專利名稱：：高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌和選育及發(fā)酵的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種新的微生物高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌和該菌株的選育和發(fā)酵。
背景技術(shù)：
：在我國，植物真菌病害居植物三大病害(細菌、真菌、病毒)之首，如不及時防治會給農(nóng)林業(yè)造成巨大損失。而目前植物真菌病害多采用化學(xué)農(nóng)藥進行防治，雖然化學(xué)農(nóng)藥見效快，但其作用時間短，對環(huán)境的污染嚴重，并且病原菌易對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，終將被其他高效、環(huán)保的藥物所替代。而微生物農(nóng)藥就是一種高效、環(huán)保的農(nóng)藥。我實驗室從土壤中分離得到一株利迪鏈霉菌菌株(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692，其發(fā)酵液有廣譜的抗真菌作用，但是出發(fā)菌株的生產(chǎn)能力太低，不能滿足實際生產(chǎn)的要求。因此亟需生產(chǎn)能力提高的抗真菌的菌株。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌。本發(fā)明的第二個目的是提供一種高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌的選育。本發(fā)明的第三個目的是提供一種高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌的發(fā)酵。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9CGMCCNO.3075。高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9CGMCCNO.3075的選育，是由如下步驟組成(1)出發(fā)菌株的自然選育于室溫下，將0.lmL的濃度為102108個/mL的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692單孢子懸浮液加到分離培養(yǎng)基平板上，用涂布棒把各平板涂勻，26°C30°C，培養(yǎng)，待平板上長出針尖大小的白色菌落時，將單菌落瓊脂塊挑取后進行搖瓶培養(yǎng)，再將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋IO倍后，采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，選擇抑菌效果好的菌株；(2)復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性篩選于室溫下，將所述步驟(1)制備的濃度為104108個/mL利迪鏈霉菌菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射20s60s，再用0.0010.OOOIM亞硝酸水溶液誘變處理25min，將處理后的的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有0.5ml、lml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于24°C28tV恒溫培養(yǎng)710天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9。所述利迪鏈霉菌單孢子懸浮液是用下述方法制成用45mL55mL的生理鹽水洗滌培養(yǎng)好的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)菌體斜面，并用接種環(huán)輕輕將孢子刮下，將洗滌液倒入裝有玻璃珠的250mL無菌三角瓶中，于搖床上29t:、210rpm振蕩3045min，將成團孢子打散，并用脫脂棉過濾，稀釋單孢子懸浮液至105106個/mL，然后將孢子懸浮液于28t:下放置15min，使孢子熱活化。所述步驟(2)優(yōu)選的是于室溫下，將所述步驟(1)制備的濃度為1(f個/mL利迪鏈霉菌菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射40s，再用0.0010.0001M亞硝酸水溶液誘變處理4min，將處理后的的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有l(wèi)ml利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于27°C，恒溫培養(yǎng)9天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋IO倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9。高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，是由如下步驟組成(1)搖瓶培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制搖瓶培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米槳310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；種子培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米槳310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米槳310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，泡敵18g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；(2)搖瓶培養(yǎng)將高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9CGMCCNO.3075接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的250mLlOOOmL搖瓶中，在2630°C，搖床轉(zhuǎn)速250280rpm的條件下，培養(yǎng)2080小時，獲得發(fā)酵液；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)獲得的10mL40mL發(fā)酵液接入90mL360mL的種子培養(yǎng)基中，在500mL2L大搖瓶中，在2535。