專利名稱：Pns細(xì)胞系及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及PNS細(xì)胞系。本發(fā)明尤其涉及條件永生化的神經(jīng)嵴干細(xì)胞系和背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞系，以及由這些細(xì)胞系衍生的分化細(xì)胞。這些細(xì)胞系和/或分化細(xì)胞可以用來開發(fā)預(yù)防和治療神經(jīng)學(xué)上的疾病和其他癥狀的治療藥劑。本發(fā)明還涉及這些細(xì)胞系和/或分化細(xì)胞在實驗中和在PNS細(xì)胞發(fā)育、死亡和異常研究中的使用。
背景技術(shù)：
周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system,PNS)包括自主神經(jīng)系統(tǒng)和感覺神經(jīng)系統(tǒng)，受到多種目前難以治療的紊亂的影響。例如，還沒有對PNS紊亂如慢性疼痛、糖尿病引起的神經(jīng)病、化療引起的神經(jīng)病和夏-馬-圖三氏(Charcot-Marie-Tooth)癥(一種外周神經(jīng)病的遺傳形態(tài))普遍有效的治療。治療PNS紊亂的研究工作主要受限于缺乏足夠的細(xì)胞用于研究和開發(fā)。
感覺神經(jīng)元的分子和細(xì)胞特征已經(jīng)在原代背根神經(jīng)節(jié)(dorsalroot ganglion,DRG)培養(yǎng)物中進行了普遍研究。這些培養(yǎng)物含有展示許多感覺神經(jīng)元特化特征的神經(jīng)元。然而，這些培養(yǎng)物的根本缺點是細(xì)胞數(shù)目有限，無法滿足進行生化和分子研究的大量需要。
為了克服這個限制，一些研究人員已經(jīng)建立了永生化的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠分化成展示特定感覺特性的神經(jīng)元。例如，通過將有絲分裂后的胚胎(F-11細(xì)胞系；Platika等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:3499-3503,1985)或新生(ND細(xì)胞系；Wood等人，Proc.R.Soc.Lond.B 241:87-194,1990)大鼠DRG神經(jīng)元與小鼠N18Tg2成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，已經(jīng)建立了類感覺神經(jīng)元細(xì)胞系。這些雜交細(xì)胞系展示了一些DRG的選擇性特征，包括轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)受體。另外，已經(jīng)有了關(guān)于細(xì)胞內(nèi)電壓門控電流、突觸蛋白、連接糖基磷脂酰肌醇的分子和凋亡應(yīng)答的報導(dǎo)。這些特征使這些細(xì)胞系有助于研究和藥物開發(fā)，但是這些細(xì)胞系的使用受限于分化細(xì)胞所占的百分率低和傳代造成分化能力喪失。此外，一些細(xì)胞系展示神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)的雙重特征，而且目前無法得到人細(xì)胞。
相應(yīng)的，本領(lǐng)域中需要能夠容易分化的穩(wěn)定的PNS細(xì)胞系。本發(fā)明實現(xiàn)了這些需要并進一步提供其它相關(guān)優(yōu)勢。
發(fā)明概述簡單的說，本發(fā)明提供了能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的人PNS始祖細(xì)胞系。一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的方法，包括(a)將鋪在適宜增殖的第一種生長培養(yǎng)基中第一種表面上的大鼠神經(jīng)嵴細(xì)胞用編碼選擇標(biāo)記和可調(diào)控的生長促進基因的DNA轉(zhuǎn)染；和(b)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適宜附著和增殖的第二種生長培養(yǎng)基中第二種表面上；并由此產(chǎn)生條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞。合適的表面包括含有一種或多種多聚氨基酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原或組織培養(yǎng)塑料的底層。在某些實施方案中，生長促進基因是癌基因，諸如v-myc。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞。
在另一方面，提供了產(chǎn)生條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞的方法，包括(a)將鋪在適宜增殖的第一種生長培養(yǎng)基中第一種表面上貼壁的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞用編碼選擇標(biāo)記和可調(diào)控的生長促進基因的DNA轉(zhuǎn)染；和(b)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)移到適宜附著和增殖的第二種生長培養(yǎng)基中第二種表面上；并由此產(chǎn)生條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。在某些實施方案中，背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞是大鼠或人細(xì)胞。合適的表面包括含有一種或多種多聚氨基酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原或組織培養(yǎng)塑料的底層。在某些實施方案中，生長促進基因是癌基因，諸如v-myc。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。在某些實施方案中，條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染的大鼠或人細(xì)胞。這些細(xì)胞可能能夠分化成感覺神經(jīng)元和/或傷害感覺神經(jīng)元。
在另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生神經(jīng)元的方法，包括在抑制生長促進基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞。在某些實施方案中，細(xì)胞是條件永生化的大鼠或人背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞，而且細(xì)胞是在含有一種或多種分化劑的底層上培養(yǎng)的。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了由上述方法產(chǎn)生的神經(jīng)元。
本發(fā)明還提供了鑒定條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞能否分化成神經(jīng)元的方法，包括鑒定在增殖生長條件下是否存在βⅢ-微管蛋白陽性細(xì)胞，并由此鑒定細(xì)胞能否分化成神經(jīng)元的步驟。
在其它方面，提供了將PNS細(xì)胞移植到哺乳動物中的方法，包括給予哺乳動物上述細(xì)胞。
在另一方面，提供了治療病人的方法，包括給予病人上述細(xì)胞。在某些實施方案中，病人可能患有慢性疼痛和/或特征在于神經(jīng)退化的病理癥狀(如神經(jīng)病)。
還提供了篩選可調(diào)節(jié)由PNS細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的試劑的方法，包括(a)將如上所述產(chǎn)生的細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑調(diào)節(jié)由該細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的能力。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將樣品與上述細(xì)胞接觸；和(b)隨后檢測細(xì)胞中的應(yīng)答，并由此檢測樣品中是否存在蛋白質(zhì)。
還提供了鑒別人PNS基因或蛋白質(zhì)的方法，包括按上述檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在基因或蛋白質(zhì)。
