專利名稱：一種抗噬菌體l-苯丙氨酸生產(chǎn)菌及選育方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種抗噬菌體L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌及選育方法和其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域，特別涉及一種生物法生產(chǎn)L-苯丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，簡稱L_Phe)是人和動物體內(nèi)不能合成的8種氨基
酸之一，人們稱其為必需氨基酸。L-苯丙氨酸在生物體內(nèi)是轉(zhuǎn)化成L-酪氨酸的原料， 因而L-苯丙氨酸成為一些氨基酸輸液和氨基酸飲膳所必須的成分；而且，L-苯丙氨酸 是合成藥物麥角胺、抗生物質(zhì)和維生素B6的重要原料；同時，L-苯丙氨酸也是合成一 些抗癌藥物的中間體；在食品工業(yè)中，L-苯丙氨酸最主要的用途是合成二肽甜味劑阿斯 巴甜，俗稱蛋白糖；近年來，L-苯丙氨酸的應(yīng)用領(lǐng)域還在不斷拓展。目前，L-苯丙氨 酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法、發(fā)酵法等三種，直接發(fā)酵法由于具有可利用廉價原 料直接生產(chǎn)、對環(huán)境無污染、發(fā)酵條件溫和等優(yōu)點，成為國內(nèi)外研究的重點。在國外， 發(fā)酵法生產(chǎn)L-苯丙氨酸已經(jīng)取得了可喜的成績，據(jù)報道目前基因工程改造菌株可以達到 5%的產(chǎn)酸率，而在我國該行業(yè)還處于起步階段，發(fā)展?jié)摿^大。最近幾年來，基于阿斯 巴甜的巨大需求量，已有十多家公司紛紛投產(chǎn)建立微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-苯丙氨酸的生產(chǎn) 線。然而，噬菌體污染成為影響很多公司穩(wěn)定發(fā)展的制約因素。眾所周知，氨基酸 生產(chǎn)中很容易發(fā)生噬菌體污染的現(xiàn)象，輕則使發(fā)酵周期延長，發(fā)酵產(chǎn)量降低，增加提取 的難度；重則造成倒罐，公司被迫停產(chǎn)，使人力、物力、財力遭到浪費，嚴重影響經(jīng)濟 的發(fā)展和進步。本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-Z06(pAP_B03) (CCTCC M2010009),已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是在生產(chǎn)過程中，容易受到噬菌體的污染，導(dǎo)致大 量的倒罐，嚴重影響了生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益。噬菌體污染的來源一般可歸納為三種一是生產(chǎn)菌種攜帶有噬菌體，有的發(fā)生 在接種、并種過程中；有的發(fā)生在種子培養(yǎng)過程中。二是污染發(fā)生在發(fā)酵過程中，例如 原材料滅菌不徹底、發(fā)酵設(shè)備密封不好等。三是生產(chǎn)和實驗過程中許多活菌被排放到環(huán) 境中，使生產(chǎn)環(huán)境中本來存在的噬菌體有了宿主而不斷增殖，導(dǎo)致環(huán)境中噬菌體的密度 逐漸增高而形成污染源。要解決噬菌體污染問題，要從多方面綜合治理，首先要注重預(yù) 防，杜絕噬菌體污染的一切可能來源，再者選育抗噬菌體的優(yōu)良菌株進行發(fā)酵，或者采 用多個菌株輪番使用的方法。由于發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)境是一個開放的體系，其空氣、土壤、水 源等很難徹底進行消毒；再者噬菌體是一種個體極小、繁殖速度較快的病毒，會隨著空 氣流動、塵土的飛動等到處傳播，控制起來極其困難，而選育一種抗噬菌體菌株進行發(fā) 酵生產(chǎn)可以從根本上解決噬菌體污染這一難題。目前抗噬菌體菌株的選育方法很多，但從根本上來說可分為三大類一是采用 從自然環(huán)境中篩選野生菌；二是利用生產(chǎn)菌株的自發(fā)突變或物理化學(xué)方法進行誘變；三 是采用基因工程的手段在生產(chǎn)菌種中轉(zhuǎn)化一個帶有可以編碼切割噬菌體DNA的相關(guān)酶的基因的質(zhì)粒。本發(fā)明是采用傳統(tǒng)的誘變育種與基因工程相結(jié)合的手段構(gòu)建了一株抗噬菌 體的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