C，搖床轉(zhuǎn)速為160300rpm條件下，培養(yǎng)2080小時，制得種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)，用下述方法之一種進行方法一①將所述種子培養(yǎng)液接入裝有14L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.53vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300600rpm，溫度為2535"C，用酸堿調(diào)節(jié)pH為49的條件下，培養(yǎng)2496小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；②在407(TC，超聲破碎2040min;方法二①將所述種子培養(yǎng)液或經(jīng)步驟(4)方法一①獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有1028L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.12.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300600rpm，溫度為2535。C，用酸堿調(diào)節(jié)pH49的條件下，添加120mL260mL的正己烷或正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)2496小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；②獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液在407(TC，超聲破碎2040min。6搖瓶培養(yǎng)基的配制優(yōu)選的是將淀粉7090g，葡萄糖710g，玉米漿45g，黃豆餅粉79g，NaCl0.30.5g，K2HP040.20.3g，MgS047H200.20.4g，CaC030.30.5g，加水定容至1升，調(diào)pH為57，滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基的配制優(yōu)選的是將淀粉5080g，葡萄糖8llg，玉米漿58g，黃豆餅粉912g，NaCl0.40.7g，K2HP040.20.4g，MgS047H200.30.6g，CaC030.50.8g，泡敵25g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌。所述步驟(2)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)選的是將高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL1000mL搖瓶中，在29t:，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm條件下，培養(yǎng)48小時，獲得發(fā)酵液；所述步驟(3)種子培養(yǎng)優(yōu)選的是將步驟(2)獲得的10mL發(fā)酵液接入90mL種子培養(yǎng)基中，在500mL2L大搖瓶中，在27°C，搖床轉(zhuǎn)速為230rpm的條件下，培養(yǎng)72小時，制得種子培養(yǎng)液。所述步驟(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)，方法一優(yōu)選的是①將所述種子培養(yǎng)液接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為2.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，溫度為28°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為5的條件下，培養(yǎng)48小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；②在6(TC，超聲破碎30min。所述步驟(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)，方法二優(yōu)選的是將2L從步驟(4)方法一①獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有18L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，溫度為29。C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為6的條件下，添加120mL260mL的正己烷或正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)72小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液。本發(fā)明的優(yōu)點高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9能夠在發(fā)酵液(包括發(fā)酵濾液和菌絲體)中產(chǎn)生大量的具有抗真菌活性的生物活性物質(zhì)，該物質(zhì)存在于菌絲體和除去菌絲體的發(fā)酵濾液中，其中以菌絲體的抑菌活性較高。其發(fā)酵液對立枯絲核菌也具有明顯的抑制作用，發(fā)酵48小時后發(fā)酵液稀釋50倍抑菌率達到97.8%。本發(fā)明采用自然選育與復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性兩步篩選?？拐婢锘钚晕镔|(zhì)生產(chǎn)菌的自身產(chǎn)物抗性選育，這種抗性突變株可保證在高濃度自身抗生素存在下，不僅菌體生長繁殖不受影響，而且抗真菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)量也能不斷累積。同時本發(fā)明確定了一種適合利迪鏈霉菌高產(chǎn)突變株E9生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝，包括種子和發(fā)酵培養(yǎng)基成分及配比的確定，5L發(fā)酵罐與30L發(fā)酵罐新的發(fā)酵控制工藝。新工藝的實施，提高了利迪鏈霉菌高產(chǎn)突變株E9的發(fā)酵水平。圖1為5L罐發(fā)酵液稀釋40倍抑菌效果圖，1-1為空白對照；1-2為5L罐發(fā)酵液稀釋40倍。圖2為30L罐發(fā)酵液稀釋50倍抑菌效果圖。2_1為空白對照，2-2為30L罐發(fā)酵液稀釋50倍。具體實施例方式本發(fā)明的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9CGMCCNO.3075，已于2009年5月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCCNO.3075。