在另一方面，本發(fā)明提供了篩選影響PNS細(xì)胞死亡的試劑的方法，包括(a)在候選試劑不存在時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的條件下，將上述細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑影響細(xì)胞死亡的能力。
本發(fā)明還提供了篩選可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)的方法，包括(a)改變蛋白質(zhì)在上述細(xì)胞中的表達(dá)水平；和(b)隨后測量上述改變對細(xì)胞死亡的影響，并由此鑒別可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的這些和其它方面在參考下列描述和附圖后將更為明顯。此處公開的所有參考文獻(xiàn)因此均單獨地整體引用作為參考。
附圖的簡要描述

圖1A和1B的照片顯示了由7周(圖1A)和9周(圖1B)孕齡的DRG細(xì)胞制備的，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人DRG始祖細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)。細(xì)胞在增殖生長條件中拍照。
圖2A-2D是由7周(圖2A和2C)和9周(圖2B和2D)孕齡的DRG細(xì)胞制備的，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人DRG始祖細(xì)胞培養(yǎng)物在增殖生長條件中的照片。圖2A和2B顯示了細(xì)胞的形態(tài)；圖2C和2D顯示了針對v-myc進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞。
圖3A和3B是由7周(圖3A)和9周(圖3B)孕齡的DRG細(xì)胞制備的，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人DRG始祖細(xì)胞培養(yǎng)物在增殖生長條件中的照片，其中細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白進行了免疫標(biāo)記。
圖4A-4D是由9周孕齡的DRG細(xì)胞制備，已分化的條件永生化的人DRG細(xì)胞的照片。圖4A顯示了細(xì)胞的形態(tài)；圖4B-4D顯示了針對β-Ⅲ微管蛋白(圖4B)、NF160(圖4C)和物質(zhì)P(圖4D)進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞。
圖5的照片描繪了兩個克隆的人PNS細(xì)胞系(C12和C10)的基因組DNA雜交實驗結(jié)果。DNA用HindⅢ(左邊兩道)、EcoRⅠ(中間兩道)或BamHⅠ(右邊兩道)消化。
圖6A和圖6B的照片顯示了兩個無性系的人DRG始祖細(xì)胞系的形態(tài)。圖6A顯示了克隆C10，而圖6B顯示了克隆C12。
圖7A-7E圖示了v-myc在有代表性的無性系的人DRG始祖細(xì)胞系C10中的表達(dá)。圖7A的照片顯示了細(xì)胞在增殖條件中的形態(tài)；圖7B顯示了圖7A中針對v-myc進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞；圖7C顯示了當(dāng)四環(huán)素(1μg/ml)存在時細(xì)胞的形態(tài)；而圖7D顯示了圖7C中針對v-myc進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞。圖7E的柱狀圖顯示了在增殖狀態(tài)中和用四環(huán)素(tet)誘導(dǎo)分化后，v-myc陽性細(xì)胞所占的百分率。
圖8A-8C的照片圖示了有代表性的無性系的人DRG始祖細(xì)胞系C10分化后的免疫標(biāo)記。細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白(圖8A)、NF160(圖8B)和物質(zhì)P(圖8C)進行了免疫標(biāo)記。
圖9的柱狀圖顯示了無性系的人DRG始祖細(xì)胞系C10在不同條件下分化的神經(jīng)元標(biāo)記的定量測定。顯示了對β-Ⅲ微管蛋白(每對中的左柱)和NF160(每對中的右柱)標(biāo)記呈陽性的細(xì)胞所占的百分比。左邊的一對柱狀圖顯示了當(dāng)四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)、NGF(25ng/ml)和視黃酸(0.5μM)存在時細(xì)胞分化的結(jié)果，而右邊的一對柱狀圖顯示了當(dāng)四環(huán)素、人血清、GDNF、CNTF、NGF和毛喉素(10μM)存在時細(xì)胞分化的結(jié)果。
圖10A和10B是有代表性的條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的照片。圖10A顯示了細(xì)胞的形態(tài)，而圖10B顯示了針對v-myc進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞。
圖11A-11D的照片圖示了在不同條件下，β-Ⅲ微管蛋白在有代表性的條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞中的表達(dá)。在每種情況中，細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白進行了免疫標(biāo)記。圖11A顯示了在增殖條件中(不含四環(huán)素)的細(xì)胞；圖11B顯示了當(dāng)四環(huán)素(1μg/ml)存在時的細(xì)胞；圖11C顯示了當(dāng)四環(huán)素(1μg/ml)、表皮生長因子(EGF；100ng/ml)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF；4ng/ml)和神經(jīng)生長因子(NGF；20ng/ml)存在時的細(xì)胞；而圖11D顯示了當(dāng)四環(huán)素(1μg/ml)和白血病抑制因子(LIF；100ng/ml)存在時的細(xì)胞。
圖12的柱狀示了在不同條件下，β-Ⅲ微管蛋白在有代表性的條件永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中的表達(dá)。細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白進行了免疫標(biāo)記，而結(jié)果用具有β-Ⅲ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞所占的百分率表示。細(xì)胞在四環(huán)素(T；1μg/ml)；四環(huán)素和NGF(TNGF；20ng/ml)；或四環(huán)素(1μg/ml)和NT-3(TNT3；20ng/ml)中生長。
圖13的柱狀示了在不同條件下，β-Ⅲ微管蛋白在有代表性的條件永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中的表達(dá)。細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白進行了免疫標(biāo)記，而結(jié)果用具有β-Ⅲ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞所占的百分率表示。如圖所示，細(xì)胞在四環(huán)素(T；1μg/ml)、毛喉素(FSK；10μM)、PMA(20nM)、GDNF(G；25ng/ml)、CNTF(C；25ng/ml)和/或大鼠血清(RS；2.5％)的不同組合中生長。
圖14的柱狀示了在不同條件下，β-Ⅲ微管蛋白在有代表性的條件永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中的表達(dá)。細(xì)胞針對β-Ⅲ微管蛋白進行了免疫標(biāo)記，而結(jié)果用具有β-Ⅲ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞所占的百分率表示。如圖所示，細(xì)胞在四環(huán)素(T)、毛喉素(FSK；10μM)、GDNF(G；25ng/ml)、CNTF(C；25ng/ml)、視黃酸(RA；0.5μM)和/或大鼠血清(RS；2.5％)的不同組合中生長。
圖15A和15B是條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞在大鼠尾部膠原底層上分化1.5周后的照片。圖15A顯示了針對NF160進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞，而圖15B顯示了細(xì)胞的形態(tài)。
