專利名稱：一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法
一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米材料毒性測試技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚 胚胎模型測試納米材料毒性的方法。
背景技術(shù)：
納米材料是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的新型材料，它既不同于微觀原子、分 子，也不同于宏觀物質(zhì)的超常規(guī)特性，常定義為在某一維度上尺寸在Inm IOOnm內(nèi)的 顆粒狀、層狀材料，它們的尺寸界于微晶材料和原子團(tuán)簇之間。目前國內(nèi)外應(yīng)用較多的 納米材料主要有碳納米材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、納米氧化物(二氧化鈦、二氧化硅、氧化 鋅、氧化鋁)和納米鐵的化合物等。隨著規(guī)?；a(chǎn)和納米產(chǎn)品的普及，人群的職業(yè)接 觸和環(huán)境暴露的機(jī)會(huì)將大大增高。納米材料將進(jìn)入我們的土壤、空氣和水環(huán)境，進(jìn)而不 可避免地進(jìn)入人體。納米材料的安全性評(píng)價(jià)和危險(xiǎn)性評(píng)定問題已經(jīng)成為21世紀(jì)毒理學(xué)的 新課題。目前國內(nèi)外對(duì)納米材料毒性的研究主要集中在體外細(xì)胞以及活體動(dòng)物上。體外 細(xì)胞對(duì)材料敏感性強(qiáng)，且試驗(yàn)結(jié)果有較大的重復(fù)性。但由于體內(nèi)與體外的差異性，不能 很好的描述材料的體內(nèi)毒性；活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般試驗(yàn)周期長、方法較繁瑣。而斑馬魚 作為模式生物具有更多的優(yōu)勢斑馬魚產(chǎn)卵量大、易收集、飼料簡單，已經(jīng)成為一些生 態(tài)毒理標(biāo)準(zhǔn)的推薦測試物種，用途十分廣泛；斑馬魚體型小，管理成本低，早期胚胎透 明，易于觀察，其器官與人器官在結(jié)構(gòu)、生理、分子水平等方面驚人的相似，用來評(píng)估 納米材料對(duì)于人的體內(nèi)毒性十分適合。近年來培育出的斑馬魚flil EGFP品系，其胚胎 的幾乎整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)可以在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，使得試驗(yàn)結(jié)果可視化，用來評(píng) 價(jià)納米材料的毒性更具優(yōu)勢。中國專利公開號(hào)CN101481651涉及金屬納米材料毒性檢測板及其檢測方法，包 括基底、板蓋和檢測池，其特征在于基底為矩形體容器，在基底內(nèi)部底面上設(shè)有若 干條垂直定位柱使得檢測池的邊沿定位于基底，板蓋的四周設(shè)有扣邊以扣緊基底邊沿； 本發(fā)明所述方法充分考慮到了修飾分子在體內(nèi)的可能存在的降解和代謝因素，通過雙步 檢測法確認(rèn)金屬納米顆粒的細(xì)胞毒性級(jí)別，使今后選擇合適的金屬納米顆粒及其修飾分 子都變得標(biāo)準(zhǔn)化、統(tǒng)一化，易于重復(fù)和相互比較。中國專利公開號(hào)CN101487040涉及檢測納米材料細(xì)胞毒性的方法，包括將待 檢測細(xì)胞種在底部帶有微電子傳感器的若干個(gè)孔板上，然后，將孔板放在細(xì)胞分析系統(tǒng) 的檢測裝置上；監(jiān)測細(xì)胞生長曲線，以得到細(xì)胞與孔板的微電極表面貼壁或生長情況； 在細(xì)胞貼壁2 30小時(shí)后，加入經(jīng)滅菌處理過的納米材料的培養(yǎng)液或者緩沖液，繼續(xù)監(jiān) 測細(xì)胞生長曲線，本發(fā)明的檢測納米材料對(duì)細(xì)胞毒性方法的優(yōu)點(diǎn)是全過程自動(dòng)、實(shí)時(shí) 監(jiān)測；無需標(biāo)記；對(duì)細(xì)胞無創(chuàng)傷，該方法可用于檢測多個(gè)對(duì)象，具有體積小、試樣用量 少，成本低廉、檢測裝置操作簡單、方便，可廣泛用于高通量、高靈敏度的碳納米材料 毒性方面的檢測，加快了分析速度，并且易于實(shí)現(xiàn)在線控制和檢測自動(dòng)化。
本發(fā)明首次使用flil EGFP品系斑馬魚胚胎模型檢測納米材料的體內(nèi)毒性，該 模型比以往的檢測模型更簡單、經(jīng)濟(jì)、直觀、周期短，可以評(píng)價(jià)納米材料的安全性以及 進(jìn)一步的機(jī)理研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明 的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型 測試納米材料毒性的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其具體步驟為(1)向受精6 7小時(shí)的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中加入待測納米材料試液，在人工氣 候箱中培養(yǎng)至72hpf或96hpf;其中，hpf表示受精后多少小時(shí)；所述的待測納米材料為任一可能具有生物毒性的納米粒徑物質(zhì)，包括碳納米材 料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、納米氧化物如二氧化鈦、二氧化硅；(2)將72hpf或96hpf將胚胎取出，用體積比為4%多聚甲醛固定24 30h，PBS 緩沖液沖洗2 4次，24 48h內(nèi)固定在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察血管；所述的PBS緩沖液為為磷酸鹽緩沖液，其原料的組份為NaCl 8g，KC10.2g， KH2PO4 0.