專利名稱：上轉(zhuǎn)熒光定量afp免疫層析試紙的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種AFP免疫層析試紙的制作方法，具體為一種 上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制作方法，以及這種AFP免疫層 析試紙的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外原發(fā)性肝 癌的發(fā)病率有不斷升高的趨勢(shì)，且其起病隱匿性強(qiáng)，早期癥狀不明顯， 一旦出現(xiàn)臨床癥狀多屬晚期。因此迫切需要一種快速準(zhǔn)確診斷原發(fā)性 肝癌的檢測(cè)方法。甲胎蛋白是一種分子量為70kDa的胚胎性糖蛋白， 胚胎時(shí)期可能起著與蛋白相似的作用，成人血清中AFP含量甚微。 大約90%的原發(fā)性肝癌患者血清AFP含量升高，而且其含量與疾病 的變化密切相關(guān)。因此，血清AFP含量測(cè)定成為原發(fā)性肝癌診斷的 重要指標(biāo)。
一直以來(lái)，國(guó)內(nèi)外普遍采用ELISA法測(cè)定血清AFP含量，但該 方法操作復(fù)雜，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，且對(duì)操作人員和環(huán)境也有一定的要求， 普遍應(yīng)用受限?，F(xiàn)有的膠體金免疫層析方法以其簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)勢(shì)已 經(jīng)在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用。它是以微孔膜為固相載體，包
4被目標(biāo)物抗原或抗體，加入待測(cè)樣品后，經(jīng)微孔膜的滲濾作用和毛細(xì) 虹吸作用使樣品中目標(biāo)物與膜上的抗原或抗體結(jié)合，通過(guò)肉眼觀察膠 體金的顏色來(lái)標(biāo)示反應(yīng)結(jié)果的。但是膠體金技術(shù)也有其局限性，檢測(cè) 靈敏度較低，難以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，而且目視檢測(cè)使檢測(cè)結(jié)果不易記錄 和保存。
上轉(zhuǎn)熒光顆粒是由稀土金屬元素?fù)诫s于晶體的晶格中構(gòu)成的納 米顆粒，在紅外線激發(fā)下可發(fā)射不同波長(zhǎng)的可見(jiàn)光。作為標(biāo)記材料， 上轉(zhuǎn)熒光顆粒與膠體金相比擁有無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)其獨(dú)特的上轉(zhuǎn)熒光 特性，使檢測(cè)無(wú)本底干擾，就定性分析而言，靈敏度可達(dá)膠體金的 100倍。同時(shí)其發(fā)光性能穩(wěn)定，不易淬滅，可用于多重、定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙 的制作方法，以解決現(xiàn)有的ELISA法測(cè)定血清AFP含量，操作復(fù)雜， 反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且對(duì)操作人員和環(huán)境也有一定的要求，普遍應(yīng)用受限等 諸多問(wèn)題。
本發(fā)明的另一目的是為了提供這種AFP免疫層析試紙的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。 一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備方法，具體步驟為
(1)上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面硅化 取5-50mg上轉(zhuǎn)熒光顆粒，加入到300-800mL乙醇與水的混合反 應(yīng)液(乙醇分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)》99.7%， V乙醇:V水-10 1:1)，超聲處理使反應(yīng)體系混合均勻，在15-5(TC水浴中攪拌至平衡，再向其中 加入0.1-lmL正硅酸乙酯(TEOS),繼續(xù)反應(yīng)3-10h，離心洗滌；
(2) 上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面氨基化 取上述表面硅化的上轉(zhuǎn)熒光顆粒，加入30 100mL甲醇和丙三
醇組成的混合溶液(V甲醇:V丙三醇-1:1 50)，超聲分散，然后向其中加 入10-1000uLAEAPS (分析純純品)，15-50。C恒溫下攪拌5 10h,用 乙醇離心洗滌，干燥保存；
(3) 上轉(zhuǎn)熒光顆粒表面連接抗體
向分散在磷酸緩沖液(PB)中的表面修飾氨基的上轉(zhuǎn)熒光顆粒 中加入50 1000uL25。/。的戊二醛，反應(yīng)2-5h，離心將多余的戊二醛 洗去，重新分散在PB中，然后加入10 500uL的抗體，4"C過(guò)夜， 離心洗滌，最終保存在PB (含0.1。/。BSA， 0.1%Tween20)中。