圖16的柱狀示了在不同條件下分化的有代表性的條件永生化大鼠DRG培養(yǎng)物中β-Ⅲ微管蛋白和NF160的表達(dá)。細(xì)胞進行了針對β-Ⅲ微管蛋白和NF160的免疫標(biāo)記，而結(jié)果用具有β-Ⅲ微管蛋白(斜線條)或NF160(實心條)免疫反應(yīng)性的細(xì)胞所占的百分率表示。細(xì)胞在大鼠尾部膠原底層或merosin上分化，如圖所示，而且含有四環(huán)素(1μg/ml)、大鼠血清(2.5％)和視黃酸(0.5μM)，連同白血病抑制因子(LIF；10ng/ml)、神經(jīng)生長因子(NGF；100ng/nl)、NT-3(10ng/ml)、CNTF(10ng/ml)、SCF(10ng/ml)、IL-11(10ng/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)和/或GDNF(10ng/ml)的各種組合。
圖17A-17F的照片圖示了在有代表性的條件永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中針對β-Ⅲ微管蛋白(圖17A和17D)、物質(zhì)P(圖17B和17E)和NF160(圖17C和17F)進行的免疫標(biāo)記，所述細(xì)胞在四環(huán)素(1μg/ml)、大鼠血清(2.5％)、視黃酸(0.5μM)和白介素-1,β(IL-1β；10ng/ml)中，NGF(100ng/ml)存在(圖17D-17F)或不存在(圖17A-17C)的條件下進行分化。箭頭指示針對β-Ⅲ微管蛋白和物質(zhì)P進行了雙重標(biāo)記的細(xì)胞。
圖18A-18F的照片圖示了在有代表性的條件永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中針對β-Ⅲ微管蛋白(圖18A和18D)、物質(zhì)P(圖18B和18E)和NF160(圖18C和18F)進行的免疫標(biāo)記，細(xì)胞在四環(huán)素(1μg/ml)、大鼠血清(2.5％)、視黃酸(0.5μM)、NGF(100ng/ml)和CNTF(10ng/ml)中，NT-3(10ng/ml)存在(圖18D-18F)或不存在(圖18A-18C)的條件下進行分化。
圖19描繪了由有代表性的已分化的條件永生化的人DRG細(xì)胞電生理學(xué)記錄的結(jié)果。在左邊的記錄圖中，顯示了應(yīng)答電流刺激的動作電位。在右邊的記錄圖中，膜電位中的去極化步驟(-70→+10mV)引起了快速向內(nèi)電流，跟隨持續(xù)的向外電流，可能分別由鈉和鉀離子引起。
圖20描繪了由有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞(對照)記錄的動作電位。應(yīng)答電流刺激，激發(fā)了一個動作電位(對照)，被0.5μM河豚毒素(TTX)阻斷。
圖21描繪了來自有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞的鉀電流記錄結(jié)果。細(xì)胞去極化(膜電位由-40→65mV)；電流強度(I)作為測試電壓(V)的函數(shù)顯示。
圖22描繪了來自有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞的鈣電流記錄結(jié)果。細(xì)胞去極化(膜電位由-70→+50mV)；電流強度(I)作為測試電壓(V)的函數(shù)顯示，5mM鈣(5Ca)或5mM鋇(5Ba)作為電荷載體。
圖23描繪了在有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞中電壓門控鈣電流的電生理學(xué)分析結(jié)果。如圖所示，顯示了用各種化合物處理對鈣通道電流強度的影響。
圖24描繪了有代表性的已分化的條件永生化的人DRG細(xì)胞對αβ-亞甲基-ATP的電生理學(xué)應(yīng)答。
圖25描繪了有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞對ATP的電生理學(xué)應(yīng)答。
圖26描繪了有代表性的已分化的條件永生化的人DRG C10細(xì)胞對辣椒素的電生理學(xué)應(yīng)答。拮抗劑capsazepine(CZ)能夠抑制該應(yīng)答。
圖27描繪了在有代表性的已分化的條件永生化的人DRG C10細(xì)胞中的H+門控電流。
圖28描繪了在有代表性的已分化的條件永生化的大鼠DRG細(xì)胞中的H+門控電流。
圖29的柱狀示了增殖性人DRG C10細(xì)胞系亞克隆中針對β-Ⅲ微管蛋白進行的免疫標(biāo)記。如圖所示，顯示了亞克隆HDRGⅧ-C10.1、-C10.2、-C10.3、-C10.4、-C10.5和-C10.6中表達(dá)β-Ⅲ微管蛋白的細(xì)胞所占的平均百分率。
圖30是HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞在四環(huán)素、人血清、毛喉素、GDNF、CTNF和NGF中分化后的照片。
圖31的柱狀示了在增殖的和已分化的人DRG C10.6細(xì)胞系亞克隆中Islet-l和外周蛋白的表達(dá)。顯示了在四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、毛喉素(10μM)、GDNF(25ng/ml)、CTNF(25ng/ml)和NGF(25ng/ml)中NT-3(25ng/ml)存在(左邊的一對)或不存在(右邊的一對)時分化的細(xì)胞中，針對Islet-1(每對中的左柱)和外周蛋白(每對中的右柱)進行了免疫標(biāo)記的細(xì)胞所占的平均百分率。
圖32是人DRG C10.6亞克隆用辣椒素刺激的培養(yǎng)物的照片，顯示了對鈷的攝取。
圖33A和33B的凝膠照片描繪了由增殖的和已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞以及人DRG組織分離得到的mRNA的PCR分析結(jié)果。引物對Brn3a(圖33A)和DRG11(圖33B)的mRNA是特異的，用RPL27作為內(nèi)部對照。RPL27是核糖體持家基因。
圖34描繪了在已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中電壓門控鈉電流的電生理學(xué)記錄。
圖35描繪了在已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中辣椒素激活的電流的電生理學(xué)記錄。
圖36描繪了在已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中αβ-亞甲基-ATP激活的電流的電生理學(xué)記錄。
圖37描繪了在已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中H+門控電流的電生理學(xué)記錄。
發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明主要涉及條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系、由這些細(xì)胞系產(chǎn)生的分化細(xì)胞和使用這些始祖細(xì)胞和/或分化細(xì)胞的方法。特別的，本發(fā)明涉及能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的神經(jīng)嵴干細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞，以及這些細(xì)胞在藥物開發(fā)、移植研究、治療方法和各種實驗中的使用。本發(fā)明的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系可以，但不必須，是無性細(xì)胞系。此處所述的細(xì)胞系可提供無限的、可恢復(fù)的同質(zhì)細(xì)胞供應(yīng)，從而有助于PNS藥物開發(fā)。