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超純水至 lOOOmL，pH 為 7.4 ；(3)根據(jù)熒光顯微鏡采集的圖像，判斷所述納米材料是否引起血管損傷；其 中與對(duì)照組正常發(fā)育的斑馬魚胚胎的血管比較，斑馬魚血管表現(xiàn)出斷裂、缺失、交錯(cuò) 及分布間距過大等現(xiàn)象，為具有血管損傷；斑馬魚血管沒有表現(xiàn)出斷裂、缺失、交錯(cuò)， 分布間距相似，為沒有血管損傷；其中在所述的步驟(1)中，所述的斑馬魚胚胎為轉(zhuǎn)基因斑馬魚(flil EGFP品 系，其胚胎的幾乎整個(gè)循環(huán)系統(tǒng)可以在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光)所產(chǎn)；所述的步驟(1)還包括如下步驟在加入納米材料試液的同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)，在 胚胎發(fā)育的過程中進(jìn)行對(duì)比觀察，記錄胚胎死亡、畸形、孵化等指標(biāo)，并及時(shí)清除死亡 胚胎以避免感染其他胚胎引起死亡；在所述的步驟(1)中，加入待測納米材料試液后，28°C下以光照黑暗= 14h IOh持續(xù)培養(yǎng)至72hpf或96hpf;在所述的步驟(2)中，將胚胎浸在體積比為4%的多聚甲醛前，將胚胎周圍的待 測液體盡量清除干凈；在所述的步驟(2)中，PBS緩沖液沖洗時(shí)每次五分鐘，沖洗三次，將胚胎表面的 多聚甲醛沖洗干凈，以免影響熒光顯微鏡下觀察效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是(1)本發(fā)明的原材料易得，斑馬魚繁殖速度快，產(chǎn)卵量大、易收集，飼養(yǎng)簡單， 管理成本低，是一種理想的脊椎動(dòng)物模式生物；(2)本發(fā)明的待測納米材料給藥方式簡單、用量少，可將納米材料直接加入到胚 胎培養(yǎng)液中，在96孔板中每孔只需加入200 μ L ；(3)本發(fā)明的檢測方法簡便，試驗(yàn)周期短，加入待測納米材料后經(jīng)過培養(yǎng)、固 定，在第四天即可進(jìn)行血管觀察；
(4)本發(fā)明的應(yīng)用前景廣泛，直接使用可以在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光的 flil:EGFP品系斑馬魚，避免了染色步驟，試驗(yàn)過程更加簡單，對(duì)快速評(píng)價(jià)納米材料安全 性具有重要意義。
具體實(shí)施方式以下提供 本發(fā)明一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法的具 體實(shí)施方式。實(shí)施例1一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試CdSe量子點(diǎn)納米材料毒性的方法，具體步 驟為(1)健康性成熟的flil EGFP品系斑馬魚按雌雄1 1的比例放入孵化箱內(nèi)混 養(yǎng)，胚胎由清晨雌雄魚交配獲得，燈亮0.5h后開始收集，胚胎收集后，經(jīng)清洗，然后移 入斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中，去除未受精卵、分裂不規(guī)則或卵膜受損傷的卵，選取正常分裂 受精卵，進(jìn)行毒性試驗(yàn)；還包括如下步驟在加入納米材料試液的同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)，在 胚胎發(fā)育的過程中進(jìn)行對(duì)比觀察，記錄胚胎死亡、畸形、孵化等指標(biāo)，并及時(shí)清除死亡 胚胎以避免感染其他胚胎引起死亡；(2)CdSe量子點(diǎn)溶液用胚胎培養(yǎng)液(60mg/L海鹽溶液)配制，其中，海鹽為 0.03g,超純水500mL;將胚胎浸在體積比為4%的多聚甲醛前，將胚胎周圍的待測液體
