本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種新型酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞中基因的表達(dá)受到多種因素的影響，如順式作用元件、反式作用因子等，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，與rna聚合酶相聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平及其它基因水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。其中，啟動(dòng)子是啟動(dòng)特定基因轉(zhuǎn)錄的dna序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件,也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要組成部分。啟動(dòng)子功能的強(qiáng)弱對(duì)于目的基因的表達(dá)至關(guān)重要。

啟動(dòng)子含有特異性dna序列，例如給rna聚合酶和招募rna聚合酶的轉(zhuǎn)錄因子提供可靠的初始結(jié)合位點(diǎn)。通常增高一個(gè)基因的表達(dá)量，會(huì)給它添加一個(gè)組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)上調(diào)的啟動(dòng)子，降低或關(guān)閉一個(gè)基因的表達(dá)，會(huì)給添加一個(gè)弱啟動(dòng)子或誘導(dǎo)下調(diào)的啟動(dòng)子。通過(guò)更換啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)在改變酵母的代謝途徑中得到了廣泛應(yīng)用。

酵母啟動(dòng)子有以下幾種類型：(1)組成型：是指能夠使基因在所有組織中都能啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子，其不受外界條件的影響。這類啟動(dòng)子不需要誘導(dǎo)物或抑制物，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具持續(xù)性。(2)誘導(dǎo)型：是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類型的啟動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能同時(shí)控制基因的表達(dá)量和基因的表達(dá)時(shí)間。在釀酒酵母中，一系列多種多樣的內(nèi)源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和改造過(guò)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子已被成功應(yīng)用于基因表達(dá)的調(diào)控。其中在釀酒酵母中，最為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控性啟動(dòng)子是來(lái)自半乳糖誘導(dǎo)的基因gal1、gal7、gal10。

上述兩種酵母啟動(dòng)子中組成型啟動(dòng)子不表現(xiàn)時(shí)空特異性，不受誘導(dǎo)物的調(diào)控，不能隨時(shí)調(diào)控基因的表達(dá)；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在酵母中最常用到的是pgal1,它可以被半乳糖誘導(dǎo)，但是在培養(yǎng)中需要先進(jìn)行棉子糖饑餓處理后半乳糖誘導(dǎo)，更換培養(yǎng)基耗時(shí)耗力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過(guò)如下措施實(shí)現(xiàn)的：一種新型酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，為序列表中序列1所示的dna序列；該啟動(dòng)子長(zhǎng)度為673bp。

其中，制備過(guò)程為：

(一)釀酒酵母的基因組dna提取：

①、收集5ml酵母細(xì)胞，離心(16000g,15s)后棄上清，加230uldna裂解液重懸菌體；

②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/異戊醇的混合溶液，渦旋3min；其中，苯酚、氯仿和異戊醇的質(zhì)量份數(shù)比為25:24:1；

③、離心(16000g,5min)后將水層轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的ep管中；

④、加600ul冰乙醇洗劑dna,然后將ep管放在-20℃中30min；

⑤、在4℃下離心收集dna(16000g,15min)，棄乙醇，在空氣中干燥3min；

⑥、用200ulte重懸dna,加5ulrna酶后37℃孵育10min；

⑦、加5mnacl8ul和兩倍體積的冰乙醇，在-20℃放置30min；離心(16000g,15min)后棄乙醇，放在空氣中干燥；

⑧、用水/te重懸dna,得到酵母基因組dna；

(二)用高保真phusion酶pcr擴(kuò)增得到ddi2啟動(dòng)子：

pcr體系的總體積50μl，其中phusion0.5μl、phusionbuffer10μl、dntpmix2μl、模板100ng、上游引物(濃度10μm)1μl、下游引物(濃度10μm)1μl、h2o補(bǔ)足到50μl；prc反應(yīng)條件為：98℃、1min條件下進(jìn)行預(yù)變，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72℃、10min進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到ddi2啟動(dòng)子。

其中，所述引物對(duì)的序列如下：

u1:5’-tctaagataaaacacagatcgac-3’

u2:5’-gattgattcttttgaagagaagc-3’。

另外，本發(fā)明還提供了所述的酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在調(diào)控酵母基因表達(dá)中的應(yīng)用：所述酵母為釀酒酵母。

