Des基因更有利于在家蠶個體中表達(dá)。（3)提供了包含核巧酸序列如SEQIDNo. 1 的重組表達(dá)載體或基因表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌株。（4)包括核巧酸序列如SEQID No. 1的重組表達(dá)載體可應(yīng)用于獲得高亞油酸或a-亞麻酸含量家蠶轉(zhuǎn)基因品系。（5)利用 piggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)合BmNPV極早期啟動子IE1或家蠶脂肪體組織特異性啟動子Lp3驅(qū)動其 表達(dá)，從而獲得了可穩(wěn)定在家蠶中表達(dá)斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因值rDes)的家蠶轉(zhuǎn)基因 系，該品系蠶蛹期組織含有高含量亞油酸和a-亞麻酸。
【附圖說明】
[0022] 圖1是重組載體地ac巧Xp3-DsRed+IEl-DrDes-SV40]結(jié)構(gòu)圖。
[0023]圖 2 是重組載體地ac巧Xp3-EGFP+Lp3-DrDes-SV40]結(jié)構(gòu)圖。
[0024] 圖3-1是lEl-DrDes家蠶轉(zhuǎn)基因系各時期巧光鑒定圖。
[0025] 圖3-2是Lp3-DrDes家蠶轉(zhuǎn)基因系各時期巧光鑒定圖。
[0026] 圖4是對照組蠶蛹脂肪酸甲醋氣相色譜。
[0027] 圖5是IE1化轉(zhuǎn)基因系蠶蛹?xì)庀嗌V。
[002引圖6是Lp3化轉(zhuǎn)基因系蠶蛹?xì)庀嗌V。
[0029] 圖7是亞油酸和a-亞麻酸含量變化圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例作進(jìn)一步的描述。
[0031] 實施例一
[0032] 斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因化Des制備。
[0033] 來源基因；斑馬魚的脂肪酸去飽和酶基因序列（NCBI登陸號為；NP_571720. 2)
[0034] 根據(jù)家蠶基因組序列數(shù)據(jù)中編碼基因表達(dá)序列密碼子的偏好性，對來源基因進(jìn)行 優(yōu)化設(shè)計，優(yōu)化后得到斑馬魚脂肪酸去飽和酶基因化Des，核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示， 命名為化Des基因。
[0035] 由化Des基因指導(dǎo)編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0036] 實施例二
[0037] 構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體地ac巧Xp3-DsRed+IEl-DrDes-SV40]。
[003引如圖1所示，將化Des基因插入到出發(fā)載體pSLl180的多克隆位點(diǎn)得到中 間載體，然后再將完整的含有化Des基因的表達(dá)盒IEl-DrDes-SV40插入到最終載體 地ac巧XP3-DsRed]得到重組表達(dá)載體。
[0039] 具體實施操作：
[0040] 步驟S1、制備載體pSL1180[Serl-DrDes-SV40]
[004U將化Des基因連接于pUC57載體質(zhì)粒；通過BamHI/NotI雙酶切pUC57載體 質(zhì)粒，回收得到化Des基因片段（回收操作按照TAKARA膠回收（小量）試劑盒使用說明 進(jìn)行），將回收片段與相同酶切的pSL1180[Ser1-PGH-SV40]載體骨架片段按照TAKARA DNAligationkitVer2. 1使用說明進(jìn)行連接，即將pGH序列替換為化Des序列，得到載體 pSL1180[Serl-DrDes-SV40]。
[004引步驟S2、制備IE1啟動子序列
[0043] PCR體外擴(kuò)增，從BmNPV基因組中擴(kuò)增IE1啟動子序列，并在擴(kuò)增片段上下游分別 添加EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，經(jīng)T-A克隆到載體PMD19-T，獲得質(zhì)粒；將獲得的PMD19-T 載體質(zhì)粒用EcoRI和BamHI雙酶切；回收IE1啟動子序列（回收操作按照TAKARA膠回收 (小量）試劑盒使用說明進(jìn)行）。
[0044] 所需PCR反應(yīng)程序為；①94°C預(yù)變性4min，②94°C變性40s，⑨55°C退火40s， ④72°C延伸40s，⑥返回步驟②進(jìn)行30個循環(huán)，⑧72°C終延伸lOmin，⑦12°C化'6￥61"。
[0045] PCR擴(kuò)增上下游引物分別：
[0046] IE1-F(SEQIDNo. 3) ;5,CGgaattcTTGCAGTTCGGGACATAAATG3，
[0047] lEl-R(沈QIDNo. 4) ;5,CGggatccTAGATCCCTAGTCGTTTGGT3'
[0048]步驟S3、制備中間載體pSL1180[IEl-DrDes-SV40]
[0049] 通過EcoRI/BamHI雙酶切步驟SI所制得載體pSLllSO[Serl-DrDes-SV40]，將 Seri啟動子切除，回收載體骨架（回收操作按照TAKARA膠回收（小量）試劑盒使用說明 進(jìn)行），載體骨架與步驟S2獲得的IE1啟動子序列按照TAKARADNAligationkitVer2. 1 使用說明進(jìn)行連接，獲得中間載體PSL1180 [IEl-DrDes-SV40]。
[0050] 步驟S4、制備表達(dá)盒片段IEl-DrDes-SV40
[0化1] 通過AscI單酶切的L1180[IEl-DrDes-SV40]，按試劑盒要求回收并補(bǔ)平黏性末 端，制得表達(dá)盒片段IEl-DrDes-SV40。
[0化2] 步驟S5、制備載體骨架
[0化3]通過BglII單酶切載體地ac巧Xp3-DsRed](參見參考文件1)，按照TAKARA膠回 收（小量）試劑盒使用說明進(jìn)行回收載體骨架并補(bǔ)平去磯酸化，得到載體骨架。
[0054]步驟S6、制備目標(biāo)載體地ac巧Xp3-DsRed+IEl-DrDes-SV40]
[0055] 將步驟S4制得表達(dá)盒片段IEl-DrDes-SV40與步驟S5制得地ac巧Xp3-DsRed] 骨架片段按照TAKARADMligationkitVer2.1使用說明進(jìn)行連接獲得目標(biāo)載體地ac巧 Xp3-DsRed+IEl-DrDes-SV40]。
[0化6] 本實施例構(gòu)建獲得的轉(zhuǎn)基因重組載體W眼和神經(jīng)特異的啟動子3XP3啟動的紅 色巧光蛋白值sRed)的表達(dá)盒，紅色巧光蛋白作為篩選標(biāo)記，其后含有WIE1啟動子啟動優(yōu) 化后的斑馬魚脂肪酸去飽和酶值rDes)基因的表達(dá)。
[0057]參考文件 1;TomitaM,MunetsunaH,SatoT,etal.Transgenic silkwormsproducerecombinanthumantypeIIIprocollagenincocoons.Nat Biotechnol, 2003, 21:52 ~56.
[00郎]實施例S
[0059] 構(gòu)建家蠶轉(zhuǎn)基因重組載體地ac巧Xp3-EGFP+Lp3-DrDes-SV40]。
[0060] 如圖2所示，將所述化Des基因插入到出發(fā)載體pSLl180的多克隆位點(diǎn)得 到中間載體，或?qū)⑼暾暮谢疍es基因的表達(dá)盒Lp3-DrDes-SV40插入到最終載體 地ac巧XP3-EGF門得到重組表達(dá)載體。
[0061] 具體實施操作；
[0062] 步驟S1、制備載體pSL1180[Serl-DrDes-SV40]
[0063] 同實施例二。
[0064] 步驟S2、制備Lp3啟動子序列<