產(chǎn)中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產(chǎn)纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是：它于2014年3月3日保藏于中國(guó)武漢大學(xué)“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2014056，分類命名為StreptomycesparvusS10A10。該菌株來源于昆蟲腸道。本發(fā)明提供了鑒定的菌株培養(yǎng)物的rDNA序列。本發(fā)明還提供了該菌株的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以及該菌株所產(chǎn)纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)和生產(chǎn)方法。本發(fā)明生產(chǎn)的中性纖維素酶活力高，生產(chǎn)成本低廉、發(fā)酵周期短。所得到的中性纖維素酶適合作為食品和飼料添加劑，改善食品品質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低飼料系數(shù)，并可用于紡織行業(yè)。
【專利說明】產(chǎn)中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產(chǎn)纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、食品工程及畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產(chǎn)纖維素酶的方法。本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素酶主要應(yīng)用于食品加工、飼料添加劑及紡織等行業(yè)。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是將纖維素及其衍生物水解成葡萄糖的一組酶的總稱。一組完整的纖維素酶系通常有相互協(xié)同催 化水解纖維素的三類酶組成:內(nèi)切纖維素酶(CMCase)、外切纖維素酶和葡萄糖苷酶。按催化反應(yīng)的最適PH，可將內(nèi)切纖維素酶分為:酸性內(nèi)切纖維素酶(最適pH3~5)、中性內(nèi)切纖維素酶(最適pH6~8)、堿性內(nèi)切纖維素酶(最適pH8~10)。目前國(guó)產(chǎn)商品化纖維素酶多為酸性高溫酶，國(guó)內(nèi)使用的中性纖維素酶幾乎都是國(guó)外廠家生產(chǎn)的。技術(shù)壟斷導(dǎo)致其商品化中性纖維素酶價(jià)格昂貴，制約了其市場(chǎng)推廣。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的生產(chǎn)高活力中性纖維素酶的菌株。
[0003]能產(chǎn)生內(nèi)切纖維素酶的微生物主要是真菌和部分細(xì)菌。真菌所產(chǎn)纖維素酶多為酸性胞外酶且產(chǎn)酶效率高，且酶系結(jié)構(gòu)完整，但真菌所產(chǎn)纖維素酶都是復(fù)合酶，且酶系結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量大，不易分離提取，通常其產(chǎn)酶過程需要加入纖維素類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，且發(fā)酵周期長(zhǎng)，因此在工業(yè)用酶開發(fā)方面顯示出了諸多不足。細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶雖然成分單一(即通常只含有一類纖維素酶)，可以簡(jiǎn)化提取步驟，但是細(xì)菌纖維素酶多為中性或者堿性胞內(nèi)酶，多吸附于菌壁，且其酶活普遍較低，另外，大部分菌株產(chǎn)誘導(dǎo)型內(nèi)切纖維素酶，需要添加誘導(dǎo)物，不適應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種產(chǎn)中性纖維素酶菌株及選育方法和其生產(chǎn)纖維素酶的方法，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶PH穩(wěn)定性好、催化能力強(qiáng)，適合較高的酶反應(yīng)溫度。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一株產(chǎn)中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是:它于2014年3月3日保藏于中國(guó)武漢大學(xué)“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)為 CCTCCNO:M2014056，分類命名為 Str印tomycesparvusSlOAlO。
[0006]前述的一株產(chǎn)中性纖維素酶菌株，其特征是:該菌株為放線菌，能有效地獲得高產(chǎn)的中性纖維素酶。
[0007]一種如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，所述方法包括以下步驟:
[0008](a)取昆蟲腸道無菌研磨加入液體種子培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)Id后，將經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液稀釋到10_4，取稀釋液，在初篩培養(yǎng)基上涂平板培養(yǎng)；
[0009](b)培養(yǎng)7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態(tài)的放線菌菌落，再轉(zhuǎn)接到平板上進(jìn)行單菌落分離，最終得到多株菌；[0010](C)將每株菌分別接種于液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，取發(fā)酵液進(jìn)行剛果紅平板的快速篩選，經(jīng)lmg/mL的剛果紅溶液染色30min，ImoI/L的NaCl溶液脫色30min后，測(cè)量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選得到一株在兩種培養(yǎng)中均能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，將其命名為StreptomycesparvusSlOAlO。
[0011]前述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)和步驟(C)中，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為:CMC-Na，IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,0.03g ;蒸餾水，1000mL,pH6.0 ~6.5。
