fer，0.5yl RNaseInhibitor，2yl dNTP mix，0. 5 y 1反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混勻，在55°C放置30min后，轉(zhuǎn)為85°C反應(yīng)5min，4°C終止反應(yīng)。
[0024] 1. 2同源克隆技術(shù)獲得穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因核心區(qū)段
[0025] 進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積20.0yl，包括cDNA產(chǎn)物1.0yl，10XEx Taq buffer 2.0yl，dNTP mix(10mM)1.6yl，上下游引物（第 1 輪為 GGPS-F2 和GGPS-R2,第 2 輪為GGPS-F1和GGPS-R1。擴(kuò)增保守區(qū)段的兩對嵌套引物為GGPS-F1和GGPS-R1、GGPS-F2 和GGPS-R2,引物序列組成見文獻(xiàn)"丹參櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶基因的克隆與分 析"）（10 y M)各 5 y l，ExTaq 0? 3 y 1 和 5. 1 y 1 ddH20。第 1 輪 PCR 擴(kuò)增條件為 95°C 5min ; 94°C lmin，30°C 3min，72°C lmin，20cycles ;72°C lOmin。第 2 輪 PCR擴(kuò)增條件為 95°C 5min ; 94°C lmin，30°C 3min，72°C 50s，35cycles ;72°C lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，用 1%瓊脂糖凝膠電 泳檢測產(chǎn)物。切膠回收清晰的條帶后，送公司測序。
[0026] 1. 3反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
[0027] 按照TaKaRa公司SMARTer? RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說明書，制備5' RACE cDNA和 3' RACE cDNA，分別用于5' RACE和3' RACE反應(yīng)。在配制反轉(zhuǎn)錄體系時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)（參考 文獻(xiàn)A guide for in-house design of template-switch-based5r rapid amplification of cDNA ends systems)，使用了海藻糖（trehalose)和甜菜喊（betaine)。
[0028] 1.4配制引物工作液
[0029] UPM引物需要配制成10 X混合液。先把UPM Long和UPM Short引物稀釋成10 y M 濃度，取UPM Long引物4yL，UPM Short引物20yL，最后加入76yL滅菌水，混合即成 10XUPM引物工作液。其他引物均配制成10yM工作液。
[0030] 1.5 3'RACE反應(yīng)：
[0031] 采用巢式PCR擴(kuò)增3'端序列。在第1輪擴(kuò)增反應(yīng)中，首先配制總體積為 41. 5 y 1 的 Master mix，由 34. 5 y 1 ddH20、5. 0 y 1 10 XAdvantage 2PCR buffer、 1.0 y 1 50XAdvantage 2polymerase mix 組成。然后在 Master mix 中分別加入 2.5 yl 3 r RACE cDNA和5.0y 1 10XUPM引物，使得總體積達(dá)到50.0y 1。PCR擴(kuò)增條件為 94°C 30s，72°C 3min，5cycles ;94°C 30s，70°C 30s，72°C 3min，5cycles ;94°C 30s，68°C 30s， 72°C 3min，25cycles ;72°C 10min。將第 1 輪 PCR 產(chǎn)物用 TE稀釋 50 倍，取 2. 5y 1 用作模 板，分別加入41. 5 y 1 Master mix，1. 0 y 1 5' Primer II A 引物（10 y M)和 AP-GGPS-3' 引 物（10 y M)，總體積 50. 0 y 1，進(jìn)行第 2 輪 PCR。擴(kuò)增條件為 94°C 30s ;68°C 30s，72°C 3min， 20cycles ；72〇C 10min〇
[0032] 反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。切膠回收清晰的條帶后，進(jìn)行TA克 隆，篩選陽性單克隆后測序。
[0033] 5'RACE反應(yīng)：
[0034] 使用TaKaRa Tks Gf lex DNA Polymerase進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增。第一輪擴(kuò)增的 反應(yīng)總體積為 50. 0 y 1，包括 2. 5 y 1 5 ' RACE cDNA，25. 0 y 1 2 X Gf lex PCR buffer (Mg2+， dNTP plus)，1.0yl Tks Gflex DNA Polymerase (1.25units/yl)，0. 5yl 10 XUPM 引物， 1. 0 y 1 CTG0074R1引物（10 yM)和15. 5 y 1 ddH20 ;第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)總體積為50. 0 y 1， 包括 l.Oyl 第 1 輪PCR 反應(yīng)液，25.0yl 2XGflex PCR buffer(Mg2+，dNTP plus)， 1. 0 y 1 Tks Gflex DNA Polymerase (1. 25units/y 1),1. 0 y 1 5r PCR Primer II A 引物 和 CTG0074R2 引物（10 yM)，21. 0 y 1 ddH20。兩輪 PCR 擴(kuò)增條件均為 94°C lmin ;98°C 10s， 55〇C 15s,68〇C lmin，30cycles〇
