一種斑馬魚胚胎酒精肝檢測模型及其構(gòu)建方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚胚胎酒精肝檢測模型及其構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明所述方法采用肝臟特異表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，用于構(gòu)建酒精性肝病的模型，通過分析斑馬魚肝臟外形腫大、胚胎卵黃吸收減少，以及熒光讀數(shù)等信息，構(gòu)建一種斑馬魚胚胎酒精肝檢測模型，該模型具有觀察指標(biāo)簡單，易于觀察，可定性定量化等特點(diǎn)，特別適合應(yīng)用于防治酒精肝藥物的高通量篩選。
【專利說明】一種斑馬魚胚胎酒精肝檢測模型及其構(gòu)建方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型 及其構(gòu)建方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD)在病理組織學(xué)上分為酒精性脂肪 肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化，已成為影響人們健康的主要肝臟疾病之一。據(jù) 估計(jì)，90%長期過量飲酒者可發(fā)生脂肪肝，30% -37%可進(jìn)展為酒精性肝纖維化及肝硬化， 并有5-15%患者即使戒酒仍可發(fā)生酒精性肝纖維化及肝硬化。在我國，酒精性肝病患者存 在飲酒年限久、日飲用量大的狀況。據(jù)報(bào)道，在調(diào)查的902例酒精性肝病患者中，均勻飲酒 年限為22. 4年，均勻日攝入乙醇量128. 9克，日飲量最大為640克。這種長期大量的飲酒方 式，對我國酒精性肝病患者的肝臟造成了嚴(yán)重的損傷；上述患者中，酒精性肝炎患者占 ALD 的28. 8%，酒精性肝硬化患者占 ALD的37. 4%，預(yù)示我國面臨著嚴(yán)重的酒精性肝病的威脅。 近年來，隨著人們生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，酗酒人群大幅度的增加，發(fā)病率 呈明顯上升趨勢。因此，酒精性肝病在我國將成為一個(gè)嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會問題，開展中醫(yī)藥 對ALD防治的研究具有重要意義。
[0003] 由于酒精性肝病病因復(fù)雜，臨床上雖曾應(yīng)用過多種類型的藥物進(jìn)行治療，但至今 仍缺乏療效確切的藥物。因此，臨床前有效藥物的篩選顯得至關(guān)重要。
[0004] 斑馬魚是一種小型的熱帶淡水魚，早先主要用于發(fā)育生物學(xué)研究，近年來被廣 泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)。作為一種新的藥物研發(fā)用的模式動物，斑馬魚在臨 床前藥物篩選中具有以下諸多的優(yōu)點(diǎn)：首先，斑馬。魚具有與人類高度相似的基因組，具 有與哺乳動物相似的心血管、造血、神經(jīng)及代謝等系統(tǒng)，大量高度一致的活性代謝產(chǎn)物， 并呈現(xiàn)出與人類十分相似的生理學(xué)特征，一些已知的藥物在斑馬魚上也出現(xiàn)了相似的治 療效果，包括 sodiumnitroprussude，atrovastatin，Indomethacin, 5-aminosalicyclic acid, Prednisolone及etidronate等；其次，通過化學(xué)處理、遺傳學(xué)等不同方法，研究人員 制造出了一系列的斑馬魚的人類疾病模型，可用于新藥的篩選；最后，斑馬魚具有許多獨(dú)特 的優(yōu)勢，例如，易于操作，體積小，可用于孔板的操作，藥物化合物溶解加入即可，繁殖能力 強(qiáng)，每對魚一周可產(chǎn)數(shù)百枚魚卵，可提供大量的受試樣本，生長發(fā)育迅速，3至4天主要器官 就已形成，成魚2至3個(gè)月即可產(chǎn)卵，可縮短藥物篩選的周期，提高篩選效率，養(yǎng)殖成本低， 其養(yǎng)殖成本約為小鼠的百分之一至千分之一，易于觀察，其胚胎和幼魚透明，可在顯微鏡下 實(shí)現(xiàn)活體觀察各種器官、腫瘤細(xì)胞的遷移、心跳的節(jié)律變化及血液流動等。
[0005] 本發(fā)明采用肝臟特異表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，用于構(gòu)建酒精性肝病的模 型，通過分析斑馬魚肝臟外形腫大、胚胎卵黃吸收減少，以及熒光讀數(shù)等信息，構(gòu)建一種斑 馬魚酒精肝檢測模型，該模型具有觀察指標(biāo)簡單，易于觀察，可定性定量化等特點(diǎn)，適合應(yīng) 用于斑馬魚防治酒精肝藥物的高通量篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種簡單的、可靠、高效的斑馬魚酒精 肝高通量檢測模型及其建立方法和用途。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的公開了一種斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的 構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0008] (1)選取肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因成年斑馬魚雌雄配對，按照常規(guī)方法進(jìn) 行自然交配，收集肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚卵，備用；
