穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物基因。 技術(shù)背景
[0002] 穿心蓮（Andrographis paniculata(Burm. f. )Nees)是爵床科一年生草本植物，有 清熱解毒、消炎、消腫止痛作用。它原產(chǎn)于印度半島和斯里蘭卡，目前野生資源匱乏，被列為 嚴(yán)禁出口的保護(hù)物種。我國引種栽培穿心蓮的歷史至少有80年，多年來，廣西、四川、福建、 海南、廣東等多個(gè)省份均種植過穿心蓮，但種質(zhì)間遺傳多樣性很低，種群繁衍和進(jìn)化緩慢， 種源保護(hù)工作值得重視。
[0003] 穿心蓮的主要活性成分是穿心蓮內(nèi)酯（andrographolide)，屬于二砲類化合物，分 布在穿心蓮的莖、葉片和根系培養(yǎng)物中。國內(nèi)已經(jīng)利用穿心蓮內(nèi)酯開發(fā)出多種消炎抗菌的 中藥產(chǎn)品，包括天津天士力制藥股份有限公司研制開發(fā)的穿心蓮內(nèi)酯滴丸等，在避免濫用 抗生素方面發(fā)揮了一定的作用。
[0004] 進(jìn)行穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑的研究，對于保護(hù)穿心蓮資源，促進(jìn)相關(guān)中藥產(chǎn)業(yè) 的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。GGPP是植物體內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯合成的主要前體，它是在香 葉基香葉基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPS)的作用下， 由法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)加上一個(gè)異戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP)基團(tuán)后產(chǎn)生的。從穿心蓮中獲取香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，對于 進(jìn)行穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑的調(diào)控具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
[0006] 本發(fā)明所述穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，其具有如SEQ ID NO: 1所述 序列?；蛉LcDNA大小為1440bp，包含一個(gè)1047bp的完整的開放閱讀框（0RF)(見下劃 線部分堿基），其5' UTR大小為240bp，3' UTR大小為153bp，編碼348個(gè)氨基酸。
[0007] SEQ IDN0:1
[0008] ATGGGGGCCCTATATCTATCTTCTCCCCTCGAGCAGAAATAACCAGCCATCAATGGTGGATTTACCGAC TTCCAGTACCTGCAGCCTCTCCGTCCTTGCTCGCTTCTGCAACAAATAAAGGCACACAGCGGCGTAAGTGAGTGAAG GATTTTTTATCATTTACTTTTGTGAATTTTGGAAACTGAATAGGAATTTTGGGGGTTTTGAATTCCGACTGCGATTT GATCTATTCTACCGACAATGAGTGCGGTGGTGAATCCAATTGCGACGTGGTCGCGGTCGATTTCCGGCGGAGGCTTC CGACCGGAGCAATTCAATTTCCTCAAACCCTCGAGGTTTCGCCCTATGTCGATTTCCTCTGCCATAATCGAGGAAAC CGTCGCCACCGGGAAACCGCATGCCTTCGATCTCAAAAAGTACATGCTCAACAAGGCGAGCGCCGTGAACGCCGCCT TGGAGGAGGCGGTCCCCGTCAGAGATCCGGTCACGATACACGAATCGATGAGGTACTCGCTTCTCGCCGGGGGGAAA CGCGTCCGGCCGATGCTCTGCATCGCCGCCTGCGAGCTGGTCGGCGGTGAGCAGGCCGCCGCCCTCCCGGCCGCCTG TGCGGTGGAGATGATTCACACCATGTCGCTGATGCACGACGACCTCCCCTGTATGGACAACGACGACCTGCGAAGGG GGAAACCGACGAACCACAAGGTGTACGGCGAGGACGTCGCCGTCCTCGCCGGCGACGCACTCCTCGCCTTCGCCTTC GAACATTTGGCGACGGCCACTGAGGACGTCCCTACCAACATGGTAGTATCCGCCATTGGTGAGTTGTCAAGGTGCAT TGGTGCAGAGGGATTGGTGGCAGGGCAAGTGGTGGACATATGTTCGGAGGGGATTTCGGAGGTGGGGCTGGAGCTTC TAGAGTTCATCCACCTCCACAAGACGGCGGCGCTGCTGGAAGGTTCAGTGGTGTTGGGCGCCATATTGGGAGGTGCG