博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因及其應(yīng)用。首次在博落回基因組中發(fā)現(xiàn)3個參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因，包括Mc20113、Mc6407、Mc6408基因。利用釀酒酵母體系驗證通過上游前體飼喂分別驗證了這幾步反應(yīng)，可實現(xiàn)血根堿與白屈菜紅堿以及中間體的合成。本發(fā)明還通過釀酒酵母異源表達體系比較了博落回與罌粟同功能基因的轉(zhuǎn)化效率，發(fā)現(xiàn)博落回基因的轉(zhuǎn)化效率顯著高于罌粟。本發(fā)明進一步揭示了血根堿在博落回中合成的分子機制，為高血根堿與白屈菜紅堿含量博落回育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)；同時為血根堿與白屈菜紅堿的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗。
【專利說明】
博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基 因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及參與博落回中血根堿與 白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血根堿和白屈菜紅堿主要分布在血根（Sanguinaria canadensis L.)、鴉片磐粟 (Papaver somniferum L .)、花菱草（Eschscho Iz ia californica Cham.)、白屈菜 (畑elidonium majus)、紫堇（Corydalis edulis Maxim)和博落回（Macleaya cordata (Willd.)R.化.）當(dāng)中。最近二十年W來，血根堿已經(jīng)在歐洲作為替代抗生素的添加劑來促 進動物生長。目前博落回是全世界最主要的血根堿的來源植物，并且被歐洲食品安全局列 為動物飼用添加劑。血根堿和白屈菜紅堿的合成路徑在前期研究中已經(jīng)得到闡明。相關(guān)合 成基因已經(jīng)從鴉片磐粟（Papaver so皿iferum L.)、花菱草化schscholzia californica 化am.)等植物中克隆，但是尚未有任何基因從博落回中克隆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供博落回中參與血根堿和白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶 基因及其應(yīng)用。
[0004] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素 蛋白氧化酶基因，包括基因]?。20113、]^6407、]\^6408，它們的基因序列分別如56〇10齡.1- 3所示。
[0005] 所述的博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因編碼的蛋 白，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID No.4-6所示。
[0006] 本發(fā)明還提供含有上述基因的載體，含有上述基因的工程菌。還有上述基因在血 根堿與白屈菜紅堿合成中的應(yīng)用，W及上述基因在血根堿與白屈菜紅堿體外合成中的應(yīng) 用。具體應(yīng)用如下：
[0007] 基因 MC20113編碼博落回中催化網(wǎng)狀番慕枝堿生成金黃紫堇堿的小築堿橋接酶； [000引基因 MC6407和MC6408編碼博落回中催化二氨血根堿生成血根堿W及催化二氨白 屈菜紅堿生成白屈菜紅堿的二氨苯并菲晚氧化酶。
[0009]在之前的研究中，從去甲烏藥堿開始的血根堿與白屈菜紅堿的合成途徑在磐粟等 其它物種中已經(jīng)清晰，2個化合物共24步反應(yīng)，其中血根堿與白屈菜紅堿從去甲烏藥堿開始 均經(jīng)過12步反應(yīng)合成(包括1步不需要酶參與的自發(fā)反應(yīng)）。其中第1步到第5步反應(yīng)兩者的 合成酶相同W及第8到第12步反應(yīng)兩者的合成酶相同。為了找到博落回中合成血根堿與白 屈菜紅堿的合成基因，我們對博落回植株進行De Novo全基因組測序分析，同時對博落回根 莖葉花果實進行了轉(zhuǎn)錄組測序。首先W其他物種(磐粟，花菱草）中合成血根堿和白屈菜紅 堿的黃素蛋白氧化酶相關(guān)基因為參照基因，在博落回基因組中進行BLAST同源比對，找到了 14個合成血根堿與白屈菜紅堿的候選基因。由于博落回中的血根堿和白屈菜紅堿具有組織 特異性，2種生物堿均在果芙中含量最高，而兩種生物堿的重要前體化合物原阿片堿和別隱 品堿在根部中含量最高，而在莖部組織中生物堿含量極低。因此我們推測參與合成血根堿 與白屈菜紅堿的功能基因在博落回中的表達規(guī)律也應(yīng)該是根和果芙中高表達，莖中不表達 或者表達量極低。根據(jù)運種組織表達特異性，我們從14個候選基因中共篩選出4個符合運種 表達規(guī)律的基因。然后，我們利用酵母表達體系，在酵母中表達運些候選基因，通過分別飼 喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-TOF儀來檢測酵母提取物。