[0012]前述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)中，所述初篩培養(yǎng)基的組成為:羧甲基纖維素鈉，5.0g ；K2HPO4,1.0g ；NaN03,3.0g ；KC1,0.5g ；MgS04,0.5g ；FeSO4,0.01g ;瓊脂，17.0g ;蒸餾水，1000mL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0013]前述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(C)中，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為:水稻秸桿粉，IOg ; (NH4) 2S04，4g ； KH2PO4, 2g ；MgS04,0.5g ;蒸餾水，lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0014]一種利用權(quán)利要求 1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟:
[0015]⑴產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0016]將StreptomycesparvusSlOAlO接種于斜面高氏I號(hào)培養(yǎng)基，27°C培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，27°C條件下培養(yǎng)24h ;以2%接種量再轉(zhuǎn)接發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH為6~6.5，27 °C條件下培養(yǎng)5d ；
[0017](2)胞外產(chǎn)物粗酶液的處理
[0018]將發(fā)酵液以4000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液；
[0019](3)分子篩層析
[0020]預(yù)先用pH為6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-1OO柱，上樣后用PH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰，即為純化后的纖維素酶。
[0021]前述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述高氏I號(hào)培養(yǎng)基的組成為:可溶性淀粉，20g;KN03，Ig ;Κ2ΗΡ04，0.5g ；MgS04.7Η20，0.5g ；NaCl,0.5g ；FeS04.7H20，0.01g ；瓊脂，20g ；蒸餾水，lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0022]前述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為:CMC-Na，IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,
0.03g ;蒸懼水，lOOOmL, pH6.0 ~6.5。
[0023]前述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為:水稻秸桿粉，log; (NH4) 2S04，4g;KH2PO4, 2g ；MgS04,0.5g ;蒸餾水，1000mL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0024]本發(fā)明的有益效果是:[0025](I)本發(fā)明所篩選到的StreptomycesparvusSlOAlO屬于組成型纖維素酶高產(chǎn)菌株，與當(dāng)前工業(yè)用酶的細(xì)菌菌株相比，發(fā)酵產(chǎn)酶周期短，酶活力高，且產(chǎn)酶過程無需誘導(dǎo)，因此其產(chǎn)生的纖維素酶即為組成型纖維素酶，因此該菌適用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)的特點(diǎn)；
[0026](2)從本發(fā)明StreptomycesparvusSlOAlO提取的纖維素酶總酶的活力比活達(dá)33.02U/mL,與報(bào)道菌株相比，具有更高的催化能力；該酶最適反應(yīng)pH為5.0，為罕見的酸性組成型纖維素酶；該酶在pH4.0~8.0的緩沖液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90%以上，體現(xiàn)了較好的pH穩(wěn)定性；最適反應(yīng)溫度為50~65°C ;有耐Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Pb2+、Fe3+等金屬離子的良好特性，EDTA對(duì)酶活性影響甚微，該酶為非金屬離子纖維素酶，顯示了良好的特性，在紡織、食品加工和飼料等工業(yè)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明StreptomycesparvusSlOAlO菌株在初篩培養(yǎng)基上的透明圈；
[0028]圖2為本發(fā)明StreptomycesparvusSlOAlO菌株的掃描電鏡形態(tài)圖片；
[0029]圖3為本發(fā)明純化的纖維素酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，3為酶蛋白分子量為82Kd內(nèi)切纖維素酶。)；
[0030]圖4為SephadexG-1OO柱層析得到含纖維素酶活性峰的色譜圖；
[0031]圖5為pH對(duì)纖維素內(nèi)切酶活的影響；
[0032]圖6為溫度對(duì)纖維素內(nèi)切酶活的影響；
[0033]序列表為StreptomycesparvusSlOAlO 菌株的 16SrDNA 序列鑒定。
[0034]生物材料樣品保藏:
[0035]StreptomycesparvusSlOAlO已保藏于中國(guó)武漢大學(xué)“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏地址:湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏編號(hào)為保藏編號(hào)為CCTCCNO:M2014056，保藏日期為2014年3月3日。
【具體實(shí)施方式】
[0036]為進(jìn)一步揭示本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式:
[0037]本發(fā)明中所用培養(yǎng)基為:
[0038]高氏(Gause)I 號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉，20g ；KN03, Ig ;Κ2ΗΡ04，0.5g ；MgS04.7H20，
0.5g ；NaCl,0.5g ；FeS04.7H20，0.01g ;瓊脂，20g ;蒸餾水，lOOOmL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0039]初篩培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉，5.0g ；K2HPO4,1.0g ；NaN03,3.0g ；KC1,0.5g ；MgS04,