條件永生化的PNS始祖細(xì)胞通常可以由含有這些始祖細(xì)胞的任何胎兒或成體組織制備。合適的組織對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，包括神經(jīng)嵴、感覺神經(jīng)節(jié)、交感神經(jīng)節(jié)、副交感神經(jīng)節(jié)、腎上腺髓質(zhì)和周圍神經(jīng)。在某些實施方案中，神經(jīng)嵴干細(xì)胞或背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)前體細(xì)胞被條件永生化，而且優(yōu)選組織由人或大鼠得到。首先使用常規(guī)技術(shù)將組織碎片分離以得到單細(xì)胞懸浮液。然后在適宜增殖的培養(yǎng)基(即至少1％的細(xì)胞會在24小時內(nèi)倍增)中，使細(xì)胞在表面上貼壁。合適的表面包括，但不限于，含有一種或多種多聚氨基酸(如多聚賴氨酸或多聚鳥氨酸)、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原(如大鼠尾部膠原)或組織培養(yǎng)塑料的底層。合適的培養(yǎng)基有添加了FGF-2(人重組的，0.5-40ng/ml)的L-15C，其中L-15C含有Leibovitz氏L-15培養(yǎng)基和N2補充液，10％雞胚提取物、牛血清白蛋白(1mg/ml)、地塞米松(39pg/ml)、α-d-1-生育酚(5μg/ml)、β-羥基丁酸鹽(63μg/ml)、氯化鈷(25ng/ml)、生物素(1μg/ml)、油酸(10ng/ml)、甘油(3.6mg/ml)、α-促黑激素(100ng/ml)、前列腺素E1(10ng/ml)、三碘甲腺原氨酸(67.5ng/ml)和穩(wěn)定的維生素混合物，含天冬氨酸(14μg/ml)、L-谷氨酸(14μg/ml)、L-脯氨酸(14μg/ml)、L-胱氨酸(14μg/ml)、對氨基苯甲酸(5μg/ml)、β-丙氨酸(5μg/ml)、維生素B12(0.2μg/ml)、i-肌醇(9μg/ml)、氯化膽堿(9μg/ml)、富馬酸(23μg/ml)、輔酶A(37ng/ml)、d-生物素(2ng/ml)和DL-6,8-thioticacid(0.5μg/ml)。細(xì)胞鋪板密度范圍可以取大約1.1～2.5×105個細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿。
PNS始祖細(xì)胞的條件永生化可以通過將貼壁細(xì)胞用含有生長促進基因(即在適宜條件下，該基因編碼的蛋白質(zhì)促進轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長)的任何合適載體轉(zhuǎn)染進行，其中生長促進蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或活性受外部因子的調(diào)控。通常，生長促進基因的表達(dá)調(diào)控應(yīng)當(dāng)相對嚴(yán)緊(即當(dāng)啟動子被抑制時，用此處所述的免疫熒光技術(shù)通常應(yīng)當(dāng)檢測不到生長促進基因的表達(dá))。在優(yōu)選的實施方案中，生長促進基因是癌基因，諸如，但不限于，v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤病毒大T抗原、E1a腺病毒或人乳頭瘤病毒的E7蛋白質(zhì)。
生長促進基因的外部調(diào)控可以通過將生長促進基因置于可外部調(diào)控的啟動子(即啟動子的活性可以由例如改變轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溫度或細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基的組成控制)的控制之下來實現(xiàn)。外部調(diào)控方法優(yōu)選使用四環(huán)素(tet)控制的基因表達(dá)系統(tǒng)(參閱Gossen等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展89:5547-5551,1992；Hoshimaru等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展93:1518-1523,1996)。當(dāng)tet不存在時，載體中tet控制的反式激活蛋白(tTA)強烈激活由phCMV*-1(融合到tet操縱子序列中的來自人巨細(xì)胞病毒的最小啟動子)起始的轉(zhuǎn)錄。tTA是E.coli轉(zhuǎn)座子10衍生的tet抗性操縱子的抑制子(tetR)和單純皰疹病毒VPl6的酸性結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。低、無毒濃度的tet(0.01-1.0μg/ml)幾乎完全消除tTA的反式激活作用。
在優(yōu)選的實施方案中，載體還含有編碼選擇性標(biāo)記(如提供藥物抗性的蛋白質(zhì))的基因。細(xì)菌新霉素抗性基因(neoR)就是一種可以用于本發(fā)明的標(biāo)記。使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的方法可以將攜帶neoR的細(xì)胞選擇出來，諸如向生長培養(yǎng)基中加入25-100μg/mlG418。顯而易見的是，也可以使用其它標(biāo)記，而且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易的進行適當(dāng)?shù)倪x擇。
可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的多種方法中的任何一種來進行轉(zhuǎn)染，包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。通常，貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以通過感染合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒(如VSV-G假型LINX v-myc逆轉(zhuǎn)錄病毒，如下所述)來進行。為了得到較高原種濃度的病毒，以得到在選定培養(yǎng)基中的原種(離心后)和提高對人細(xì)胞的感染力，優(yōu)選使用VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒。由于VSV-糖蛋白受體比傳統(tǒng)的兼嗜性包膜蛋白受體含量更豐富且種特異性較低，最近開發(fā)的(非傳統(tǒng)的)VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可能對感染人細(xì)胞尤其有用。此外，已經(jīng)有報導(dǎo)VSV-G假型病毒顆粒能夠承受超速離心，可以濃縮病毒并用適宜神經(jīng)始祖細(xì)胞的生長培養(yǎng)基重懸(參閱Burns等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展90:8033-8037,1993)。
例如，如上所述制備的始祖細(xì)胞培養(yǎng)物可以在貼壁4天內(nèi)通過與逆轉(zhuǎn)錄病毒溫育大約20小時(存在4μg/ml polybrene)進行感染。然后用新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)從而除去逆轉(zhuǎn)錄病毒。
轉(zhuǎn)染之后，將培養(yǎng)物傳代到適宜貼壁和增殖的生長培養(yǎng)基(即至少1％的細(xì)胞在24小時內(nèi)倍增)中的表面上。可以如上所述評估增殖情況。表面適宜貼壁的能力可以通過可視顯微鏡觀察評估。通常，大約20％的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)附著到表面上。合適的生長培養(yǎng)基如上所述。合適的表面包括，但不限于，含有一種或多種多聚氨基酸(如多聚賴氨酸或多聚鳥氨酸)、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原(如大鼠尾部膠原)或組織培養(yǎng)塑料的底層。底層優(yōu)選組織培養(yǎng)塑料或用纖連蛋白處理過的表面(如用16-100μg/ml纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)塑料)。然后每2-3天換用新鮮生長培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞鋪滿50％以上時，條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系可以使用常規(guī)技術(shù)傳代，諸如胰蛋白酶消化。細(xì)胞還可以在液氮中長期凍存。
可以由如上所述制備的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系分離得到無性細(xì)胞系。通常，這些無性細(xì)胞系可以使用常規(guī)技術(shù)分離(諸如有限稀釋或使用克隆環(huán))并擴增。無性細(xì)胞系通?？梢匀缟纤雠囵B(yǎng)并傳代。