為解決L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌易被噬菌體污染的問題，本發(fā)明提供了一種抗噬菌體 的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR42 (pAP-B03)，該菌株為重組大腸桿菌，具有對重組 大腸桿菌易感染噬菌體(CCTCC M 2010054)抗性，該噬菌體保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏日期2010年3月15日，地址中國武漢，武漢大學(xué)，分類學(xué)命名為大 腸桿菌噬菌體(Bacteriophage) ； WSH-BR42 (pAP-B03)含有重組質(zhì)粒，質(zhì)粒上攜帶 L-苯丙氨酸合成酶基因，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010008,保藏日期2010年1月14日，地址中國武漢，武漢大學(xué)，分類學(xué)命名為 大腸桿菌(.Escherichia coli)。所述重組質(zhì)粒pAP_B03，其上攜帶L-苯丙氨酸合成的關(guān)鍵酶CM/PDT和DS 的基因pheAto和aroF，其中pheAto基因來源于E.coli K12的突變株，aroF來源于E.coli K12 (具體構(gòu)建方法見參考文獻Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expressionof pheAftr and aroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao, Tianwen Wang, Guocheng Du，JianChen. Bioresource Technology)。為解決抗噬菌體基因工程菌的選育的問題，本發(fā)明還提供了一種抗噬菌 體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的選育方法，對容易受到噬菌體污染的重組大腸桿菌的宿主菌 WSH-Z06 (來源見參考文獻Enhanced L-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheAftr andaroFwt.Haiyan Zhou, Xianyan Liao, Tianwen Wang, Guocheng Du， Jian Chen. Bioresource Technology)進行誘變處理，篩選得到具有噬菌體抗性的菌株WSH-BR42，用 編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質(zhì)粒(pAP_B03)轉(zhuǎn)化WSH-BR42，得到抗噬菌體L-苯丙 氨酸生產(chǎn)菌 WSH-BR42 (pAP-B03) (CCTCC M 2010008)。所述誘變處理，采用0.2_0.8mg/mL亞硝基胍(NTG)作為誘變劑對重組大腸桿菌 宿主菌處理30-60min。所述篩選方法，具體方法為離心、收集、培養(yǎng)誘變后的菌體，挑取形態(tài)、大 小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單層平板，然后在平板的4個象限處分別滴加IOyL噬 菌體裂解液，做好標記，培養(yǎng)24h后，挑取在4處滴加噬菌體的地方均沒有出現(xiàn)噬菌斑的 菌株。所述噬菌體裂解液取樣于受噬菌體污染的WSH-Z06(pAP-B03)發(fā)酵液，經(jīng)過 分離、培養(yǎng)后獲得，具體方法為發(fā)酵液離心后的上清液經(jīng)0.22μιη微孔濾膜過濾除 菌，取出一定上清液放入裝有肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入一定量的敏感菌 WSH-Z06菌懸液，培養(yǎng)一段時間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態(tài)、 大小不一的單個空斑分別接入含有敏感菌WSH-Z06的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 16-24h。所述噬菌體抗性檢測培養(yǎng)基，采用肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，瓊脂 2%。為解決抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌應(yīng)用的問題，本發(fā)明還提供了一種抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的培養(yǎng)基組成；其中種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基以葡 萄糖、L-酪氨酸、碳酸鈣、七水合硫酸鎂、二水合氯化鈣、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸 銨、七水合硫酸亞鐵、檸檬酸鈉、硫胺素(thiamine · HCl)、硫酸卡那霉素、微量元素溶 液(TES)為主要成分。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，其優(yōu)選培養(yǎng)基組成為(1)種子培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，pH 7.3,固體培