該菌株的形態(tài)特征，培養(yǎng)特征，分子生物學(xué)特性分析的結(jié)果，鑒定為利迪鏈霉菌。具體鑒定結(jié)果如下—.形態(tài)和生理生化特性1.在不同培養(yǎng)基上的生長特性培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素察氏瓊脂白色丁香棕色無葡萄糖天冬氨酸瓊脂無淺小米黃色無甘油天冬氨酸瓊脂白色乳白色無無機鹽淀粉瓊脂乳白色塵灰色無ISP-2瓊脂灰白色淺土黃色無燕麥瓊脂灰白色淺棕色無高氏一號瓊脂烏賊灰色土黃色及灰黑色無桑塔斯瓊脂白色桂皮淡棕色無2.顯微形態(tài)特性孢子絲不完全螺旋形、鉤狀、環(huán)狀；孢子橢圓形。3、生理生化特性特性結(jié)果特性結(jié)果特性結(jié)果碳源利用碳源利用(續(xù))碳源利用(續(xù)).葡萄糖+木糖葡萄糖酸鈉+半乳糖+L-阿拉伯糖+丙二酸鈉+w山梨糖一乳糖+丙酸鈉+棉籽糖淀粉+w檸檬酸鈉+鼠李糖一糖原+琥珀酸鈉+纖維二糖一肌醇+灑石酸鈉+松三糖+甘露醇+乙酸鈉+蔗糖+水楊苷蘋果酸鈉+8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>說明+:利用；+W:微弱利用；-不利用二.16SrRNA基因序列測定結(jié)果GCCCGGGAACCCAATCCGCACGTGTGCTCCTGTGAGACATCTCACTCCGGTGTACCCGTCAATCGACGTGGACACGCTTTCTTCACCGCTCCCCGGGCTTACGTATTATGAAAGAGGTCCCCACTGCCGTCGTCGCACACGGAGATTGCCCAC下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，由如下步驟組成(1)出發(fā)菌株的自然選育于室溫下，將0.lmL的濃度為107個/mL的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692單孢子懸浮液加到分離培養(yǎng)基平板上，然后用涂布棒涂勻，3(TC培養(yǎng)，待平板上長出針尖大小的白色菌落時，用內(nèi)徑為8mm的打孔器打孔，將單菌落瓊脂塊挑取后進行搖瓶培養(yǎng)，而后將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，選擇抑菌效果好的菌株作為下階段的出發(fā)菌株；(2)復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性篩選于室溫下，將制備好的濃度為107個/mL的步驟(1)獲得的優(yōu)化菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射40s，再用0.005M亞硝酸水溶液誘變處理4min，將處理后的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有l(wèi)mL的利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于27t:恒溫培養(yǎng)9天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9并傳代至穩(wěn)定。實施例2高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，由如下步驟組成(1)出發(fā)菌株的自然選育于室溫下，將O.lmL的濃度為1(f個/mL的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692單孢子懸浮液加到分離培養(yǎng)基平板上，然后用涂布棒涂勻，26t:培養(yǎng)，待平板上長出針尖大小的白色菌落時，用內(nèi)徑為8mm的打孔器打孔，將單菌落瓊脂塊挑取后進行搖瓶培養(yǎng)，而后將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，選擇抑菌效果好的菌株作為下階段的出發(fā)菌株；(2)復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性篩選于室溫下，將制備好的濃度為104個/mL的步驟(1)獲得的優(yōu)化菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射20s，再用0.0001M亞硝酸水溶液誘變處理5min，將處理后的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有含有0.5ml、lml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml的利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于26t:恒溫培養(yǎng)IO天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9并傳代至禾急定。實施例3高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，由如下步驟組成(1)出發(fā)菌株的自然選育于室溫下，將0.lmL的濃度為108個/mL的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692單孢子懸浮液加到分離培養(yǎng)基平板上，然后用涂布棒涂勻，2『C培養(yǎng)，待平板上長出針尖大小的白色菌落時，用內(nèi)徑為8mm的打孔器打孔，將單菌落瓊脂塊挑取后進行搖瓶培養(yǎng)，而后將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，選擇抑菌效果好的菌株作為下階段的出發(fā)菌株；(2)復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性篩選于室溫下，將制備好的濃度為108個/mL的步驟(1)獲得的優(yōu)化菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射60s，再用0.001M亞硝酸水溶液誘變處理2min，將處理后的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有含有l(wèi)ml、l.5ml、2ml、3ml的利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于2『C恒溫培養(yǎng)7天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋io倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9并傳代至穩(wěn)定。