條件永生化的人PNS始祖細(xì)胞系(可以，但不必須，是無性系的)通?？梢酝ㄟ^抑制生長促進基因的表達(dá)(即抑制生長促進蛋白的表達(dá)量和/或活性)來誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元。例如，如果編碼生長促進蛋白的基因是受可外部調(diào)控的啟動子控制的，則可以改變條件(如溫度或培養(yǎng)基的組成)來抑制生長促進基因的轉(zhuǎn)錄。對于上述四環(huán)素控制的基因表達(dá)系統(tǒng)，可以通過加入四環(huán)素來抑制生長促進基因的轉(zhuǎn)錄從而實現(xiàn)分化。通常，1μg/ml四環(huán)素處理4-5天對神經(jīng)元的形態(tài)分化是足夠的。分化不需要高密度細(xì)胞。
通常，細(xì)胞可以在底層上分化。用于大鼠DRG細(xì)胞分化的底層優(yōu)選大鼠尾部膠原，雖然也可以使用其它底層，包括多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、纖連蛋白、多聚鳥氨酸/層粘連蛋白或分區(qū)蛋白。這些底層還可以用于永生化的大鼠神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化。對于永生化的人DRG細(xì)胞，優(yōu)選使用多聚鳥氨酸/層粘連蛋白，雖然其它底層諸如大鼠尾部膠原也是合適的。
為了進一步促進分化，生長培養(yǎng)基中還可以含有額外的分化劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明中，在含有tet(如1μg/ml)和血清(如人或大鼠血清；2.5％)的生長培養(yǎng)基中可以實現(xiàn)分化的改善。可以提供進一步好處的其它分化劑包括視黃酸(如0.5μM)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3，如50ng/ml)、毛喉素(如10μM)、二丁?；h(huán)AMP(如100μM)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX；如50μM)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF；如25ng/ml)、ciliary neurotrophic factor(CNTF；如25ng/ml)和/或神經(jīng)生長因子(NGF；如20-25ng/ml)。例如，對永生化的大鼠DRG始祖細(xì)胞的分化特別有利的條件包括四環(huán)素(1μg/ml)、大鼠血清(2.5％)、視黃酸(0.5μM)、NGF(20ng/ml),添加IL-11或IL-1β(10ng/ml)，并與大鼠尾部膠原底層組合使用。正如另一個實施例，對永生化的人DRG始祖細(xì)胞的分化特別有利的條件包括四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、毛喉素(10μM)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)加NGF(20-25ng/ml)。分化劑的使用在下文詳細(xì)討論。
始祖細(xì)胞系和分化細(xì)胞系的鑒定通常都可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)進行，包括細(xì)胞類型的形態(tài)學(xué)分析、免疫細(xì)胞化學(xué)和PCR(鑒定細(xì)胞類型特異性標(biāo)記和受體，和確認(rèn)生長促進基因的存在)以及電壓和配基門控電流的電生理學(xué)分析。簡單的說，神經(jīng)元細(xì)胞可以根據(jù)明亮相細(xì)胞體和細(xì)長突起的存在進行形態(tài)學(xué)鑒定。神經(jīng)元標(biāo)記包括MAP2a/b、tau和神經(jīng)絲。此外，βⅢ微管蛋白可以作為早期神經(jīng)元標(biāo)記，NF160是成熟神經(jīng)元標(biāo)記，而物質(zhì)P和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是傷害性標(biāo)記(參閱Hunt和Rossi,Philos.Trans.R.Soc.Lond.(Biol.)308:283-289,1985；Holzer，神經(jīng)科學(xué)(Neuroscience)24:739-768,1988)。這些標(biāo)記的存在與否可以使用常規(guī)的免疫熒光技術(shù)(例如，使用商品化的一抗和熒光劑)容易的測定，而編碼這些標(biāo)記的mRNA的水平可以使用PCR或雜交技術(shù)測定。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉的電生理學(xué)分析可以用來評估鈉、鉀和鈣電流，以及配基門控電流(如ATP和辣椒素)，由此測定功能性通道和受體的水平。
正如上文指出的，此處所述的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)元。分化成神經(jīng)元的細(xì)胞所占的百分率，以及整合位點(如v-myc)，通常貫穿65代多仍是穩(wěn)定的。某些條件永生化的PNS始祖細(xì)胞可以分化成傷害感覺神經(jīng)元(即介導(dǎo)傷害感覺的一類感覺神經(jīng)元)。傷害感覺神經(jīng)元可以根據(jù)傷害性標(biāo)記的表達(dá)進行鑒定，包括辣椒素敏感性、物質(zhì)P和CGRP。傷害感覺神經(jīng)元可恢復(fù)的來源，諸如能夠分化成傷害感覺神經(jīng)元的細(xì)胞系，對于疼痛的基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)是特別有用的，包括，但不限于，發(fā)現(xiàn)新基因、確認(rèn)靶(基因或蛋白質(zhì))和體外實驗和篩選。
在本發(fā)明的某些方面，條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系可以用于多種體外實驗和篩選。在這個方面，這些細(xì)胞系可以用于辣椒素應(yīng)答的抑制劑的體外實驗。簡單的說，可以在用鈷組織學(xué)方法可以評估辣椒素應(yīng)答的條件下進行無性系的神經(jīng)元細(xì)胞系的分化。當(dāng)存在候選試劑或否時，可以向培養(yǎng)基中加入辣椒素，并測定對鈷的攝取。阻斷鈷染色的試劑可以作為辣椒素受體的拮抗劑。
不管具體模型如何，使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的實驗技術(shù)，可以將這些細(xì)胞用于研究凋亡機制，以及各種條件和試劑對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響。例如，可以將該細(xì)胞用于篩選影響PNS細(xì)胞死亡的試劑。這樣的篩選可以如下進行，在生長因子消除過程中將細(xì)胞與候選試劑接觸，然后測定候選試劑影響隨后的凋亡水平的能力。相似的，可以將細(xì)胞用于篩選調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。在這樣的篩選中，(使用常規(guī)技術(shù))改變細(xì)胞內(nèi)候選蛋白質(zhì)(如酶)的表達(dá)或活性水平，然后測量(包括，但不限于，消除生長因子)處理后上述改變對凋亡水平的影響。
在本發(fā)明的另一方面，此處所述的細(xì)胞系可以用于研究蛋白質(zhì)和/或基因在PNS細(xì)胞環(huán)境中的表達(dá)的系統(tǒng)。例如，使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的方法，可以測驗受體的表達(dá)和/或活性，而且可以評估各種改變對這些表達(dá)和/或活性的影響。在一種這樣的方法中，可以將細(xì)胞系永久的或暫時的用一種或多種感興趣的基因轉(zhuǎn)染，諸如，但不限于，產(chǎn)生或修飾感興趣的膜蛋白、分泌蛋白或胞內(nèi)蛋白的基因。這些基因包括離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)受體和/或MAP激酶。在此處所述的這個和其它方面，可以使用未分化的或已分化的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞。此外，可以使用不同時齡和在多種條件中生長的細(xì)胞。對于這些研究，本發(fā)明的細(xì)胞系比現(xiàn)有的細(xì)胞系具有許多優(yōu)點，包括提供能夠產(chǎn)生神經(jīng)元的無性細(xì)胞系的能力和條件永生化的特性(使得細(xì)胞能夠停留在發(fā)育的特定階段)。選擇用于任何特定研究的特殊細(xì)胞取決于研究的目的，而本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用此處所述的技術(shù)將能夠容易的制備合適的PNS細(xì)胞。