養(yǎng)基加2%的瓊脂。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣 0.015，磷酸二氫鉀3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0， 硫胺素(thiamine · HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0。TES 溶液(g/L) Al2 (SO4) 3 · 18H20 2.0, CoSO4 · 7H20 0.75, CuSO4 · 5H20 2.5，H3BO3 0.5，MnSO4 · H2O 24，Na2MoO4 · 2H20 3.0，NiSO4 · 6H20 2.5， ZnSO4 · 7H20 15，用 IN 的 HCl 溶解。所述抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌，其發(fā)酵培養(yǎng)方法為(1)搖瓶培養(yǎng)方法將37°C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以10%的接種量分別轉(zhuǎn)入裝有50mL發(fā)酵培 養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，于37°C、200rpm條件下培養(yǎng)48h。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)方法將37°C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以10%的接種量分別接入裝有3.6L發(fā)酵培養(yǎng) 基的7L發(fā)酵罐中，pH由28%的氨水控制在7.0士0.1，溫度33°C，待菌體濃度達到OD61tl =30以后，升溫至37°C。初始轉(zhuǎn)速400rpm，DO降至20%時逐步提高轉(zhuǎn)速或通氣量使 DO維持在20%以上，培養(yǎng)基中的殘余葡萄糖濃度通過流加的方式控制在5g/L左右。細胞干重(DCW)的測定方法為取一定量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加去 離子水定容，搖勻，用722型可見分光光度計，于610nm處比色測OD值，利用細胞干重 標準曲線算得細胞干重，若測搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中的菌體濃度則在定容前加2mL 2N的鹽酸溶 解菌懸液中的碳酸鈣。L-苯丙氨酸濃度的測定方法采用氨基酸常用測定方法，高效液相色譜(HPLC) 柱前衍生化方法進行測定(Henderson，J.W., Ricker, R.D., Bidlingmeyer, B.Α., Woodward, C.，2000.Rapid, accurate, sensitive, and reproducible HPLC analysis of amino acids .Agilent Technologies, USA (Agilent App Note 5980-1193E)。有益效果本發(fā)明利用亞硝基胍(NTG)誘變重組大腸桿菌WSH-Z06 (pAP_B03) (CCTCC M2010009)的宿主菌WSH-Z06，以從WSH-Z06 (pAP_B03)發(fā)酵液中分離出的噬菌體做
為篩子，選育得到具有噬菌體抗性的菌株WSH-BR42，轉(zhuǎn)化含L-苯丙氨酸合成酶基因的 質(zhì)粒pAP_B03，最終得到抗噬菌體L-苯丙氨酸高產(chǎn)菌WSH-BR42 (pAP-B03) (CCTCCM 2010008)；本發(fā)明成功構(gòu)建了一株抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌；與原生產(chǎn)菌株相比，可以抵抗噬菌體的感染，且細胞生長速度和L-苯丙氨酸產(chǎn)量不受影響，并且具有良好的遺 傳穩(wěn)定性，從根本上解決了 L-苯丙氨酸生產(chǎn)過程中容易受到噬菌體污染的問題，提高了 L-苯丙氨酸生產(chǎn)企業(yè)的經(jīng)濟效益。


圖1不同E.coli菌株對噬菌體的抗性檢測。A為WSH-Z06 ； B為WSH-BR130 ； C為WSH-BR42。其中A中有4處明顯的噬菌斑，而B、C的相應(yīng)位置無噬菌斑出現(xiàn)， 說明B、C兩株突變菌株對噬菌體具有抗性。圖2三株重組大腸桿菌菌株的搖瓶發(fā)酵比較?！?L-苯丙氨酸□菌體干重圖3發(fā)酵進行到14h時(右罐已停罐)的發(fā)酵液外觀比較。其中左罐菌種為 WSH-BR42 (pAP-B03)，右罐菌種為 WSH-Z06 (pAP-B03)。圖4抗噬菌體重組菌WSH-BR42 (ρΑΡ_Β03) (Α圖)與原始菌株 WSH-Z06(pAP-B03) (B圖)在外源添加噬菌體條件下的發(fā)酵過程曲線比較。
L-苯丙
氨酸▲菌體干重