實施例4自然選育中雙層平板的制備底層鋪15mL下層培養(yǎng)基(斜面培養(yǎng)基)，將立枯絲核菌配成濃度為109個/mL的菌懸液，按每lOOmL培養(yǎng)基中加入lmL的量加入到冷卻至50°C左右的上層培養(yǎng)基中(PDA)，混勻后取5mL迅速鋪于己制備好的底層培養(yǎng)基上，制得雙層平板；杯碟法在平板上等距離放置3個牛津杯(高lOmm，內(nèi)徑6mm)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后滴加到牛津杯中，于27t:培養(yǎng)30小時，用直尺測定抑菌圈直徑，三次重復(fù)，取平均值。實施例5利迪鏈霉菌單孢子懸浮液的制備用45mL的生理鹽水洗滌培養(yǎng)好的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)菌體斜面，并用接種環(huán)輕輕將孢子刮下，將洗滌液倒入裝有玻璃珠的250mL無菌三角瓶中，于搖床上29°C、210rpm振蕩45min，將成團孢子打散，并用脫脂棉過濾，稀釋單孢子懸浮液至106個/mL，然后將孢子懸浮液于28t:下放置15min，使孢子熱活化。實施例6利迪鏈霉菌單孢子懸浮液的制備用55mL的生理鹽水洗滌培養(yǎng)好的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)菌體斜面，并用接種環(huán)輕輕將孢子刮下，將洗滌液倒入裝有玻璃珠的250mL無菌三角瓶中，于搖床上29°C、210rpm振蕩30min，將成團孢子打散，并用脫脂棉過濾，稀釋單孢子懸浮液至105個/mL，然后將孢子懸浮液于28t:下放置15min，使孢子熱活化。實施例7搖瓶發(fā)酵①搖瓶培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉70g，葡萄糖7g，玉米漿4g，黃豆餅粉7g，NaCl0.3g，K2HP040.2g，MgS047H200.2g，CaC030.3g，培養(yǎng)基用水配制并定容至1升，調(diào)pH為6，滅菌。②搖瓶培養(yǎng)將實施例1制備的高產(chǎn)利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，29t:，培養(yǎng)48小時，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，得搖瓶發(fā)酵液。實施例8搖瓶發(fā)酵①搖瓶培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉90g，葡萄糖10g，玉米漿10g，黃豆餅粉9g，NaCl0.5g，K2HP040.3g，MgS047H200.4g，CaC030.5g，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，調(diào)pH為6，滅菌。②搖瓶培養(yǎng)將實施例2制備的高產(chǎn)利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，26t:，培養(yǎng)80小時，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm，得搖瓶發(fā)酵液。實施例9搖瓶發(fā)酵①搖瓶培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉30g，葡萄糖5g，玉米漿3g，黃豆餅粉6g，NaCl0.2g，K2HP040.lg，MgS047H200.lg，CaC030.2g，培養(yǎng)基用水配制并定容至1升，調(diào)pH為5，滅菌。②搖瓶培養(yǎng)將實施例1制備的高產(chǎn)利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的1000mL搖瓶中，3(TC，培養(yǎng)20小時，搖床轉(zhuǎn)速為280rpm，得搖瓶發(fā)酵液。實施例10搖瓶發(fā)酵①搖瓶培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉100g，葡萄糖12g，玉米漿5g，黃豆餅粉13g，NaCl0.9g，K2HP040.8g，MgS047H200.8g，CaC030.9g，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，調(diào)pH為7，滅菌。②搖瓶培養(yǎng)將實施例3制備的高產(chǎn)利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，29t:，培養(yǎng)48小時，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，得搖瓶發(fā)酵液。實施例11種子培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)①種子培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉60g，葡萄糖9g，玉米漿6g，黃豆餅粉llg，NaCl0.2g，K2HP040.4g，MgS047H200.7g，CaC030.4g，pH為8，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②種子培養(yǎng)將制得的10mL搖瓶發(fā)酵液接入90mL種子培養(yǎng)基中，在1L大搖瓶中，27°C，培養(yǎng)72小時，搖床轉(zhuǎn)速為230rpm，制得種子培養(yǎng)液；(紅字是根據(jù)權(quán)利要求書增加的)實施例12種子培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)①種子培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉30g，葡萄糖12g，玉米漿3g，黃豆餅粉13g，NaCl0.3g，K2HP040.lg，MgS047H200.8g，CaC030.2g，pH為8，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②種子培養(yǎng)將制得的30mL搖瓶發(fā)酵液接入120mL種子培養(yǎng)基中，在500mL大搖瓶中，25t:，培養(yǎng)80小時，搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，制得種子培養(yǎng)液；(紅字是根據(jù)權(quán)利要求書增加的)實施例13種子培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)①種子培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉100g，葡萄糖5g，玉米漿10g，黃豆餅粉6g，NaCl0.9g，K2HP040.8g，MgS047H200.lg，CaC030.9g，pH為8，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②種子培養(yǎng)將制得的40mL搖瓶發(fā)酵液接入300mL種子培養(yǎng)基中，2L大搖瓶中，35°C，培養(yǎng)20小時，搖床轉(zhuǎn)速為300rpm，制得種子培養(yǎng)液；(紅字是根據(jù)權(quán)利要求書增加的)實施例14發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉50g，葡萄糖8g，玉米漿5g，黃豆餅粉9g，NaCl0.4g，K2HP040.2g，MgS047H200.3g，CaC030.5g，泡敵2g，pH為6，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②培養(yǎng)將實施例11制得的種子培養(yǎng)液接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為2.