還有一個方面，已分化的和未分化的此處所述的條件永生化的PNS細(xì)胞系可以用于多種核酸和/或蛋白質(zhì)實驗。為了檢測這些PNS細(xì)胞中的特定核酸序列(即DNA和/或RNA)，可以使用PCR這種廣為人知的方法和多種雜交技術(shù)。使用例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Mannual)，冷泉港實驗室，冷泉港，N.Y.,1989中所述的方法，可以容易的設(shè)計和實施這些實驗。為了檢測蛋白質(zhì)，典型的檢測試劑是可以如下所述制備的抗體。使用抗體來檢測樣品中的蛋白質(zhì)，有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的多種實驗形式。參閱，例如Harlow和Lane，抗體實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室，1988。用于這些實驗的抗體可以是多克隆的或單克隆的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的多種技術(shù)制備抗體，而對感興趣的蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體可以使用，例如Kohler和Milstein(歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)6:511-519,1976)的技術(shù)及其改進方法制備。
在相關(guān)方面，已分化的或未分化的此處所述的條件永生化的PNS細(xì)胞系可以用于篩選調(diào)節(jié)PNS細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的試劑。調(diào)節(jié)包括抑制或增強感興趣蛋白質(zhì)的活性。這種調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平，或者可能是改變完整蛋白質(zhì)活性的結(jié)果。蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)可以是直接的(即調(diào)節(jié)劑可以與感興趣的蛋白質(zhì)直接發(fā)生反應(yīng))或間接的(即調(diào)節(jié)劑可以改變一種或多種其它蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性，進而調(diào)節(jié)感興趣的蛋白質(zhì)的活性)。調(diào)節(jié)劑可以是抗體(如單克隆的)、多核苷酸或其它藥物?？梢栽谶@種篩選中鑒定調(diào)節(jié)任何細(xì)胞蛋白質(zhì)活性的試劑。特別的，可以鑒定蛋白質(zhì)諸如神經(jīng)遞質(zhì)受體(如ATP受體，辣椒素受體)、生長因子受體(如FGF-2、NGF、BDNF、NT-3、GDNF和/或CTNF的受體)或離子通道(如鈉通道、鈣通道和/或鉀通道)的調(diào)節(jié)劑。
通常，調(diào)節(jié)劑的鑒定可以如下進行，將此處所述的PNS細(xì)胞與候選試劑接觸，并使用常規(guī)技術(shù)，諸如PCR、雜交(測定mRNA水平)或者任何適合感興趣的蛋白質(zhì)的各種免疫實驗或功能實驗，測定候選試劑對感興趣蛋白質(zhì)的水平或活性的影響。例如，可以進行鈣敏感的或電壓敏感的染料偶聯(lián)實驗、cAMP測定和/或受體結(jié)合實驗來測定候選調(diào)節(jié)劑的作用。通常，用于這種篩選的抗體或其它試劑合適的用量將隨特定蛋白質(zhì)變化，但是在大約10μg～100mg范圍內(nèi)。
在另一方面，此處所述的PNS始祖細(xì)胞系可以用于鑒定人PNS細(xì)胞中存在的新基因和蛋白質(zhì)。可以使用傳統(tǒng)的或較新的技術(shù)，諸如PCR、差異顯示、雜交、表達(dá)文庫篩選、免疫實驗和雙雜交實驗進行這種鑒定。特別有用的技術(shù)是差異基因篩選。此處所述的無性系的PNS細(xì)胞系特別適合于這些研究，因為它們衍生自單個親代細(xì)胞，故相對于非無性系的PNS細(xì)胞系，PNS細(xì)胞特異的基因可以由此得到擴增。還可以鑒定進行實驗操作(如感覺神經(jīng)元分化或誘導(dǎo)凋亡)后表達(dá)的新基因和蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系還可以用于檢測樣品中特定蛋白質(zhì)存在與否的實驗。通常，實驗可以如下進行，將PNS始祖細(xì)胞與樣品接觸，然后使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉的方法測量細(xì)胞內(nèi)該蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的應(yīng)答。例如，可以使用差異顯示技術(shù)測量應(yīng)答。
在其它方面，此處所述的PNS始祖細(xì)胞系可以用于體內(nèi)、移植研究和治療病人。例如，可以將細(xì)胞移植到動物諸如大鼠、小鼠或猴的神經(jīng)系統(tǒng)。可以對移植到正在發(fā)育的或成體的PNS中時該細(xì)胞的分化進行研究。還可以檢驗在病理條件下細(xì)胞作為治療藥劑的能力。特別的，細(xì)胞自身可能具有功能性取代在神經(jīng)退化性紊亂中死亡的神經(jīng)元的能力，或者可以作為具有治療作用的試劑(諸如營養(yǎng)因子)的來源。這些試劑可以由內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的基因產(chǎn)生。
對于治療病人，可以給予病人(如上所述)條件永生化的人PNS始祖細(xì)胞和/或調(diào)節(jié)劑從而預(yù)防或治療疾病。使用PNS始祖細(xì)胞和/或調(diào)節(jié)劑可以預(yù)防和/或治療的疾病包括，但不限于，慢性疼痛和特征在于神經(jīng)變性的病理狀況，諸如神經(jīng)病(如糖尿病性神經(jīng)病和化療引起的神經(jīng)病)。細(xì)胞可以通過例如注射移植。調(diào)節(jié)劑可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的多種途徑給予。這些試劑可以以它們的活性形式給予，如前體藥物(即在病人體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性形式的化合物)或者編碼調(diào)節(jié)劑或前體藥物的核酸序列。用于這一方面的本發(fā)明的PNS始祖細(xì)胞可以，但不必須，進一步轉(zhuǎn)染使得它們在病人體內(nèi)表達(dá)一種或多種額外的蛋白質(zhì)(諸如調(diào)節(jié)劑)。
對于病人的給藥，通常將一種或多種PNS始祖細(xì)胞(和/或調(diào)節(jié)劑)制成藥用組合物。藥用組合物可以是無菌水溶液或非水溶液、重懸液或乳劑，還含有生理學(xué)上可接受的載體(即不干擾活性成分活性的無毒物質(zhì))。本發(fā)明的藥用組合物可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道的任何合適的載體。載體的選擇將部分取決于給予的物質(zhì)(即細(xì)胞或化合物)的本性。有代表性的載體包括生理鹽水溶液、明膠、水、醇類、天然或合成油、糖溶液、二元醇類、可注射的有機酯諸如油酸乙酯或者這些物質(zhì)的組合。任選的，藥用組合物可以額外含有防腐劑和/或其它添加劑諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和/或惰性氣體和/或其它活性成分。
給藥途徑和頻率，以及劑量，將隨病人和所給藥物的本性而變化。通常，藥用組合物可以靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或口腔給藥。劑量優(yōu)選每天給藥。合適的劑量是足夠改善患有PNS疾病病人癥狀或抑制這種疾病發(fā)作的用量。這種改善可以根據(jù)疾病相關(guān)臨床癥狀的改善和/或延遲來檢測。通常，一劑調(diào)節(jié)劑的用量，或由一劑DNA原位產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑的量，其范圍為大約1～200mg/kg宿主。合適的劑量大小將隨病人的體型變化，但對于10-60kg動物的典型范圍為大約0.1～5ml。
提供下列實施例作為說明而非限制。
實施例實施例1用于PNS細(xì)胞系永生化的逆轉(zhuǎn)錄病毒的最適條件此實施例說明了人PNS始祖細(xì)胞進行高效逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的最適條件。