[0010] 我們用酵母驗證方法驗證博落回中參與血根堿和白屈菜紅堿的黃素蛋白氧化酶， 在通路中共有3步反應(yīng)屬于黃素蛋白氧化酶參與的步驟篩選出的4個基因，分別是MC20113、 Mc6407、Mc6408、Mc6426。我們分別構(gòu)建好表達運4個基因的酵母后，分別前體飼喂運2步反 應(yīng)的前體化合物網(wǎng)狀番慕枝堿、二氨血根堿、二氨白屈菜紅堿。之后我們通過UPLC-Q-T0F檢 測酵母提取物發(fā)現(xiàn)在飼喂網(wǎng)狀番慕枝堿的表達MC20113的酵母提取物中檢測到了下游產(chǎn)物 金黃紫堇堿W及在飼喂二氨血根堿的表達Mc6407、Mc6408的酵母提取物中檢測到了下游產(chǎn) 物血根堿與白屈菜紅堿，而在空白對照酵母組中沒有檢測到下游產(chǎn)物。因此我們認為 MC20113是博落回中催化網(wǎng)狀番慕枝堿生成金黃紫堇堿的小築堿橋接酶(McB肥），而MC6407 和MC6408是博落回中催化二氨血根堿生成血根堿W及催化二氨白屈菜紅堿生成白屈菜紅 堿的二氨苯并菲晚氧化酶(DB0X)。同時，我們還將博落回中催化二氨血根堿和二氨白屈菜 紅堿生成血根堿和白屈菜紅堿的二氨苯并菲晚氧化酶(McDBOX)與磐粟中催化運2步的二氨 苯并菲晚氧化酶(PsDBOX)進行效率比較，發(fā)現(xiàn)表達MC6408的酵母中產(chǎn)生的血根堿和白屈菜 紅堿的量要大于表達Mc6407和PsDBOX的酵母。證明博落回中二氨苯并菲晚氧化酶(McDBOX) 具有更高的催化效率。由于MC6426表達酵母中不產(chǎn)生運3種底物，因此不參與合成血根堿與 白屈菜紅堿。
[0011] 本發(fā)明首次在博落回基因組中發(fā)現(xiàn)參與血根堿與白屈菜紅堿合成的3個黃素蛋白 氧化酶基因，包括Mc20113、Mc6407、Mc6408。利用酵母體系驗證了血根堿和白屈菜紅堿合成 中黃素蛋白氧化酶參與的3步反應(yīng)，可實現(xiàn)血根堿和白屈菜紅堿的合成。本發(fā)明進一步掲示 了博落回中血根堿合成的分子機制，為高含量血根堿和白屈菜紅堿博落回育種提供了理論 依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，可用于大規(guī)模篩選育種材料；同時還為血根堿和白屈菜紅堿的 體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的從植物材料中提取血根堿的方法，實 現(xiàn)體外合成血根堿。
【附圖說明】
[0012] 圖1為血根堿與白屈菜紅堿合成通路圖，兩個化合物有部分合成通路相同，而本發(fā) 明是從中間產(chǎn)物烏藥堿開始研究，箭頭上分別標(biāo)出黃素蛋白氧化酶參與的步驟共3步反應(yīng)； 圖2為本發(fā)明通過分析RNA-Seq數(shù)據(jù)，從博落回基因組中發(fā)現(xiàn)與血根堿與白屈菜紅堿合成相 關(guān)的黃素蛋白氧化酶基因的候選基因；
[0013] 圖3為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測表達Mc20113酵母與空白酵母提取物中參與血 根堿與白屈菜紅堿合成第5步反應(yīng)，即網(wǎng)狀番慕枝堿至金黃紫堇堿的結(jié)果；
[0014] 圖4為本發(fā)明利用UPLC-Q-T0F檢測表達Mc6407、Mc6408酵母與空白酵母提取物中 參與血根堿合成第12步反應(yīng)即二氨血根堿至血根堿的結(jié)果，W及白屈菜紅堿合成第19步反 應(yīng)即二氨白屈菜紅堿至白屈菜紅堿的結(jié)果。同時，結(jié)果顯示表達Mc6408的酵母中產(chǎn)生的血 根堿和白屈菜紅堿的量要大于表達MC6407和PsDBOX的酵母。證明博落回中二氨苯并菲晚氧 化酶(McDBOX)具有更高的催化效率。
【具體實施方式】
[0015] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0016] 實施例1參與血根堿與白屈菜紅堿合成基因的挖掘與獲得
[0017] 1基因的挖掘