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，溫度為28°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為5的條件下，培養(yǎng)48小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液。實施例15發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉80g，葡萄糖11g，玉米漿8g，黃豆餅粉12g，NaCl0.7g，K2HP040.4g，MgS047H200.6g，CaC030.8g，泡敵5g，pH為7，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②培養(yǎng)將實施例12制得的種子培養(yǎng)液接入裝有1L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，溫度為35°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為9的條件下，培養(yǎng)24小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液。實施例16發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉30g，葡萄糖5g，玉米漿3g，黃豆餅粉6g，NaCl0.9g，K2HP040.8g，MgS047H200.lg，CaC030.6g，泡敵lg，pH為5，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②培養(yǎng)將實施例13制得的種子培養(yǎng)液接入裝有4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為3vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，溫度為25°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為4的條件下，培養(yǎng)96小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液。實施例17發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制一升培養(yǎng)基中含有淀粉100g，葡萄糖12g，玉米漿10g，黃豆餅粉13g，NaCl0.4g，K2HP040.lg，MgS047H200.8g，CaC030.2g，泡敵8g，pH為9，培養(yǎng)基用水配制并定容至l升，滅菌；②將2L從實施例14獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有18L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，溫度為29。C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為6的條件下，添加200ml的正己烷作為氧載體，培養(yǎng)72小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；③在40°C，超聲破碎40min。實施例18發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制同實施例14②將2L從實施例14獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有10L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，溫度為35。C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)PH為4的條件下，添加120mL的正己烷作為氧載體，培養(yǎng)96小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；③在70。C，超聲破碎20min。實施例19發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制同實施例14②將2L從實施例14獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有28L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為2.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，溫度為25。C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)PH為9的條件下，添加260mL的正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)24小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；③在40。C，超聲破碎30min。實施例20發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制同實施例14②將實施例11制得的種子培養(yǎng)液接入裝有IOL發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為1.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，溫度為28°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為5的條件下，添加160mL的正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)48小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；③在60。C，超聲破碎30min。