使用磷酸鈣系統(tǒng)(Promega ProFection試劑盒，Promega公司，Madison,WI)，同時用pMD.G(Naldini等人，科學(xué)(Science)272:263-267,1996；Naldini等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展93:11382-11388,1996)(VSV-G表達(dá))、pBS.CMV.gag.pol(在BluescriptKS+主鏈中，用CMV立即早期啟動子表達(dá)來自Moloney白血病病毒的gag/pol，隨后是牛的polyA序列)和pLINX v-myc(四環(huán)素調(diào)控的v-myc；參閱Hoshimaru等人，美國國家學(xué)術(shù)科學(xué)進展93:1518-1523，1996)同時瞬時共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)在添加了青霉素-鏈霉素(100單位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸鏈霉素)的DMEM(10％胎牛血清)中的HEK293細(xì)胞(ATCC編號CRL1573)。大約16小時后，收集培養(yǎng)物的上清液，并用0.45μm的濾器過濾。然后將濾出液離心(17,500rpm,90分鐘，4℃)，并重懸成原體積的～1/100。將病毒原液等分試樣凍存于-80℃。確認(rèn)病毒原液中不存在活的HEK細(xì)胞，以及輔助病毒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，重懸于特定培養(yǎng)基中并以凍存方式保存的假型病毒原液可以重復(fù)濃縮達(dá)到～105/ml的滴度。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒對人DRG細(xì)胞的感染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒。經(jīng)VSV-G假型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人胎兒DRG細(xì)胞培養(yǎng)物成功的產(chǎn)生了(抗G418的)感染細(xì)胞，然而用兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人DRG細(xì)胞對照培養(yǎng)物卻沒有成功。實施例2人PNS細(xì)胞系的發(fā)展此實施例說明了人DRG神經(jīng)前體的條件永生化。
用VSV-G假型LINX v-myc(四環(huán)素可調(diào)控的v-myc癌基因)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人胎兒DRG培養(yǎng)物。由有限稀釋分離得到一些推定克隆。具體地說，用添加了3.6mg/ml分散酶的1mg/ml膠原酶分離DRG(20-40分鐘，37℃，每10分鐘機械研磨一次)。在一種情況中，在最后一次研磨過程中加入DNA酶(0.1mg/ml)。在添加了青霉素-鏈霉素(50單位/ml青霉素G和50μg/ml硫酸鏈霉素)的L-15C(組分參閱下文)、FGF-2(40ng/ml)中，將分離細(xì)胞以1.1-2.5×105個細(xì)胞/60mm培養(yǎng)皿的密度鋪到纖連蛋白包被的組織培養(yǎng)塑料上。將培養(yǎng)物在4μg/ml polybrene中，用50-100μL VSV-G假型LINX v-myc逆轉(zhuǎn)錄病毒感染19小時。用4ml含青霉素-鏈霉素的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，從而除去逆轉(zhuǎn)錄病毒。G418(25-100μg/ml)選擇至少進行兩周。然后開始經(jīng)有限稀釋法進行克隆。在克隆的起始階段，向培養(yǎng)基中加入10％經(jīng)過濾的來自親代永生化的對照培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基。每2-3天換用新鮮的添加了FGF-2(0.5-40ng/ml)的L-15C。L-15C含有Leibovitz氏L-15培養(yǎng)基和N2補充液，10％雞胚提取物、牛血清白蛋白(1mg/ml)、地塞米松(39pg/ml)、α-d-1-生育酚(5μg/ml)、β-羥基丁酸鹽(63μg/ml)、氯化鈷(25ng/ml)、生物素(1μg/ml)、油酸(10ng/ml)、甘油(3.6mg/ml)、α-促黑激素(100ng/ml)、前列腺素E1(10ng/ml)、三碘甲腺原氨酸(67.5ng/ml)和穩(wěn)定的維生素混合物，含天冬氨酸(14μg/ml)、L-谷氨酸(14μg/ml)、L-脯氨酸(14μg/ml)、L-胱氨酸(14μg/ml)、對氨基苯甲酸(5μg/ml)、β-丙氨酸(5μg/ml)、維生素B12(0.2μg/ml)、i-肌醇(9μg/ml)、氯化膽堿(9μg/ml)、富馬酸(23μg/ml)、輔酶A(37ng/ml)、d-生物素(2ng/ml)和DL-6,8-thiotic acid(0.5μg/ml)。用于增殖細(xì)胞擴充的底層是纖連蛋白(16-100μg/ml)包被的組織培養(yǎng)塑料。必要時，通常在培養(yǎng)物50％以上鋪滿時使用胰蛋白酶對親代培養(yǎng)物和克隆進行傳代。

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的人DRG始祖細(xì)胞培養(yǎng)物的鑒定。7和9周孕齡的DRG細(xì)胞(分別為HDRGⅧ和HDRGⅨ)的永生化培養(yǎng)物含有神經(jīng)元前體。在增殖生長條件中(圖1)，抗G418細(xì)胞的形態(tài)類似大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的形態(tài)。正如期望的，在增殖生長條件中(圖2)，親代細(xì)胞培養(yǎng)物都表達(dá)v-myc癌蛋白。此外，在增殖條件下，兩種培養(yǎng)物中均有一些細(xì)胞表達(dá)βⅢ微管蛋白，提示可能存在永生化的神經(jīng)前體細(xì)胞(圖3)。
來自HDRGⅧ和HDRGⅨ的親代細(xì)胞分化實驗表明永生化細(xì)胞分化后得到神經(jīng)元。起始分化條件是根據(jù)由永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物得到的數(shù)據(jù)設(shè)定的。在四環(huán)素(T；1μg/ml)、人血清(HS；2.5％)、視黃酸(RA；0.5μM)、GDNF(G；25ng/ml)、CNTF(C；25ng/ml)和NGF(N；25ng/ml)，或T、HS、毛喉素(Fsk,10μM)以及G、C和N中，使親代人DRG培養(yǎng)物分化1-1.5周。在兩種處理條件中，在HDRGⅧ和HDRGⅨ中都可以觀察到明亮的有突起細(xì)胞(圖4)。如圖4所示，這些細(xì)胞對βⅢ微管蛋白、NF160和物質(zhì)P(SP)染色呈陽性。在來自HDRGⅨ、具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞中觀察到低水平的CGRP染色。NF160陽性細(xì)胞的計數(shù)表明，HDRGⅨ用T、HS、RA和G、C加N分化后，6.8±1.9％的細(xì)胞是神經(jīng)元，而在增殖條件中的細(xì)胞的結(jié)果為0.7±0.4％。這些數(shù)據(jù)表明衍生自DRG的條件永生化的神經(jīng)元前體細(xì)胞可以分化成人外周神經(jīng)元。
無性細(xì)胞系的分離和擴充。由有限稀釋法進行HDRGⅧ和HDRGⅨ的克隆。由HDRGⅧ(7周孕齡)和HDRGⅨ(9周孕齡)分別擴充到了26和6個推定克隆。
基因組雜交實驗。為了證明細(xì)胞系是由獨立整合事件產(chǎn)生的并且是無性系的，進行了基因組雜交。由推定克隆制備基因組DNA，并用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ或HindⅢ消化。在瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并用32P-v-myc探針檢測。對于除一個之外的所有推定克隆，正如期望的，HindⅢ切口位于原病毒的LTR附近，產(chǎn)生4.8kb單位長度DNA片段。來自推定克隆DNA的BamHⅠ和EcoRⅠ限制性消化分析表明最少有10個無性系和獨特的人PNS細(xì)胞系，包括HDRGⅧ-C10和HDRGⅧ-C12(圖5)。
形態(tài)學(xué)。衍生自HDRGⅧ和HDRGⅨ的克隆在形態(tài)上有一些不同。然而，通常與大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞相似(圖6)。