0.5g ；FeS04,0.01g ;瓊脂，17.0g ;蒸餾水 lOOOmL, ρΗ6.0 ~6.5。
[0040]液體種子培養(yǎng)基:CMC-Na,IOg ；KH2PO4,4.0g ；MgS04,0.03g ;蒸餾水 1000mL,
ρΗ6.0 ~6.5。
[0041]發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:水稻秸桿粉，IOg； (NH4) 2S04，4g ；KH2PO4, 2g ;MgS04，0.5g ;蒸餾水lOOOmL，ρΗ6.0 ~6.5。
[0042]實(shí)施例1
[0043]StreptomycesparvusSlOAlO 的篩選過程:
[0044]取黑盾鞭蝎(Typopeltisniger)腸道無菌研磨加入液體種子培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)Id后，將經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液稀釋到10-4，取稀釋液，在初篩培養(yǎng)基上涂平板培養(yǎng)。培養(yǎng)約7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態(tài)的放線菌菌落，再轉(zhuǎn)接到平板上進(jìn)行單菌落分離，最終得到42株菌株。將每株菌分別接種于液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在2 8 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 6 h，取發(fā)酵液進(jìn)行剛果紅平板的快速篩選，經(jīng)lmg/mL的剛果紅溶液染色30min，lmol/L的NaCl溶液脫色30min后，測(cè)量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選得到一株在兩種培養(yǎng)中均能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株(D/d>5)，將其命名為StreptomycesparvusSlOAlOo 圖1 為 StreptomycesparvusSlOAlO 菌株在初篩培養(yǎng)基上的透明圈，圖2為StreptomycesparvusSlOAlO菌株的顯微觀察圖片。
[0045]實(shí)施例2
[0046]從StreptomycesparvusSlOAlO中提取中性組成型內(nèi)切纖維素酶的方法:
[0047]1.產(chǎn)酶培養(yǎng)
[0048]將StreptomycesparvusSlOAlO接種于斜面高氏I號(hào)培養(yǎng)基，27° C培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基，27° C條件下培養(yǎng)24h ;以2%接種量再轉(zhuǎn)接液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始PH為6~6.5 ;27° C條件下培養(yǎng)5d。
[0049]2.胞外產(chǎn)物粗酶液的前處理
[0050]將發(fā)酵液以4000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05mol/L、pH值6 .2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液。
[0051]3.分子篩層析
[0052]預(yù)先用ρΗ6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱SephadexG-1OO柱,上樣后用ΡΗ6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰(見圖4)。
[0053]SephadexG-1OO柱層析條件如下:
[0054]平衡緩沖液:0.05mol/L、pH值6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；
[0055]洗脫緩沖液:0.05mol/L、pH值6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；
[0056]上樣流速:1.0mL/min ；
[0057]洗脫流速:1.5mL/min。
[0058]分管收集蛋白峰，檢測(cè)酶活力和蛋白濃度，得到含纖維素酶活性峰的收集液。
[0059]酶活測(cè)定方法:
[0060]①總酶(濾紙酶活力、FPA)活力的測(cè)定:
[0061]取稀釋10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0ml0.05mol/L的檸檬酸緩沖液(pH值4.8)和50mg新華濾紙，以不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)得在540nm處的OD值。
[0062]②纖維素內(nèi)切酶(羧甲基纖維素酶、CMCA)活力的測(cè)定:
[0063]取稀釋10倍后的粗酶液0.5mL，加入1.0mL、I %羧甲基纖維素鈉溶液(pH值4.8)，以不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)得在540nm處的OD值。
[0064]③纖維素外切酶(微晶纖維素酶)活力的測(cè)定:[0065]取0.5mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0mL、I %的微晶纖維素溶液(pH值4.8)，以不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)60min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入ISmL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)得在540nm處的OD值。
[0066]④β -葡萄糖苷酶(BGA)活力測(cè)定:
[0067]取0.5mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0mL、l%的水楊苷溶液(pH值4.8)，以不加底物為對(duì)照，50°C反應(yīng)30min，加入3mLDNS溶液，沸水浴5min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18mL蒸餾水。以空白管做對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)得在540nm處的OD值。
[0068]酶活力的計(jì)算方法:
[0069]酶活力的定義:在pH4.8，50°C條件下，每ImL酶液在Imin內(nèi)水解底物生成I μ g葡萄糖的酶量稱作一個(gè)酶活力單位(U)。
[0070]纖維素酶活力單位=GXnX 1000/(0.5Xt)