一種上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制作方法，具體步驟為 將上述上轉(zhuǎn)熒光顆粒標(biāo)記的抗體復(fù)合物噴涂在結(jié)合墊上，相應(yīng)的另一 抗體及二抗分別噴涂在硝酸纖維膜(NC膜)上形成T線和C線；根 據(jù)免疫層析的基本原理，將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼 在帶有粘合劑的底板上，并用切刀切割成4cm的試紙條。
本發(fā)明的樣品檢測(cè)及定量檢測(cè)方法的建立將試紙條的樣品墊端 插入待測(cè)樣品液，10-30min后取出，通過(guò)熒光測(cè)量?jī)x判讀結(jié)果。
陽(yáng)性檢測(cè)中試紙條的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶上均有熒光產(chǎn)生，其所對(duì)應(yīng) 的信號(hào)強(qiáng)度分別為T(mén)和C,檢測(cè)帶上熒光強(qiáng)度T與質(zhì)控帶上熒光強(qiáng)度 C的比值，即T/C與樣品中含有的被檢測(cè)物濃度成正比。陰性樣品檢測(cè)時(shí)，由于樣品中不含有被檢測(cè)物，因而重新溶解游離，隨樣品基質(zhì) 進(jìn)入膜的只有上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物，由此，只在質(zhì)控帶上發(fā)生 該復(fù)合物與二抗的免疫反應(yīng)，這樣陰性檢測(cè)中在熒光測(cè)量?jī)x的檢測(cè) 下，只有質(zhì)控帶上產(chǎn)生熒光。
將抗原標(biāo)準(zhǔn)品配制成具有一定濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行
免疫層析，通過(guò)熒光測(cè)量?jī)x讀出T/C值，繪制抗原濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 待測(cè)抗原用上述的試紙進(jìn)行免疫層析，由該標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求得實(shí)際濃 度。
本發(fā)明通過(guò)上轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記和雙抗夾心免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)血 清中AFP的含量。建立AFP上轉(zhuǎn)熒光免疫層析技術(shù)，用于原發(fā)性肝 癌的早期診斷，具有靈敏性高，準(zhǔn)確性好，可實(shí)現(xiàn)定量分析等優(yōu)勢(shì)， 將進(jìn)一步拓展AFP免疫層析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。 1、制備上轉(zhuǎn)熒光顆粒一甲胎蛋白(AFP)抗體復(fù)合物-利用已經(jīng)過(guò)表面氨基化的上轉(zhuǎn)熒光顆粒與AFP抗體進(jìn)行連接，
具體實(shí)施步驟如下
取5mg氨基化的UCP加入到3mL0.03 mol/L的PB(PH-7.2)中:
充分混勻。
向上述體系中加入250uL25。/。的戊二醛，室溫下反應(yīng)3h。 離心洗去多余的戊二醛，重新分散在5mL0.03 mol/LPB中。再向其中加入150uLAFP抗體，4"C反應(yīng)3h。 4t:離心洗滌數(shù)次，保存于0.03 mol/L PB (含0.1%BSA， 0.1o/oTween20)中。
2、 制備雙抗體夾心AFP抗原檢測(cè)試紙
1) 樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊材料，剪成
1.5x30.0cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液(0.03mol/L PB (PH=7.2)，含有5mg/mlBSA， 0.1%TritonX-100)中浸泡30min， 37
'C烘干備用。
2) 結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將其剪 成1.0x30.0cm規(guī)格的條帶，將實(shí)施例1中制備的FITC- AFP抗體復(fù) 合物離心，在沉降物中加入0.03mol/LPB (PH=7.2),含1%蔗糖， 1%BSA)，充分混勻，加于該條帶上，37"C烘干。
3) NC的制備將NC膜剪切成2.5x30.0cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn) 樣儀在NC膜上不同位置分別噴點(diǎn)AFP單抗和羊抗鼠IgG抗體,作為 檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，37"C烘干。
4) 免疫層析試紙條的組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊 依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成4cm寬的試紙條。
3、 定量檢測(cè)AFP抗原
l)將lmg/mL的AFP抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液配置 系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品0ng/ml， 10ng/ml， 20ng/ml， 50ng/ml， 100ng/ml，200ng/ml， 300ng/ml， 400ng/ml， 500ng/ml， 600ng/ml， 700ng/ml， 訓(xùn)ng/ml，卯0ng/ml， 1000ng/ml。