具體實施例方式實施例1重組大腸桿菌WSH-Z06 (pAP_B03)易感染噬菌體BP-1的分離、純化菌株來源本實驗室前期開發(fā)的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌重組大腸桿菌 WSH-Z06 (ρΑΡ-Β03),菌種保藏編號為CCTCC M 2010009，現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏日期2010年1月14日，地址中國武漢，武漢大學(xué)，分類學(xué)命名為 大腸桿菌(.Escherichia coli)。取某工廠受到噬菌體感染的重組大腸桿菌WSH-Z06 (pAP-B03)發(fā)酵液4mL， 8000rpm離心IOmin后，上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌，取出100 μ L到50 V 裝有6mL上層肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，同時加入WSH-Z06 (pAP_B03) (CCTCC M2010009)菌懸液lOOyL，立即混勻，倒入已凝固的底層培養(yǎng)基上，鋪勻，置37°C培養(yǎng) 箱內(nèi)培養(yǎng)16-24h。待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態(tài)、大小不一的單個空 斑分別接入含有WSH-Z06(pAP_B03)的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16_24h。重復(fù)上 述步驟進行噬菌斑形態(tài)、大小的檢驗，直至得到純化的噬菌體。噬菌體分離純化培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0-7.2，上層瓊脂 0.8%，下層瓊脂 2%)。實施例2抗噬菌體大腸桿菌的選育A.出發(fā)菌株已工業(yè)化用于生產(chǎn)L苯丙氨酸的重組大腸桿菌的宿主菌WSH-Z06。大腸桿菌(Escherichiacoli) WSH-Z06 (pAP-B03) (CCTCC M 2010009)，為本研 究室選育抗噬菌體重組菌的出發(fā)菌株。B.噬菌體噬菌體為BP-I，通過實施例1分離得到。C.培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)；若菌體含有質(zhì)粒則添加硫酸卡那霉素40 μ g/mL，pH 7.3，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂。噬菌體抗性檢測培養(yǎng)基肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，葡 萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，瓊脂 2%。D.突變株的誘變和分離篩選從新鮮斜面上接一環(huán)WSH-Z06入LB培養(yǎng)基中(25mL/250mL錐形瓶)，在 37°C、200rpm的條件下培養(yǎng)12h后，離心收集菌體，用磷酸鉀緩沖液(pH7.5)洗滌兩次。 然后加入2mL磷酸鉀緩沖液，混勻懸浮菌體。取4個5mL離心管，分別加入0.2mL菌懸 液及適量亞硝基胍(NTG)母液(lg/L)和磷酸鉀緩沖液，配制成總體積為2mL、亞硝基胍 (NTG)濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL的懸浮體系(體積組成見表1)；于37°C、 200rpm下振蕩處理30-60min。離心收集菌體，并用緩沖液洗滌3次后將其分別接入種 子培養(yǎng)基中作中間培養(yǎng)6h，而后稀釋、涂布LB平板，置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，挑 取形態(tài)、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單層平板，然后在平板的4個象限處分別 滴加10 μ L噬菌體裂解液，做好標記，培養(yǎng)24h后，挑選出在4處滴加噬菌體的地方均沒 有出現(xiàn)噬菌斑的菌株，將每株菌分別在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次，再分別檢測各菌株 每一代的噬菌體抗性，結(jié)果選出噬菌體抗性遺傳穩(wěn)定的菌株2株(附圖1)，分別命名為 WSH-BR42 和 WSH-BRl30，以待復(fù)篩。表1誘變體系的體積組成
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)L-苯丙氨酸的重組大腸桿菌，其特征在于，該菌株具有對重組大腸桿菌 易感染噬菌體(CCTCC M)抗性；含有重組質(zhì)粒，質(zhì)粒上攜帶L-苯丙氨酸合成酶基因， 現(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010008。
2.權(quán)利要求1所述易感染噬菌體，其特征在于，該噬菌體分離自容易受到噬菌體污染 的L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-Z06 (pAP-B03) (CCTCC M 2010009)的發(fā)酵液；該噬菌體現(xiàn) 已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M。