[0071]G——所測(cè)得的OD值在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的還原糖濃度，mg/mL ；
[0072]η——酶液的稀釋倍數(shù)；
[0073]1000——毫克換算成微克；
[0074]0.5——反應(yīng)酶液的體積；
[0075]t-酶和底物反應(yīng)時(shí)間，min。
[0076]取粗酶液測(cè)定酶的活力，經(jīng)測(cè)定，總酶、內(nèi)切酶和外切酶酶活分別為33.02U/mL、18.51U/mL 和 23.92U/mL。
[0077]分別對(duì)粗酶液、樣品前處理液和經(jīng)S^hadexG-1OO柱層析后的樣品進(jìn)行總酶活力的測(cè)定，如表1所示，結(jié)果表明StreptomycesparvusSlOAlO纖維素酶純化后得率78%,得率較高，且酶活在純化過程中較為穩(wěn)定。
[0078]表1纖維素酶的內(nèi)切酶活力測(cè)定
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)中性纖維素酶的鏈霉菌屬菌株，其特征是:它于2014年3月3日保藏于中國(guó)武漢大學(xué)“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2014056，分類命名為Streptomyces parvus SlOAlO0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株產(chǎn)中性纖維素酶菌株，其特征是:該菌株為放線菌，能有效地獲得高產(chǎn)的中性纖維素酶。
3.—種如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，所述方法包括以下步驟: (a)取昆蟲腸道無菌研磨加入液體種子培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)Id后，將經(jīng)過富集培養(yǎng)后的菌液稀釋到10_4，取稀釋液，在初篩培養(yǎng)基上涂平板培養(yǎng)； (b)培養(yǎng)7d后，用接種針挑出同一平板上不同形態(tài)的放線菌菌落，再轉(zhuǎn)接到平板上進(jìn)行單菌落分離，最終得到多株菌； (c)將每株菌分別接種于液體種子培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，取發(fā)酵液進(jìn)行剛果紅平板的快速篩選，經(jīng)I mg/mL的剛果紅溶液染色30 min, Imol/L的NaCl溶液脫色30 min后，測(cè)量平板上菌落水解圈與菌落直徑，計(jì)算水解圈和菌株直徑的比值，篩選出比值大于5的菌株，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選得到一株在兩種培養(yǎng)中均能產(chǎn)生明顯透明圈的菌株，將其命名為Sirepio焊parvus S10A10。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)和步驟(c)中，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為=CMC-Na, 10 g；KH2P04,4.0 g ；MgS04,0.03 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(a)中，所述初篩培養(yǎng)基的組成為:羧甲基纖維素鈉，5.0 g ；Κ2ΗΡ04,1.0 g；NaN03,3.0 g ；KC1,0.5 g ；MgS04,0.5 g ；FeS04,0.01 g ;瓊脂，17.0 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株的選育方法，其特征是，上述步驟(c)中，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為:水稻秸桿粉，10 g ； (NH4) 2S04，4 g ；KH2PO4, 2 g ；MgS04,0.5 g ;蒸懼水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
7.一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟: (1)產(chǎn)酶培養(yǎng) 、備Streptomyces parvus SlOAlO接種于斜面高氏I號(hào)培養(yǎng)基,27°C培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，27°C條件下培養(yǎng)24h ;以2%接種量再轉(zhuǎn)接發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH為6~6.5，27 °C條件下培養(yǎng)5d ； (2)胞外產(chǎn)物粗酶液的處理 將發(fā)酵液以4000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心10min，取上清，即得粗酶液；取20mL粗酶液于0.05 mol/L、pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中透析過夜；用聚乙二醇濃縮透析液，再經(jīng)0.45 μ m微孔濾膜過濾除雜，保存濾液； (3)分子篩層析 預(yù)先用pH為6.2的磷酸鹽緩沖液充分平衡葡聚糖凝膠層析柱Sephadex G-100柱,上樣后用pH為6.2的檸檬酸-檸檬酸鈉洗脫，收集有酶活的洗脫峰，即為純化后的纖維素酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述高氏I號(hào)培養(yǎng)基的組成為:可溶性淀粉，20 g ；KNO3,1 g ；K2HP04,0.5 g ;MgS04.7Η20，0.5 g ；NaCl,0.5 g ；FeS04.7H20,0.01 g;瓊脂，20 g ；蒸懼水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為:CMC-Na，10 g；KH2PO4,4.0 g ；MgS04,0.03 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種利用權(quán)利要求1所述的產(chǎn)中性纖維素酶菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征是，上述步驟(1)中，所述發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成為:水稻秸桿粉，10 g；(NH4) 2S04，4 g ；KH2P04, 2 g ；MgS04,0.5 g ;蒸餾水，1000 mL, pH 6.0 ~6.5。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103937732SQ201410199636
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】張李陽, 霍光明, 劉維周 申請(qǐng)人:南京曉莊學(xué)院