盡量清除干凈；(3)胚胎在培養(yǎng)皿中(對(duì)照組60mg/L海鹽溶液和量子點(diǎn)溶液0.15、1.35、 4.05mg/L)放于28°C光照培養(yǎng)箱中以光照黑暗=14h IOh持續(xù)培養(yǎng)至第三天(或第四 天)；(4)第三天(或第四天)時(shí)取出胚胎并用超純水將胚胎表面的液體清除干凈，用 體積比為4%多聚甲醛固定24h;用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗胚胎，將胚胎表面的多聚 甲醛沖洗干凈；所述的PBS緩沖液為為磷酸鹽緩沖液，其原料的組份為NaCl 8g，KCl 0.2g, KH2PO4 0.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超純水至 lOOOmL，pH 值為 7.4 ；(5)在熒光顯微鏡下觀察血管，采集圖像，通過與對(duì)照組正常發(fā)育的斑馬魚胚胎 的血管圖像比較，加入量子點(diǎn)的斑馬魚胚胎血管表現(xiàn)出斷裂、缺失、交錯(cuò)及分布間距過 大等現(xiàn)象，認(rèn)為具有血管損傷；斑馬魚血管沒有斷裂、缺失、交錯(cuò)，分布間距相似，認(rèn) 為沒有血管損傷。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也 應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其特征在于，具體步 驟為(1)向受精6 7小時(shí)的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中加入待測納米材料試液，在人工氣候箱 中培養(yǎng)至72hpf或96hpf，hpf表示受精后多少小時(shí)；(2)將72hpf或96hpf將胚胎取出，用體積比為4%多聚甲醛固定24 30h，PBS緩 沖液沖洗2 4次，24 48h內(nèi)固定在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察血管；(3)根據(jù)熒光顯微鏡采集的圖像，判斷所述納米材料是否引起血管損傷；其中與 對(duì)照組正常發(fā)育的斑馬魚胚胎的血管比較，斑馬魚血管表現(xiàn)出斷裂、缺失、交錯(cuò)及分布 間距過大現(xiàn)象，為具有血管損傷；斑馬魚血管沒有表現(xiàn)出斷裂、缺失、交錯(cuò)，分布間距 相似，為沒有血管損傷。
2.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步驟(1)中，所述的待測納米材料為任一可能具有生物毒性的納米 粒徑物質(zhì)，包括碳納米材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、納米氧化物。
3.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步驟(1)中，所述的斑馬魚胚胎為轉(zhuǎn)基因斑馬魚所產(chǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，所述的步驟(1)還包括如下步驟在加入納米材料試液的同時(shí)做對(duì)照試驗(yàn)， 在胚胎發(fā)育的過程中進(jìn)行對(duì)比觀察，記錄胚胎死亡、畸形、孵化指標(biāo)，并及時(shí)清除死亡 胚胎以避免感染胚胎弓I起死亡。
5.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法， 其特征在于，在所述的步驟(1)中，加入待測納米材料試液后，28°C下以光照黑暗= 14h IOh持續(xù)培養(yǎng)至72hpf或96hpf。
6.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步驟(2)中，所述的PBS緩沖液為磷酸鹽緩沖液。
7.如權(quán)利要求6所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，所述的磷酸鹽緩沖液，其原料的組份為NaCl 8g，KC10.2g，KH2P040.24g, Na2HPO4 · 12H20 3.62g,加超純水至 lOOOmL，pH 值為 7.4。
8.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步驟(2)中，將胚胎浸在體積比為4%的多聚甲醛前，將胚胎周圍的 待測液體清除干凈。
9.如權(quán)利要求1所述的一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，其 特征在于，在所述的步驟(2)中，PBS緩沖液沖洗時(shí)每次五分鐘，沖洗三次，將胚胎表面 的多聚甲醛沖洗干凈。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型測試納米材料毒性的方法，具體步驟為(1)向受精6～7小時(shí)的斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中加入待測納米材料試液，在人工氣候箱中培養(yǎng)至72hpf或96hpf；(2)將72hpf或96hpf將胚胎取出，用體積比為4％多聚甲醛固定24～30h，PBS緩沖液沖洗2～4次，24～48h內(nèi)固定在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察血管；(3)根據(jù)熒光顯微鏡采集的圖像，判斷所述納米材料是否引起血管損傷。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)原材料易得，待測納米材料給藥方式簡單、用量少，檢測方法簡便，試驗(yàn)周期短，應(yīng)用前景廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/00GK102023199SQ200910195538
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月11日
發(fā)明者劉莉莉, 孫雪, 張衛(wèi), 徐圣友, 林匡飛, 殷曉蕾, 苗優(yōu)娜, 藍(lán)閩波, 趙宇俠, 陸強(qiáng) 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)