[0009] (2)將收集的魚卵用反滲透水沖洗，隨后轉(zhuǎn)移至魚水中養(yǎng)殖，并向所述魚水中加 入基于所述魚水的添加量為〇. 2-0. 4ppm的亞甲基藍(lán)，25-30-C培養(yǎng)，并向所述魚水中加入 0. 1-0. 3mM 1-苯基-2-硫脲，繼續(xù)培養(yǎng)至72hpf，隨機(jī)收集已孵化的斑馬魚胚胎，分為對照 組和模型組，備用；
[0010] (3)在96hpf時(shí)，向所述魚水中加入三卡因甲磺酸直至所述魚水中三卡因甲磺酸 的濃度為〇. 002-0. 004 %，麻醉所述胚胎斑馬魚；；
[0011] (4)將模型組的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移入質(zhì)量濃度為1-3%的乙醇溶液中，在密封條件 下于25-30°C繼續(xù)孵育24-40h ;另取對照組的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移入水中，在密封條件下于 25-30°C繼續(xù)孵育24-40h，得到斑馬魚酒精肝檢測模型；
[0012] (5)取模型組和對照組的斑馬魚胚胎在熒光顯微鏡下測定肝臟、卵黃大小以及熒 光表達(dá)信號強(qiáng)度，對比模型組和對照組的斑馬魚胚胎的肝臟面積、卵黃面積以及熒光表達(dá) 信號強(qiáng)度，若所述模型組的肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信號強(qiáng)度均大于對照組 的，則所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型構(gòu)建成功；反之，則不成功。
[0013] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（3)中，在制 備所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型過程中所使用的乙醇的質(zhì)量濃度為2%。
[0014] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（3)中，所述 胚胎斑馬魚在28?培養(yǎng)箱中孵育32h。
[0015] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（3)中，向魚 水中加入三卡因甲磺酸直至所述魚水中三卡因甲磺酸濃度為〇. 003%。
[0016] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（2)中，所采 用的亞甲基藍(lán)基于所述魚水的添加量為〇· 3ppm。
[0017] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（2)中，向所 述魚水中加入0. 2mM 1-苯基-2-硫脲。
[0018] 所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，在所述步驟（1)中，在所 述成年肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚以雌雄比為1:1配對進(jìn)行交配，并以產(chǎn)卵開 始計(jì)時(shí)，在30分鐘內(nèi)收集所述肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚卵。
[0019] 本發(fā)明提供了一種由上述的建立方法制備得到所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量 檢測模型。
[0020] 本發(fā)明提供了一種所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型用于評價(jià)或篩選用 于治療酒精肝的藥物的用途。
[0021] 本發(fā)明提供了一種利用所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型篩選防治酒精 肝的藥物的方法，具體包括如下步驟：
[0022] 1)取所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型，并向其中加入濃度1-25 μ Μ的待測 化合物，于25-30°C恒溫條件下培養(yǎng)36-60h，得到給藥斑馬魚模型；
[0023] 2)將所述給藥斑馬魚進(jìn)行分析，計(jì)算所述給藥斑馬魚的肝臟和卵黃的面積，并測 定其熒光表達(dá)信號強(qiáng)度，若所述給藥斑馬魚的肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信號 強(qiáng)度的數(shù)值相比所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的降低10-30%，則所述待測化 合物具有防治酒精肝的作用。