ACAGAGTCGGAAGTGGAGCGGCTGAGGAAATTCGCGAGGTGCATCGGGCTGCTGTTCCAGGTGGTGGACGACATCCT AGACGTGACCAAGTGCTCGGAGGAGCTGGGGAAGACGGCCGGGAAGGATCTGGTGGCGGACAAGACGACATACCCGA AGCTGATCGGGATTGAGAAGTCGAGAGAATTTGCAGAGCAGCTGAAGAGGGAGGCTAAAGAGCAGCTGGAGGGGTTT GATCCAGGTAAAGCAGCTCCATTGCTGGCCTTGGCTGATTACATTGCTTCTAGGGATAATTGATGCTTTCATTGCAA GTTTAACTCAACTATTTATGCTTATGTTGCTTTTGTATCTGCCCTTCCTTGAAAATTAGAAGAATATGACCTATTAC TTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTA
[0009] 該基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)，其序列如SEQIDN0:2。
[0010] SEQIDNO:2
[0011] MSAVVNPIATWSRSISGGGFRPEQFNFLKPSRFRPMSISSAIIEETVATGKPHAFDLKKYMLNKASAVN AALEEAVPVRDPVTIHESMRYSLLAGGKRVRPMLCIAACELVGGEQAAALPAACAVEMIHTMSLMHDDLPCMDNDDL RRGKPTNHKVYGEDVAVLAGDALLAFAFEHLATATEDVPTNMVVSAIGELSRCIGAEGLVAGQVVDICSEGISEVGL ELLEFIHLHKTAALLEGSVVLGAILGGATESEVERLRKFARCIGLLFQVVDDILDVTKCSEELGKTAGKDLVADKTT YPKLIGIEKSREFAEQLKREAKEQLEGFDPGKAAPLLALADYIASRDNo
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：提供了穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因序列，為后 續(xù)設(shè)計(jì)引物、構(gòu)建載體和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了便利，為今后進(jìn)一步研究制備香葉基香葉基 焦磷酸合成酶抗體，通過途徑調(diào)控提高植物中穿心蓮內(nèi)酯合成量，或者利用合成生物學(xué)方 法生產(chǎn)穿心蓮內(nèi)酯，促進(jìn)相關(guān)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0013] 圖1提取獲得的穿心蓮總RNA
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] 1材料與方法
[0017] 所有引物均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，見表1。總RNA提取所用化學(xué)試劑 購自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他分子生物學(xué)試劑購自寶生物工程（大連） 有限公司。PCR產(chǎn)物和陽性單克隆測序由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行。穿心 蓮種植在江西中醫(yī)藥大學(xué)神農(nóng)園。
[0018] 表 1
[0019]
[0020] 1. 1總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
[0021] 首先配制總 RNA提取液，配方為 2% CTAB，5% PVP K25, lOOmM Tris-HCl (pH 8. 0)， 25mM EDTA(pH 8. 0)，2M NaCl，5% 巰基乙醇。將提取液在65°C水浴30min以上。
[0022] 取穿心蓮新鮮的莖和葉約0. 5g，加入3ml總RNA提取液，迅速用研缽研磨粉碎， 在65°C水浴lOmin，再加入3ml氯仿：異戊醇（24 : 1)。lOOOOrpm離心10min后，取上清 600 y 1，加入150 y 1 LiCl，4°C過夜。lOOOOrpm離心20min后，棄上清，再離心lmin，吸干上 清。在沉淀中加入超純水50 y 1，3M NaCl 5 y 1，96%乙醇125 y 1，顛倒混勻，在-70°C沉淀 30min。在4°C溫度下lOOOOrpm離心20min后，棄上清，用600iil 70%乙醇洗滌兩遍，將沉 淀溶解在30 y 1超純水中。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。
[0023] 米用 Roche 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Transcriptor cDNA Synth. Kit 2)獲得 cDNA，每個(gè)樣 品的總體積20 y 1。首先在12 y 1總RNA中加入1 y 1 Anchored-oligo(dT) 18Primer，輕輕 混勻后，在65°C 反應(yīng) lOmin;然后再加入4yl Buf