一種蘋果酸脫氫酶基因rkmdh2及其重組表達載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]以紅冬抱酵母kratochvilovae)YM25235 的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，擴增得到編碼蘋果酸脫氫酶(MDH)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體后誘導(dǎo)表達，親和層析法純化后得到純酶，并對該酶進行了酶活測定及酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)研究，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布于生物體內(nèi)，是一種活性非常強的酶，它催化草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的相互轉(zhuǎn)化反應(yīng)，與二核苷酸輔酶的氧化還原相關(guān)。草酰乙酸鹽在許多代謝途徑中都有重要作用，包括三羧酸循環(huán)、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原異生等，并維持氧化還原平衡，還能促進胞質(zhì)和亞細胞器代謝物的交換。依生物體的功能不同、組織差異、細胞內(nèi)定位的不同其表達種類不同，MDH具有多種同工酶形式。胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(cMDH)存在于細胞胞質(zhì)內(nèi)，擔負著將NADH轉(zhuǎn)入線粒體的重任，并且還對調(diào)控三羧酸循環(huán)有作用，同時cMDH還是核酸通路(NACh)復(fù)合體的一個組成部分
蘋果酸脫氫酶(MDH)廣泛分布在動物組織、微生物和植物中。它是一種活性最強的酶，根據(jù)亞細胞定位，蘋果酸脫氫酶可分為5種類型，存在于乙醛酸體、線粒體、過氧化物體、葉綠體、細胞漿以及錐蟲甘油體內(nèi)。MDH為多聚體酶，是由相同或相似亞基組成的二聚體或四聚體，亞基的分子量為30-35kDa，MDH在醫(yī)學(xué)方面也引起越來越多的關(guān)注如利用基因工程疫苗預(yù)防人體帶絳蟲病已是備受關(guān)注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學(xué)分析，預(yù)測到胞漿型MDH是一個潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用前景提供了重要的線索，在臨床診斷中用于多酶分析及疾病的早期診斷，例如用于診斷DIC (彌散性血管內(nèi)凝血)，心肌梗塞，急慢性肝炎等。在食品領(lǐng)域，蘋果酸脫氫酶用于有機酸含量的測定，如L-蘋杲酸、醋酸、檸檬酸等物質(zhì)的測定，應(yīng)用前景廣泛。利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸酶。
[0003]總之，MDHs作為生物體中樞代謝途徑的關(guān)鍵酶，國內(nèi)外對其己進行了較為廣泛的研究，MDHs同工酶正應(yīng)用于生物分類、物種分化、遺傳變異、物種雜交和個體發(fā)育等研究。因此深入了解MDHs的生理生化特性、結(jié)構(gòu)及功能、催化機制，對于酶重組蛋白的表達、純化及免疫特性分析，探討生物體中MDHs的代謝作用以及一些疾病的分子致病機制有著重要的意義。同時MDH的應(yīng)用研究也將會推動MDHs轉(zhuǎn)基因植物及手性藥物的進一步發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從紅冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分離的蘋果酸脫氫酶基因欣置扮么該基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或該核苷酸序列的片段，或與SEQ ID NO:1互補的核苷酸序列，該基因序列長為1008bp(堿基)，該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽或其片段。
[0005]本發(fā)明的另一目的是提供一種含有蘋果酸脫氫酶基因欣置%2的重組表達載體pET32aRKMDH2，該重組表達載體是將SEQ ID NO: 1所示基因直接與載體pET32a ( + )所構(gòu)建的重組表達載體。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供一種含有上述的蘋果酸脫氫酶基因欣或上述的重組表達載體的宿主表達細胞。
[0007]用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組載體優(yōu)化宿主細胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期收集菌體，用CaCl2、電穿孔等方法進行；當宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。
[0008]本發(fā)明提供的核苷酸序列是一種高效、特異性的蘋果酸脫氫酶基因，可以將其與載體連接后轉(zhuǎn)化至微生物細胞體內(nèi)生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有產(chǎn)物特異性高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)不受場地、氣候、季節(jié)的影響及利用不同的菌種和培養(yǎng)基適合開發(fā)商業(yè)化蘋果酸脫氫酶等優(yōu)點。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建特異性生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)蘋果酸脫氫酶，具有操作簡單、成本低、可行性高等優(yōu)點，為蘋果酸脫氫酶基因工程化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0009]圖1為利用本發(fā)明的紅冬孢酵母YM25235蘋果酸脫氫酶基因構(gòu)建的大腸桿菌重組表達質(zhì)粒pET32aRKMDH2質(zhì)粒圖譜；
圖2為本發(fā)明的蘋果酸脫氫酶基因銹導(dǎo)表達并純化后的SDS-PAGE分析圖，其中:1為蛋白電泳Marker ;2為轉(zhuǎn)化了 pET32a(+)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；3為轉(zhuǎn)化了 pET32aRKMDH2并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21總蛋白；4為純化的目的蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0011]實施例1:紅冬孢酵母蘋果酸脫氫酶基因RKMD_H
米用 OMEGA 試劑盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 從紅冬抱酵母{Rhodosporidiimkra toch vilo vae) YM25235 中提取總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Thermo Scientific Maxima HMinus First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，取1 μ 1為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)，設(shè)計引物(引物1和引物2)進行PCR擴增，反應(yīng)所用引物、組分和擴增條件如下:
引物 P1:RKMDH2F1: 5，-ATGGGCCTCAAGACTGCTGTTCT-3’ (SEQ ID NO:3)
引物 P2:RKMDH2R1: 5，-TCAGAGCTTGGAGCCCTGGATGA-3’ (SEQ ID N0:4)
PCR擴增體系(50 μ L)組成如下:
5 X Trans PFU Buffer10 μ L
dNTP (2.5 ymol/L)5 yL
cDNA1 μL
RKMDH2F1 (10 ymol/L)2 yL
RKMDH2R1 (10 ymol/L)2 yL Fast Pfu DNA polymerase (5U/μ L)2 μ L
無菌ddH20補足至50 μ L
擴增條件:94°C變性4min，再用94°C 45s、59°C 45s、72°C 1.5 min進行30個循環(huán)，最后72°C lOmin，反應(yīng)完后取產(chǎn)物1 μ L，然后在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中，進行電泳分析。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像確認片段大小正確后，用百泰克生物技術(shù)有限公司多動能DNA純化回收試劑盒回收目的片段，然后將PCR擴增得到的目的基因連接到pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB固體平板進行篩選，挑取平板上的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR篩選陽性克隆，然后送去上海生工測序。測序結(jié)果顯示，獲得一段1008bp長的序列，命名為欣么序列組成如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。通過核苷酸序列所編碼的氨基酸相似性搜索表明，該基因編碼的蛋白與真菌來源的蘋果酸脫氫酶序列相似，但不完全相同。
[0012]實施例2:重組表達質(zhì)粒pET32aRKMDH2的構(gòu)建
采用實施例1中的cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)所用引物組合、反應(yīng)組分和擴增條件如下:
引物 P1:RKMDH2F2: 5’ -CGCGGATCCATGGGCCTCAAGAC