[0024] 優(yōu)選的，所述利用所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型篩選防治酒精肝的藥 物的方法，具體包括如下步驟：
[0025] 1)取所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型，并向其中加入濃度?ο μ Μ的待測化 合物，于2S°C恒溫條件下培養(yǎng)48h，得到給藥斑馬魚；
[0026] 2)將所述給藥斑馬魚進(jìn)行分析，計(jì)算所述給藥斑馬魚的肝臟和卵黃的面積，并測 定其熒光表達(dá)信號強(qiáng)度，若所述給藥斑馬魚的肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信號 強(qiáng)度的數(shù)值相比所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的降低20%，則所述待測化合物 具有防治酒精肝的作用。
[0027]本發(fā)明采用肝臟特異表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，用于構(gòu)建酒精性肝病的模 型，通過分析斑馬魚肝臟外形腫大、胚胎卵黃吸收減少，以及熒光讀數(shù)等信息，構(gòu)建一種斑 馬魚胚胎酒精肝檢測模型，該模型具有觀察指標(biāo)簡單，易于觀察，可定性定量化等特點(diǎn)，適 合應(yīng)用于斑馬魚防治酒精肝藥物的高通量篩選，且肝臟特異表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚 在酒精處理后出現(xiàn)胎肝臟外形腫大，卵黃吸收減少，熒光讀數(shù)增加，這些指標(biāo)和酒精性肝病 的病理切片、油紅0染色以及生化分子生物學(xué)指標(biāo)相一致。
[0028] 效果例
[0029] 本實(shí)施例僅以實(shí)施例3制備的所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型為研究對 象，考察本發(fā)明所述的斑馬魚胚胎酒精肝模型的評價(jià)指標(biāo)，即肝臟的面積、卵黃的面積以及 熒光表達(dá)信號強(qiáng)度的增加與現(xiàn)有技術(shù)中的斑馬魚胚胎酒精肝模型常規(guī)評價(jià)指標(biāo)即油紅染 色、病理切片以及斑馬魚胚胎酒精肝模型的脂肪、膽固醇、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)異常等 結(jié)果的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信號強(qiáng)度的增加可作為 評價(jià)斑馬魚胚胎酒精肝模型是否成立的可靠指標(biāo)。
[0030] 以實(shí)施例3制備的所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型進(jìn)行常規(guī)的油紅染色、 病理切片，具體步驟如下：
[0031] 斑馬魚胚胎酒精肝的油紅0染色
[0032] 分別向?qū)φ战M的所述未進(jìn)行酒精處理的正常斑馬魚胚胎及模型組的所述斑馬魚 胚胎中加入三卡因甲磺酸直至溶液中所述三卡因甲磺酸濃度為〇. 003%，麻醉所述斑馬魚 胚胎后，分別用質(zhì)量濃度為4%的多聚甲醛（PFA)固定，室溫條件下固定2-4h，然后分別用 pH為7. 4的PBS緩沖液沖洗三次，每次2分鐘，然后分別將所述斑馬魚胚胎儲存在pH為 7. 4的PBS緩沖液中，4°C冰箱中保存；染色時(shí)，取出所述斑馬魚胚胎用pH為7. 4的PBS緩 沖液沖洗兩次，然后用巴斯德吸管將所述斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移至Corning Netwells (如果斑馬 魚胚胎粘住吸管，用含〇·〇5%吐溫-20的pH7.2-7.4的磷酸鹽緩沖液（PBST)反復(fù)輕微洗 滌幾次，需要最小化PBST的接觸時(shí)間），然后再用pH為7. 4的PBS快速洗五次，每次5分 鐘。用質(zhì)量濃度為85%的丙二醇處理所述斑馬魚胚胎lOmin，然后再用質(zhì)量濃度為100% 的丙二醇處理lOmin，徹底濾千水分后，將所述斑馬魚胚胎放入含油紅0(0il Red 0)的質(zhì) 量濃度為100%的丙二醇中，于室溫條件下輕微晃動過夜，然后用質(zhì)量濃度為100%的丙二 醇洗所述斑馬魚胚胎30min，然后再用質(zhì)量濃度為85%的丙二醇洗50min，最后用質(zhì)量濃度 為85%的丙二醇洗40min。向所述斑馬魚胚胎中加入等量的 PH為7. 4的PBS緩沖液，輕微 搖晃5min,直至均勻，然后轉(zhuǎn)移到pH為7. 4的roS中，洗15min后，再次用pH為7. 4的PBS 洗5min，將所述斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移回玻璃管中（如果胚胎粘住吸管，用〇· 〇5%的PBST反復(fù)輕 微洗滌幾次，需要最小化PBST的接觸時(shí)間），用PH為7. 4的PBS快速洗5min,然后加入適 量80%甘油，室溫儲存。分別從對照組的所述未進(jìn)行酒精處理的正常斑馬魚胚胎及模型組 的所述斑馬魚胚胎中隨機(jī)挑選10-20條，及時(shí)用顯微鏡觀察所述斑馬魚胚胎的肝臟脂肪染 色情況（肝臟脂肪滴數(shù)多3評判為脂肪肝），并做好記錄。