實施例21發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制同實施例14②將實施例11制得的種子培養(yǎng)液接入裝有28L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為2.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，溫度為25°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為9的條件下，添加260mL的正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)24小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；實施例22發(fā)酵罐培養(yǎng)①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制同實施例14②將實施例11制得的種子培養(yǎng)液接入裝有接入裝有20L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，溫度為35°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為4的條件下，添加120mL的正己烷作為氧載體，培養(yǎng)96小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；③在70°C，超聲破碎20min。實施例23抗真菌活性測定菌絲塊法用已滅菌的移液管吸取15mLPDA培養(yǎng)基注入直徑12cm的培養(yǎng)皿中，與已放入其中的0.3mL發(fā)酵液混勻，冷卻至凝固。預(yù)先準備好已在PDA培養(yǎng)基上28。C培養(yǎng)了48h的活性檢驗指示菌菌落；用已滅菌、內(nèi)徑為6mm的打孔器，在該菌落邊緣打直徑為6mm的圓形菌塊。將病原菌菌塊放置于上述已凝固好的PDA培養(yǎng)基中，每皿放置13個病原菌菌塊，29t:培養(yǎng)64h，量取菌落直徑(mm)，多次實驗取平均值，用以下公式計算抑菌率。以同樣體積的無菌水代替樣品作為空白對照；抑菌率(％)=[(空白對照組菌落平均直徑2-菌落平均直徑2)+(空白對照組菌落平均直徑2-62)]X100。實施例14-22所獲得的發(fā)酵液抗真菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)E9CGMCCNO.3075。2.權(quán)利要求1的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，其特征是由如下步驟組成(1)出發(fā)菌株的自然選育于室溫下，將0.lmL的濃度為102108個/mL的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)CGMCCNO.1692單孢子懸浮液加到分離培養(yǎng)基平板上，用涂布棒把各平板涂勻，26°C30°C，培養(yǎng)，待平板上長出針尖大小的白色菌落時，將單菌落瓊脂塊挑取后進行搖瓶培養(yǎng)，再將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后，采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，選擇抑菌效果好的菌株；(2)復(fù)合誘變和自我產(chǎn)物抗性篩選于室溫下，將所述步驟(1)制備的濃度為104108個/mL利迪鏈霉菌菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射20s60s，再用0.0010.0001M亞硝酸水溶液誘變處理25min，將處理后的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有0.5ml、lml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于24°C28°C，恒溫培養(yǎng)710天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，其特征是所述利迪鏈霉菌單孢子懸浮液是用下述方法制成用45mL55mL的生理鹽水洗滌培養(yǎng)好的利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicusAS4.2501)菌體斜面，并用接種環(huán)輕輕將孢子刮下，將洗滌液倒入裝有玻璃珠的250mL無菌三角瓶中，于搖床上29°C、210rpm振蕩3045min，將成團孢子打散，并用脫脂棉過濾，稀釋單孢子懸浮液至105106個/mL，然后將孢子懸浮液于28t:下放置15min，使孢子熱活化。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的選育，其特征是所述步驟(2)為于室溫下，將所述步驟(1)制備的濃度為107個/mL利迪鏈霉菌菌株單孢子懸浮液在波長為254nm、照射距離為30cm條件下UV照射40s，再用0.0010.0001M亞硝酸水溶液誘變處理4min，將處理后的的單孢子懸浮液進行平板涂布，分別涂于含有l(wèi)mL利迪鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵液的選擇培養(yǎng)基平板，于27°C，恒溫培養(yǎng)9天，挑取選擇培養(yǎng)基平板利上的迪鏈霉菌孢子進行搖瓶培養(yǎng)，將各菌株的搖瓶發(fā)酵液過濾并稀釋10倍后采用雙層平板杯碟法測定抑菌活性，與出發(fā)菌株進行對比，篩選出高產(chǎn)菌株并傳代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Str印tomyceslydicus)E9。5.權(quán)利要求1的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是由如下步驟組成(1)搖瓶培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制搖瓶培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米漿310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；種子培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米漿310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將淀粉30100g，葡萄糖512g，玉米漿310g，黃豆餅粉613g，NaCl0.20.9g，K2HP040.10.8g，MgS047H200.10.8g，CaC030.20.9g，泡敵18g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌；(2)搖瓶培養(yǎng)將權(quán)利要求1的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL1000mL搖瓶中，在2630。