[0018] 由于血根堿與白屈菜紅堿在磐粟和花菱草等植物中的合成路徑已知（圖1 )，相關(guān) 的功能基因也已經(jīng)得到克隆。我們W其他物種（磐粟、花菱草）已公開在NCBI的合成血根堿 與白屈菜紅堿的黃素蛋白氧化酶相關(guān)基因序列為參照基因，在博落回De Novo全基因組序 列中進行化AST比對，共得到候選基因14條。又由于血根堿與白屈菜紅堿在果芙中含量極 高，莖中含量極低。前體化合物原阿片堿與別隱品堿在根部含量極高，莖中含量極低。W此 為線索，分析博落回根莖葉花果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-Seq)從14條候選基因中篩選符合根部和 果芙高表達，莖部不表達運一表達模式的基因，共得到4條(圖2)。4個黃素蛋白氧化酶基因， 分別是 Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426。
[0019] 2博落回Mc20113、Mc6407、Mc6408、Mc6426W及用于效率比較的磐粟中PsDBOX (JX390714)基因的獲得。
[0020] 首先制備博落回根部和果芙cDNA文庫，磐粟基因來自于人工合成（金唯智公司）， 然后利用正向引物和反向引物進行PCR擴增（引物序列見表1)。
[0021] 表1引物序列（5'-3')
[0022]
[0023] PCR反應(yīng)體系W20]il計為：10-20ng/]il模板化1，lOpmol/jil正向、反向引物各化1， lOmmol/L dNTP mix 0.化1，0.511/化高保真hq DNA聚合酶化laOXPCR反應(yīng)緩沖液化1，余 量為水。
[0024] PCR 反應(yīng)條件為:94 °C 5 分鐘；94 °C 20 秒，55 °C 20 秒，72 °C 2 分 30 秒，35 個循環(huán);72 °C 10 分鐘。
[0025] 將擴增得到的片段與PYES2載體（Invitrogen)連接，測序確認沒有突變。
[00%]實施例2利用酵母表達系統(tǒng)驗證血根堿與白屈菜紅堿合成候選基因的功能，比較 博落回與磐粟中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化效率
[0027] 將 1。20113、]?。6407、]\1。6408、]\1。6426、？3080乂基因分別構(gòu)建到表達載體9￥652 (Invitrogen)上，并轉(zhuǎn)化酵母菌。誘導(dǎo)酵母表達蛋白，然后進行前體飼喂收集酵母，裂解后 用甲醇抽提化合物，樣品制備好后用UPLC-Q-T0F進行檢測。結(jié)果分別如圖3-圖4所示。利用 酵母表達系統(tǒng)比較博落回中Mc6407、Mc6408與磐粟中PsDBOX的轉(zhuǎn)化效率(圖4)。
[0028] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進，運對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。 [00巧]序列說明：
[0030] 沈Q ID 齡.1-3分別為1。20113、]\^6407、]\^6408基因序列。
[0031] 沈Q ID齡.4-6分別為基因]\^20113、]\^6407、]\^6408編碼的氨基酸序列。
【主權(quán)項】
1. 博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因，包括基因 MC20113、 Mc6407、Mc6408，它們的基因序列分別如SEQIDNo.l-3所示。2. 權(quán)利要求1所述的博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的黃素蛋白氧化酶基因編 碼的蛋白，它們的氨基酸序列分別如SEQ ID No.4-6所示。3. 含有權(quán)利要求1所述基因的載體。4. 含有權(quán)利要求1所述基因的工程菌。5. 權(quán)利要求1所述基因在血根堿與白屈菜紅堿合成中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述基因在血根堿與白屈菜紅堿體外合成中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于， 基因 Mc20113編碼博落回中催化網(wǎng)狀番荔枝堿生成金黃紫堇堿的小檗堿橋接酶;基因 Mc6407和Mc6408編碼博落回中催化二氫血根堿生成血根堿以及催化二氫白屈菜紅堿生成 白屈菜紅堿的二氫苯并菲啶氧化酶。
【文檔編號】C12N15/53GK106047904SQ201610505727
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】曾建國, 黃鵬, 劉秀斌
【申請人】湖南美可達生物資源有限公司