3.—種抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的選育方法，其特征在于，對容易受到噬 菌體污染的重組大腸桿菌的宿主菌WSH-Z06進行誘變處理，篩選得到具有噬菌體 (CCTCCM)抗性的菌株WSH-BR42，用編碼L-苯丙氨酸合成酶基因的質(zhì)粒(pAP_B03) 轉(zhuǎn)化WSH-BR42，得到抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR42 (pAP-B03) (CCTCCM 2010008)。
4.權(quán)利要求3所述誘變處理，其特征在于，采用0.2-0.8mg/mL亞硝基胍(NTG)作為 誘變劑對重組大腸桿菌宿主菌處理30-60min。
5.權(quán)利要求3所述噬菌體抗性菌株篩選方法，其特征在于，離心、收集、培養(yǎng)誘變后 的菌體，挑取形態(tài)、大小、顏色各不相同的菌落逐一涂布單層平板，然后在平板的4個 象限處分別滴加10 μ L噬菌體裂解液，做好標記，培養(yǎng)24h后，挑取在4處滴加噬菌體的 地方均沒有出現(xiàn)噬菌斑的菌株。
6.權(quán)利要求5所述噬菌體裂解液，其特征在于，取一定體積的受到噬菌體污染的 L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-Z06(pAP-B03)的發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過 濾后移入噬菌體抗性檢測培養(yǎng)基中，同時加入一定量的WSH-Z06菌懸液，培養(yǎng)一段時 間，待長出單個噬菌斑后，用接種針穿刺法挑取形態(tài)、大小不一的單個空斑分別接入含 有WSH-Z06的液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)16-24h。
7.權(quán)利要求6所述噬菌體抗性檢測培養(yǎng)基，其特征在于，優(yōu)選肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛 肉膏 5g/L，蛋白胨 10g/L，葡萄糖 10g/L，NaCl 5g/L)，pH 7.0-7.2，瓊脂 2%。
8.—種抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌的應(yīng)用，其特征在于，種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng) 基；發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖、L-酪氨酸、碳酸鈣、七水合硫酸鎂、二水合氯化鈣、磷酸二 氫鉀、氯化鈉、硫酸銨、七水合硫酸亞鐵、檸檬酸鈉、硫胺素(thiamine.HCl)、硫酸卡那 霉素、微量元素溶液(TES)為主要成分。
9.權(quán)利要求8所述發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)葡萄糖 25，L-酪氨酸0.4，碳酸鈣12.5，七水合硫酸鎂3.0，二水合氯化鈣0.015，磷酸二氫鉀 3.0，氯化鈉1.0，硫酸銨5.0，七水合硫酸亞鐵0.075，檸檬酸鈉1.0，硫胺素(thiamine. HCl) 0.075,硫酸卡那霉素0.04，微量元素溶液(TES) 1.5mL/L，pH 7.0 ；其中TES溶液 (g/L)為A12(S04)3.18H20 2.0，CoS04.7H20 0.75，CuS04.5H20 2.5，H3B03 0.5， MnS04.H20 24, Na2Mo04.2H20 3.0，MS04.6H20 2.5，ZnS04.7H2015,用 IN 的 HCl 溶解。
全文摘要
一種抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌及選育方法和其應(yīng)用屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用亞硝基胍(NTG)誘變重組大腸桿菌的宿主菌WSH-Z06，以從WSH-Z06(pAP-B03)(CCTCC M2010009)發(fā)酵液中分離出的噬菌體做為篩子，選育得到具有噬菌體(CCTCC M)抗性的菌株，轉(zhuǎn)化含L-苯丙氨酸合成酶基因的質(zhì)粒pAP-B03，最終得到抗噬菌體L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌WSH-BR42(pAP-B03)(CCTCC M 2010008)；與出發(fā)菌株相比，抗噬菌體L-苯丙氨酸重組菌WSH-BR42(pAP-B03)具有噬菌體(CCTCC M)的抗性，而且不影響菌體生長速度和產(chǎn)酸能力；本發(fā)明解決了L-苯丙氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中長期受到噬菌體污染的難題。
文檔編號C12N15/01GK102010847SQ20101012421
公開日2011年4月13日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者周海巖, 堵國成, 廖鮮艷, 王天文, 薛曉馳, 陳堅 申請人:江南大學(xué)