C，搖床轉(zhuǎn)速160280rpm的條件下，培養(yǎng)2080小時，獲得發(fā)酵液；(3)種子培養(yǎng)將步驟(2)獲得的10mL40mL發(fā)酵液接入90mL360mL的種子培養(yǎng)基中，在500mL2L大搖瓶中，在2535°C，搖床轉(zhuǎn)速為160300rpm條件下，培養(yǎng)2080小時，制得種子培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)，用下述方法之一種進行方法一①將所述種子培養(yǎng)液接入裝有14L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.53vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300600rpm，溫度為2535°C，用酸堿調(diào)節(jié)pH為49的條件下，培養(yǎng)2496小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；②在407(TC，超聲破碎2040min;方法二①將所述種子培養(yǎng)液或經(jīng)步驟(4)方法一①獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有1028L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為0.12.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為300600rpm，溫度為2535°C，用酸堿調(diào)節(jié)pH49的條件下，添加120ml260ml的正己烷或正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)2496小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；②獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液在4070°C，超聲破碎2040min。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是所述搖瓶培養(yǎng)基的配制為將淀粉7090g，葡萄糖710g，玉米漿45g，黃豆餅粉79g，NaCl0.30.5g，K2HP040.20.3g，MgS047H200.20.4g，CaC030.30.5g，加水定容至1升，調(diào)pH為57，滅菌。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配制將淀粉5080g，葡萄糖811g，玉米漿58g，黃豆餅粉912g，NaCl0.40.7g，K2HP040.20.4g，MgS047H200.30.6g，CaC030.50.8g，泡敵25g，加水定容至1升，調(diào)pH為59，滅菌。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是所述步驟(2)搖瓶培養(yǎng)為將權(quán)利要求1的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9接入含有50mL搖瓶培養(yǎng)基的250mL1000mL搖瓶中，在29°C，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm條件下，培養(yǎng)48小時，獲得發(fā)酵液；所述步驟(3)種子培養(yǎng)為將步驟(2)獲得的10mL發(fā)酵液接入90mL種子培養(yǎng)基中，在500mL2L大搖瓶中，在27t:，搖床轉(zhuǎn)速為230rpm的條件下，培養(yǎng)72小時，制得種子培養(yǎng)液。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是所述發(fā)酵罐培養(yǎng)的方法一為將所述種子培養(yǎng)液接入裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，在通氣量為2.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，溫度為28°C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為5的條件下，培養(yǎng)48小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9的發(fā)酵，其特征是發(fā)酵罐培養(yǎng)的方法二為將2L從步驟(4)方法一①獲得的高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液接入裝有18L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，在通氣量為lvvm，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，溫度為29。C，用NaOH和H2S04調(diào)節(jié)pH為6的條件下，添加120mL260mL的正己烷或正十二烷作為氧載體，培養(yǎng)72小時；獲得高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液c全文摘要本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌和選育及發(fā)酵，高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)E9CGMCCNo.3075的發(fā)酵方法是(1)搖瓶、種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制；(2)搖瓶培養(yǎng)；(3)種子培養(yǎng)；(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在通氣，攪拌，溫度為25～35℃，pH為4～9的條件下，培養(yǎng)24～96小時，得到高產(chǎn)菌株利迪鏈霉菌E9發(fā)酵液；超聲破碎20～40min；本發(fā)明的菌株能在發(fā)酵液中產(chǎn)生大量的具有抗真菌活性的物質(zhì)，發(fā)酵液對立枯絲核菌等具有明顯的抑制作用，發(fā)酵48小時后發(fā)酵液稀釋50倍抑菌率達到97.8％。文檔編號C12N15/01GK101693881SQ200910070829公開日2010年4月14日申請日期2009年10月16日優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日發(fā)明者元英進,程景勝,陳偉,韋宇平申請人:天津大學(xué);