[0033]斑馬魚胚胎肝臟大小及卵黃吸收的顯微鏡拍照及測定
[0034]將肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎直接放置于顯微鏡下觀察肝臟及 卵黃大小，并拍照記錄和保存圖片。然后用圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算肝臟大小及卵 黃吸收情況。
[0035] 斑馬魚胚胎的肝臟病理切片：
[0036] 分別取對照組的所述未進(jìn)行酒精處理的正常斑馬魚胚胎及模型組的所述斑馬魚 胚胎置于Bouin氏溶液中固定24-48h，然后將所述斑馬魚胚胎置于流水中沖洗約2h，隨后 經(jīng)過不同濃度的乙醇脫水（50%乙醇脫水2h以上，70%乙醇脫水2h以上，80%乙醇脫水 2h，90 %乙醇脫水1. 5h，95 %乙醇脫水1. 5h，無水乙醇脫水40min)，將脫水后的斑馬魚胚胎 使用體積比為1:1的乙醇：二甲苯處理lh，再用二甲苯處理lOmin，之后用體積比為1:1的 二甲苯：石賭浸泡lh，再用石錯(cuò)浸泡40min至lh,將所述斑馬魚胚胎從石蠟中取出，置于包 埋盒中，倒入石蠟，進(jìn)行包埋，然后在切片機(jī)上切片，切片厚度設(shè)置為4-8um。將切好的薄片 輕輕放入38°C水浴中，完全開展后，將它轉(zhuǎn)移至涂有甘油蛋白的載玻片上，放入60?的恒 溫箱中烘干約12h，取出所述載玻片先后經(jīng)二甲苯脫蠟lOmin，無水乙醇脫蠟lmin，95%乙 醇處理脫蠟lmin，90 %乙醇脫蠟lmin，80 %乙醇脫蠟lmin，70 %乙醇脫錯(cuò)lmin后，進(jìn)行蘇木 精-伊紅染色，具體染色步驟為：蘇木精染液染色lOmin，隨后分別用蒸餾水和鹽酸乙醇分 化清洗片刻，流水繼續(xù)沖洗lOmin以上，70%乙醇沖洗lmin， 8〇%乙醇沖洗lmin，95%乙醇 沖洗lmin，再在伊紅染液中染色lmin，進(jìn)入脫水階段，用95%乙醇脫水lmin，100%的無水 乙醇脫水lmin，二甲苯脫水5min，最后將中性樹膠滴于所述載玻片上，隨即將蓋玻片輕輕 放置于載玻片上，防止產(chǎn)生氣泡。10尾斑馬魚胚胎的切片，每尾隨機(jī)挑選10個(gè)切片，然后在 每個(gè)切片組織上隨機(jī)選取10個(gè)lOOumXIOOum的區(qū)域進(jìn)行肝臟細(xì)胞外形的顯微觀察，并記錄 相應(yīng)的結(jié)果。
[0037]斑馬魚胚胎酒精肝模型的肝臟面積、卵黃面積以及熒光表達(dá)信號強(qiáng)度的增加與油 紅染色及病理切片的相關(guān)性結(jié)果
[0038] 研究發(fā)現(xiàn)，與未進(jìn)行酒精處理的斑馬魚胚胎相比（對照組），實(shí)施例3制備的斑馬 魚胚胎酒精肝模型（模型組）的肝臟腫大倍數(shù)，卵黃吸收變慢倍數(shù)以及熒光讀數(shù)增加倍數(shù) 分別為1. 52±0. 22,3. 82±0. 46和1. 48±0. 27(見下表1)。而油紅染色及病理切片結(jié)果顯 示，油紅0染色陽性率（％)和病理切片不正常細(xì)胞百分比（％)分別從8. 1 土3. 2增加到 70. 2±8. 1和從3. 2±0. 8增加到60. 9±5. 2(見下表1)。上述結(jié)果表明，斑馬魚胚胎酒精 肝模型的肝腫大、卵黃吸收變慢、熒光讀數(shù)增加與油紅染色及病理切片結(jié)果相一致，從而驗(yàn) 證了斑馬魚胚胎酒精肝模型的肝腫大、卵黃吸收變慢、熒光讀數(shù)增加等簡易指標(biāo)可用于斑 馬魚胚胎酒精肝模型的檢測。
[0039] 表1.斑馬魚胚胎酒精肝模型的肝腫大、卵黃吸收變慢、熒光讀數(shù)增加與油紅染色 及病理切片結(jié)果
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 選取肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因成年斑馬魚進(jìn)行雌雄配對，按照常規(guī)方法進(jìn) 行自然交配，收集肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚卵，備用； (2) 將收集的魚卵用反滲透水沖洗，隨后轉(zhuǎn)移至魚水中養(yǎng)殖，并向所述魚水中加入 基于所述魚水的添加量為〇. 2-0. 4ppm的亞甲基藍(lán)，25-30°C培養(yǎng)，并向所述魚水中加入 0. 1-0. 3mM 1-苯基-2-硫脲，繼續(xù)培養(yǎng)至72hpf，隨機(jī)收集已孵化的斑馬魚胚胎，分為對照 組和模型組，備用； (3) 在96hpf時(shí)，向所述魚水中加入三卡因甲磺酸直至所述魚水中三卡因甲磺酸的濃 度為0. 002-0. 