其中，誘導(dǎo)物為氰胺。

其中，所述氰胺的濃度為5-8mm。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的新型的酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子ddi2，其可被氰胺高效誘導(dǎo)，啟動(dòng)子強(qiáng)度與已知誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子gal1相近，比組成型啟動(dòng)子adh1強(qiáng)，且不用更換培養(yǎng)基，可通過(guò)誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑的量控制基因的表達(dá)量，與常用的gal1啟動(dòng)子相比在時(shí)間成本和價(jià)格成本上更具優(yōu)勢(shì)。本專利將ddi2啟動(dòng)子與傳統(tǒng)的酵母組成型啟動(dòng)子adh1及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子gal1相比較，首先構(gòu)建三種“啟動(dòng)子-sfgfp”的單拷貝質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入酵母w303中，然后用熒光共聚焦顯微鏡拍照，并用流式細(xì)胞儀(fcm)檢測(cè)熒光表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示ddi2啟動(dòng)子強(qiáng)度大于adh1啟動(dòng)子,與gal1啟動(dòng)子強(qiáng)度相近，且所需誘導(dǎo)時(shí)間少于gal1啟動(dòng)子，不用更換培養(yǎng)基；并且ddi2啟動(dòng)子強(qiáng)度在誘導(dǎo)物氰胺濃度為5-8mm下強(qiáng)度最大。

附圖說(shuō)明

圖1為構(gòu)建ycplac111-padh1-sfgfp的質(zhì)粒圖譜。

圖2為構(gòu)建ycplac111-pgal1-sfgfp的質(zhì)粒圖譜。

圖3為構(gòu)建ycplac111-pddi2-sfgfp的質(zhì)粒圖譜。

圖4為三種啟動(dòng)子調(diào)控sfgfp表達(dá)在共聚焦顯微鏡下的結(jié)果。

圖5為兩種啟動(dòng)子在不同時(shí)間下調(diào)控?zé)晒獾谋磉_(dá)強(qiáng)度。

圖6為ddi2啟動(dòng)子在不同濃度氰胺誘導(dǎo)下的熒光強(qiáng)度。

圖7為不同濃度氰胺誘導(dǎo)下ddi2調(diào)控sfgfp在翻譯水平的表達(dá)情況。

序列1為ddi2啟動(dòng)子；

序列2為adh1啟動(dòng)子；

序列3為gal1啟動(dòng)子。

具體實(shí)施方式

為能清楚說(shuō)明本方案的技術(shù)特點(diǎn)，下面通過(guò)具體實(shí)施方式，對(duì)本方案進(jìn)行闡述。

本發(fā)明是通過(guò)如下措施實(shí)現(xiàn)的：一種新型酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，為序列表中序列1所示的dna序列；該啟動(dòng)子長(zhǎng)度為673bp。

其中，制備過(guò)程為：

(一)釀酒酵母的基因組dna提取：

①、收集5ml酵母細(xì)胞，離心(16000g,15s)后棄上清，加230uldna裂解液重懸菌體；

②、加入0.4g小玻璃珠，和200ul苯酚/氯仿/異戊醇的混合溶液，渦旋3min；其中，苯酚、氯仿和異戊醇的質(zhì)量份數(shù)比為25:24:1；

③、離心(16000g,5min)后將水層轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的ep管中；

④、加600ul冰乙醇洗劑dna,然后將ep管放在-20℃中30min；

⑤、在4℃下離心收集dna(16000g,15min)，棄乙醇，在空氣中干燥3min；

⑥、用200ulte重懸dna,加5ulrna酶后37℃孵育10min；

⑦、加5mnacl8ul和兩倍體積的冰乙醇，在-20℃放置30min；離心(16000g,15min)后棄乙醇，放在空氣中干燥；

⑧、用水/te重懸dna,得到酵母基因組dna；

(二)用高保真phusion酶pcr擴(kuò)增得到ddi2啟動(dòng)子：

pcr體系的總體積50μl，其中phusion0.5μl、phusionbuffer10μl、dntpmix2μl、模板100ng、上游引物(濃度10μm)1μl、下游引物(濃度10μm)1μl、h2o補(bǔ)足到50μl；prc反應(yīng)條件為：98℃、1min條件下進(jìn)行預(yù)變，然后98℃、10s，55℃、30s，72℃、40s，如此進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后在72℃、10min進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到ddi2啟動(dòng)子。

其中，所述引物對(duì)的序列如下：

u1:5’-tctaagataaaacacagatcgac-3’

u2:5’-gattgattcttttgaagagaagc-3’。

另外，本發(fā)明還提供了所述的酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在調(diào)控酵母基因表達(dá)中的應(yīng)用：所述酵母為釀酒酵母。