[0035] 反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。切膠回收清晰的條帶后，進(jìn)行TA克 隆，篩選陽性單克隆后測序。
[0036] 1.6全長基因的拼接、擴(kuò)增
[0037] 利用CodonCodeAligner軟件進(jìn)行序列拼接。根據(jù)拼接后的序列，設(shè)計(jì)兩側(cè)引物， 從穿心蓮cDNA中進(jìn)行全長序列的擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。切膠回收清 晰的條帶后，進(jìn)行TA克隆，篩選陽性單克隆后測序。
[0038] 1. 7香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0039] 利用引物pAD12-GGPS-F和pAD12-GGPS-R，從陽性單克隆中擴(kuò)增ApGGPS基因的開 放閱讀框。上游引物的5'端引入了 Sac I酶切位點(diǎn)（GAGCTC)，下游引物的5'端引入了 Spe I 酶切位點(diǎn)（ACTAGT)。PCR 擴(kuò)增條件為 94°C 3min ;94°C 30s, 63°C 30min, 72°C 2min， 33cycles ;72°C 10min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，切膠回收略大于lkb 的條帶。
[0040] 用限制性內(nèi)切酶SacI和SpeI分別酶切回收的產(chǎn)物和PAD12原核表達(dá)質(zhì)粒。用 PCR產(chǎn)物清潔試劑盒純化回收的兩種產(chǎn)物，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。電擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化到蛋白酶缺陷性大腸桿菌XLl-BlueMRF'(即TKX1)中。
[0041] 用PCR法鑒定陽性單克隆菌落，獲得可表達(dá)香葉基香葉基焦磷酸合成酶的基因工 程菌。
[0042] 2結(jié)果與分析
[0043] 2. 1 總RNA提取
[0044] 利用無液氮法，提取獲得了質(zhì)量較好的穿心蓮總RNA(圖1)。
[0045] 2. 2保守區(qū)段擴(kuò)增和RACE
[0046] 保守區(qū)段擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，略小于500bp處有一條帶。回收 后，直接進(jìn)行測序，獲得408bp保守區(qū)段。采用巢式PCR進(jìn)行3' RACE擴(kuò)增，在500bp左右 各有一條帶；采用巢式PCR進(jìn)行5' RACE擴(kuò)增，在約lkb處有條帶。根據(jù)RACE結(jié)果，利用 兩側(cè)引物進(jìn)行擴(kuò)增后，獲得一條長1440bp的DNA序列如SEQN0:1，包含一個(gè)由1047個(gè)核苷 酸組成的香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因的完整開放閱讀框，編碼一條由348個(gè)氨基酸組 成的蛋白質(zhì)序列。
[0047] 2. 3獲得可表達(dá)香葉基香葉基焦磷酸合成酶的基因工程菌
[0048] 本研究通過構(gòu)建含有香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因的重組大腸桿菌工程菌，保 存于LB培養(yǎng)基中，表達(dá)出的香葉基香葉基焦磷酸合成酶大小約為37kD，編碼的氨基酸序列 如SEQN0:2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，其具有如SEQ ID NO: 1所述序列。2. 權(quán)利要求1所述基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)，其序列如SEQ ID N0:2。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，具有SEQ？NO:1序列。本發(fā)明所提供的穿心蓮香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因可以用于在穿心蓮中進(jìn)行熒光定量表達(dá)、基因功能驗(yàn)證等研究；可以用于制備DNA探針；可以轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器，通過表達(dá)或抑制表達(dá)等方式生產(chǎn)相應(yīng)的代謝成分。所提供的蛋白質(zhì)序列及其原核表達(dá)菌可以用來生產(chǎn)香葉基香葉基焦磷酸合成酶或制備抗體。以上發(fā)明，對于穿心蓮內(nèi)酯相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和利用具有重要的意義。
【IPC分類】C12N9/10, C12N15/54
【公開號】CN105063069
【申請?zhí)枴緾N201510552222
【發(fā)明人】王曉云, 鐘國躍, 陳蓉
【申請人】江西中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月2日