2) 將試紙條的樣品墊端分別插入上述濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品中，15min 后取出，通過(guò)熒光測(cè)量?jī)x檢測(cè)T線和C線區(qū)域的熒光強(qiáng)度的比值(每 個(gè)樣品分別用3個(gè)試紙條檢測(cè)3次，取平均值)，繪制抗原濃度的標(biāo) 準(zhǔn)曲線。
3) 利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)臨床血清樣品，通過(guò)判讀T/C值，求 得樣品中抗原的濃度。
權(quán)利要求
1、一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面硅化取5-50mg上轉(zhuǎn)熒光顆粒，加入到300-800mL乙醇與水的混合反應(yīng)液，超聲處理使反應(yīng)體系混合均勻，在15-50℃水浴中攪拌至平衡，再向其中加入0.1-1mL正硅酸乙酯(TEOS)，繼續(xù)反應(yīng)3-10h，離心洗滌；(2)上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面氨基化取上述表面硅化的上轉(zhuǎn)熒光顆粒，加入30～100mL甲醇和丙三醇組成的混合溶液，超聲分散，然后向其中加入10-1000uLAEAPS，15-50℃恒溫下攪拌5～10h，用乙醇離心洗滌，干燥保存；(3)上轉(zhuǎn)熒光顆粒表面連接抗體向分散在磷酸緩沖液(PB)中的表面修飾氨基的上轉(zhuǎn)熒光顆粒中加入一定量戊二醛，反應(yīng)2-5h，離心將多余的戊二醛洗去，重新分散在PB中，然后加入一定量的抗體，4℃過(guò)夜，離心洗滌，最終保存在PB(含0.1％BSA，0.1％Tween20)中。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備 方法，其特征在于步驟(1)中所述的乙醇為分析純，乙醇與水的 體積比為10-1: 1。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟(2)中甲醇和丙三醇混合容顏的配比為V甲醇:V丙三醇=1:1-50。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備 方法，其特征在于步驟(3)中，所述的加入戊二醛的量為50-1000uL 25%。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種上轉(zhuǎn)熒光顆粒-抗體復(fù)合物的制備 方法，其特征在于步驟(3)中，加入的抗體為10-500uL。
6、 一種上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制作方法，其特征在 于具體步驟為將權(quán)利要求1所制得的上轉(zhuǎn)熒光顆粒標(biāo)記的抗體復(fù)合物噴涂在結(jié)合墊上，相應(yīng)的另一抗體及二抗分別噴涂在硝酸纖維膜上形成T線和C線；根據(jù)免疫層析的基本原理，將吸水紙、NC膜、 結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并用切刀切割成4cm 的試紙條。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2的一種上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制 作方法，其特征在于它應(yīng)用于定量檢測(cè)AFP抗原。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種AFP免疫層析試紙的制作方法，具體為一種上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制作方法，以及這種AFP免疫層析試紙的應(yīng)用。1)上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面硅化；2)上轉(zhuǎn)熒光顆粒的表面氨基化；3)上轉(zhuǎn)熒光顆粒表面連接抗體；4)上轉(zhuǎn)熒光定量AFP免疫層析試紙的制作；5)樣品檢測(cè)及定量檢測(cè)方法的建立。本發(fā)明通過(guò)上轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記和雙抗夾心免疫層析技術(shù)定量檢測(cè)血清中AFP的含量。建立AFP上轉(zhuǎn)熒光免疫層析技術(shù)，用于原發(fā)性肝癌的早期診斷，具有靈敏性高，準(zhǔn)確性好，可實(shí)現(xiàn)定量分析等優(yōu)勢(shì)，將進(jìn)一步拓展AFP免疫層析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/533GK101644707SQ200910195150
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2009年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者蕾 周, 楊瑞馥, 沈鶴柏, 趙露晶 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)