其中，誘導(dǎo)物為氰胺。

其中，所述氰胺的濃度為5-8mm。

實(shí)施例1、啟動(dòng)子強(qiáng)度比較

一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

1、用限制性內(nèi)切酶bamhi和sphi酶切質(zhì)粒ycplac111-sfgfp-his6-tcyc1，回收質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；

2、用phusion酶擴(kuò)增啟動(dòng)子padh1、pgal1、pddi2；回收pcr產(chǎn)物；

3、分別將步驟1的載體骨架和步驟2的回收產(chǎn)物用quick-fusion酶連接，得到三個(gè)重組質(zhì)粒(ycplac111-padh1-sfgfp-his6-tcyc1、ycplac111-pgal1-sfgfp-his6-tcyc1、ycplac111-pddi2-sfgfp-his6-tcyc1)，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，得到了三種目的質(zhì)粒，如圖1、圖2、圖3所示。

二、激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度

1、將上面構(gòu)建得到的三種啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母菌株w303中；

2、在sd-leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株(ynb6.7g/l，葡萄糖20g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l)。其中，pgal1需要在棉子糖培養(yǎng)基中饑餓3h(ynb6.7g/l，棉子糖10g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l),后在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)3h(ynb6.7g/l，半乳糖20g/l，ura0.02g/l，trp0.1g/l，his0.1g/l,ade0.02g/l,lys0.1g/l,met0.1g/l,arg0.1g/l)；pddi2先在sd-leu中培養(yǎng)3h,后加5mm氰胺誘導(dǎo)3h；padh1在sd-leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h；

3、分別取1od上述培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞,在室溫下5000rpm轉(zhuǎn)速離心2min，收集細(xì)胞，用1mlpbs洗滌一次，最后用1mlpbs重懸細(xì)胞，待顯微鏡觀察；

4、參照激光共聚焦顯微鏡操作方法，選用60倍油鏡，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，熒光強(qiáng)度100％，觀察酵母細(xì)胞在不同啟動(dòng)子調(diào)控下綠色熒光激發(fā)情況。如圖4所示，可以從熒光亮度大致看出ddi2啟動(dòng)子和gal1啟動(dòng)子強(qiáng)度差不多，且強(qiáng)度都大于adh1啟動(dòng)子。

三、流式細(xì)胞儀(facs)檢測(cè)熒光表達(dá)

1、按照前面共聚焦顯微鏡檢測(cè)的方法制備和處理樣品，參照流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)的操作方法，選用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)50000個(gè)細(xì)胞的熒光表達(dá)；

2、對(duì)于pgal1分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間下(2h、3h、4h)檢測(cè)其熒光表達(dá)，padh1在不同培養(yǎng)時(shí)間下(2h、3h、4h)檢測(cè)熒光表達(dá)(如圖5所示)，pddi2在4h誘導(dǎo)時(shí)間下用不同濃度的氰胺(0-8mm)誘導(dǎo)，檢測(cè)其熒光表達(dá)(如圖6所示)。

3、以上實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)三次，取meanfluorescence值做統(tǒng)計(jì)圖。

總結(jié)：通過(guò)三種啟動(dòng)子調(diào)控sfgfp表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度值比較，可看出酵母誘導(dǎo)性啟動(dòng)子ddi2強(qiáng)度比較大，且相比于gal1啟動(dòng)子其培養(yǎng)時(shí)間節(jié)省近一半。

實(shí)施例2、western檢測(cè)氰胺誘導(dǎo)pddi2調(diào)控sfgfp表達(dá)情況

1、將pddi2菌株在sd-leu培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h后，加入不同濃度(0-5mm)氰胺誘導(dǎo)4h，同時(shí)用w303野生菌株同樣培養(yǎng)(加5mm氰胺)做對(duì)照；

2、收集5od上述培養(yǎng)的菌液，按照酵母小量總蛋白的方法提蛋白。將得到的蛋白樣品用于western檢測(cè)(gfpantibody:1:2000)。

總結(jié)：由圖6、7可知，本啟動(dòng)子的誘導(dǎo)活性隨氰胺濃度增加而上升，在5-8mm濃度下有較強(qiáng)的活性。

本發(fā)明未經(jīng)描述的技術(shù)特征可以通過(guò)或采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)，在此不再贅述，當(dāng)然，上述說(shuō)明并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不僅限于上述舉例，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)所做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>青島百慧智業(yè)生物科技有限公司

<120>一種新型酵母誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及其應(yīng)用

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