004%，麻醉所述胚胎斑馬魚； (4) 將模型組的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移入質(zhì)量濃度為1-3 %的乙醇溶液中，在密封條件下于 25-30°C繼續(xù)孵育24-40h ;另取對照組的斑馬魚胚胎轉(zhuǎn)移入水中，在密封條件下于25-30°C 繼續(xù)孵育24-40h，得到斑馬魚酒精肝檢測模型； (5) 取模型組和對照組的斑馬魚胚胎在熒光顯微鏡下測定肝臟及卵黃大小，對比模型 組和對照組的斑馬魚胚胎的肝臟面積、卵黃面積以及熒光表達(dá)信號強(qiáng)度，若所述模型組的 肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信號強(qiáng)度均大于對照組的，則所述斑馬魚胚胎酒精 肝高通量檢測模型構(gòu)建成功；反之，則不成功。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特征在 于，在所述步驟（3)中，在制備所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型過程中所使用的乙 醇的質(zhì)量濃度為2%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特征 在于，在所述步驟（3)中，所述胚胎斑馬魚在28°C培養(yǎng)箱中孵育32h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，在所述步驟（3)中，向魚水中加入三卡因甲磺酸直至所述魚水中三卡因甲磺酸濃 度為 0· 003%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，在所述步驟（2)中，所采用的亞甲基藍(lán)基于所述魚水的添加量為0.3ppm。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，在所述步驟（2)中，向所述魚水中加入1-苯基-2-硫脲0. 2mM。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，在所述步驟（1)中，在所述成年肝臟特異表達(dá)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚以雌雄比 為1:1配對進(jìn)行交配，并以產(chǎn)卵開始計(jì)時(shí)，在30分鐘內(nèi)收集所述肝臟特異表達(dá)綠色熒光的 轉(zhuǎn)基因斑馬魚魚卵。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的建立方法制備得到所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量 檢測模型。
9. 一種權(quán)利要求8所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型用于評價(jià)或篩選防治酒 精肝藥物的用途。
10. -種利用權(quán)利要求8所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型篩選防治酒精肝藥 物的方法，其特征在于，具體包括如下步驟： 1)取所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型，并向其中加入濃度1-25 μ Μ的待測化合 物，于25-30°C恒溫條件下培養(yǎng)36-60h，得到給藥斑馬魚模型； 2)將所述給藥斑馬魚進(jìn)行分析，計(jì)算所述給藥斑馬魚的肝臟和卵黃的面積，并對其熒 光表達(dá)信號強(qiáng)度進(jìn)行讀數(shù)，若所述給藥斑馬魚的肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信 號強(qiáng)度的數(shù)值相比所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的降低10-30%，則所述待測 化合物具有防治酒精肝的作用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的篩選防治酒精肝藥物的方法，其特征在于，具體包括如下 步驟： 1) 取所述斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型，并向其中加入濃度10 μ Μ的待測化合 物，于28°C恒溫條件下培養(yǎng)48h，得到給藥斑馬魚； 2) 將所述給藥斑馬魚進(jìn)行分析，計(jì)算所述給藥斑馬魚的肝臟和卵黃的面積，并對其熒 光表達(dá)信號強(qiáng)度進(jìn)行讀數(shù)，若所述給藥斑馬魚的肝臟的面積、卵黃的面積以及熒光表達(dá)信 號強(qiáng)度的數(shù)值相比所述的斑馬魚胚胎酒精肝高通量檢測模型的降低20%，則所述待測化合 物具有防治酒精肝的作用。
【文檔編號】G01N21/64GK104297222SQ201410548844
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】陳志亮, 羅志毅, 殷婷婷, 徐毅敏, 鄭玉清 申請人:漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司