增殖速率。所有推定克隆在增殖生長條件下迅速分裂。使用添加了FGF-2(0.5-40ng/ml)的L-15C生長培養(yǎng)基，克隆HDRGⅧ-C10可以在增殖生長條件下迅速擴增，細(xì)胞生長到高密度并可以低密度再平鋪。用于增殖HDRGⅧ-C10細(xì)胞的底層是纖連蛋白(16-100μg/ml)。在增殖生長條件中，一個鋪滿的T75培養(yǎng)瓶通?？梢允斋@大約107個細(xì)胞，并可再以5×105個細(xì)胞/T75培養(yǎng)瓶的密度平鋪(即以1∶20的比例分瓶)。已經(jīng)計算得到克隆HDRGⅧ-C10的倍增時間的上限是1.2天。因此，無性系的人永生化的PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10在增殖生長條件下快速增殖。
v-myc的可調(diào)控表達(dá)。v-myc的免疫細(xì)胞化學(xué)確認(rèn)了克隆HDRGⅧ-C10中癌基因的存在，還證明向生長培養(yǎng)基中加入四環(huán)素可以有效的下調(diào)癌蛋白(圖7)。在克隆HDRGⅧ-C10中，75±1.3％的細(xì)胞在增殖生長條件中表達(dá)v-myc癌蛋白，然而四環(huán)素處理6天后，v-myc陽性細(xì)胞所占的百分率降到了1.1±0.8％。這些數(shù)據(jù)證明無性系的人永生化的PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10在增殖生長條件下表達(dá)癌基因v-myc，而在用四環(huán)素處理后，癌基因的表達(dá)可降到增殖水平的1.5％。
神經(jīng)元分化。在含有四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)和NGF(25ng/ml)，添加視黃酸(0.5μM)或毛喉素(10μM)的培養(yǎng)基中，在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白底層上，克隆HDRGⅧ-C10分化10天后形成神經(jīng)元。分化后，出現(xiàn)了明亮相細(xì)胞，具有細(xì)長束狀突起。具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞也具有βⅢ微管蛋白、NF160和物質(zhì)P的免疫反應(yīng)性，從而確認(rèn)了它們的神經(jīng)元表型(圖8)。在兩種分化條件中，事實上所有具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞都顯示表達(dá)NF160免疫反應(yīng)性，說明神經(jīng)元在這10天分化期后成熟了。圖9顯示了在兩種分化條件中的免疫染色細(xì)胞的計數(shù)。生長在含四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)和NGF(25ng/ml)加上毛喉素(10μM)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞有15±2.2％觀察到NF160染色，相比之下，生長在四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)和NGF(25ng/ml)加上視黃酸(0.5μM)中的細(xì)胞為8.1±0.8％。
這些結(jié)果說明條件永生化的人胚DRG細(xì)胞(HDRGⅧ和HDRGⅨ)的親代(非無性系的)培養(yǎng)物在分化1.5周后形成神經(jīng)元，而且這些神經(jīng)元表達(dá)βⅢ微管蛋白(早期神經(jīng)元標(biāo)記)、NF160(成熟神經(jīng)元標(biāo)記)、物質(zhì)P(在傷害感覺神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì))和CGRP(在傷害感覺神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì))。從感染了四環(huán)素調(diào)控的v-myc癌基因的人胚DRG細(xì)胞中已經(jīng)分離得到至少10種獨特的無性細(xì)胞系。在增殖生長條件中，無性系的永生化的人DRG細(xì)胞系具有與大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞相似的形態(tài)，并且在大約1-1.5天的時間內(nèi)倍增。
HDRGⅧ-C10是具有下列特性的人無性系的永生化的PNS細(xì)胞系◆v-myc癌基因的整合位點單一/唯一◆在增殖生長條件中的倍增時間為～1天◆在增殖生長條件中75％的細(xì)胞具有v-myc◆分化后1％的細(xì)胞具有v-myc◆分化后具有神經(jīng)元形態(tài)◆分化后產(chǎn)生βⅢ微管蛋白(早期神經(jīng)元標(biāo)記)◆分化后產(chǎn)生NF160(成熟神經(jīng)元標(biāo)記)◆分化后產(chǎn)生物質(zhì)P(傷害感覺標(biāo)記)實施例3大鼠PNS細(xì)胞系的發(fā)展此實施例說明了大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞和DRG神經(jīng)前體細(xì)胞的條件永生化。A．神經(jīng)嵴干細(xì)胞的永生化用可四環(huán)素調(diào)控的v-myc癌基因成功的感染了神經(jīng)嵴干細(xì)胞的培養(yǎng)物。為了能夠用永生化癌基因成功的感染神經(jīng)嵴干細(xì)胞的培養(yǎng)物，有必要改變已發(fā)表的培養(yǎng)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的方法(Stemple和Anderson，細(xì)胞(Cell)71:973-985,1992)。特別的，為了成功的感染神經(jīng)嵴干細(xì)胞，有必要將FGF-2的濃度從4ng/ml提高到40ng/ml，并從已發(fā)表的培養(yǎng)基配方中除去視黃酸、EGF和NGF。解剖胚齡10.5天的大鼠神經(jīng)管，用膠原酶部分解離，然后在添加了FGF-2的L-15C中平鋪在纖連蛋白底層上。將培養(yǎng)物用(來自PA317生產(chǎn)者細(xì)胞的)兼嗜性的LINX v-myc逆轉(zhuǎn)錄病毒感染大約24小時，并以與用于建立人PNS細(xì)胞系相似的方式進行G418選擇。將細(xì)胞以很低密度接種于100mm培養(yǎng)皿中后，用克隆環(huán)分離推定克隆。
細(xì)胞具有核v-myc免疫反應(yīng)性(圖10)，確認(rèn)了逆轉(zhuǎn)錄病毒感染已經(jīng)成功。在增殖條件中的一些細(xì)胞對βⅢ微管蛋白(一種未成熟神經(jīng)元標(biāo)記)染色呈陽性，說明神經(jīng)始祖細(xì)胞已經(jīng)永生化了。
為了使細(xì)胞分化，我們向培養(yǎng)基中加入了四環(huán)素來抑制v-myc的表達(dá)(圖11)。四環(huán)素處理2天后，具有βⅢ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞數(shù)目由增殖條件中的1.9％上升到了11.9％。為了進一步促進分化，用四環(huán)素和生長因子EGF(100ng/ml)、FGF-2(4ng/ml)和NGF(20ng/ml)(EFN)或者LIF(100ng/ml)處理細(xì)胞5天；βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞所占的百分比進一步上升，分別達(dá)到18.6％和28.4％。這些數(shù)據(jù)說明生長因子可促進永生化的神經(jīng)嵴干細(xì)胞分化成神經(jīng)元。
這些結(jié)果說明已經(jīng)分離并擴增了一些永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的推定克隆。四環(huán)素和生長因子的處理顯著增加了具有βⅢ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞數(shù)目。這些數(shù)據(jù)說明衍生自神經(jīng)嵴的永生化細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元。B．大鼠DRG神經(jīng)前體的永生化解剖E12.5大鼠DRG，用膠原酶和分散酶解離，然后在添加了FGF-2(40ng/ml)的L-15C中平鋪到纖連蛋白底層上。將培養(yǎng)物用(來自PA317生產(chǎn)者細(xì)胞的)兼嗜性LINX v-myc逆轉(zhuǎn)錄病毒感染13.5小時，并以與用于建立人PNS細(xì)胞系相似的方式進行G418選擇。將細(xì)胞以很低的密度接種于100mm培養(yǎng)皿中后，用克隆環(huán)分離10個推定克隆。
在增殖狀態(tài)中，永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物表達(dá)p75、βⅢ微管蛋白和彈性蛋白免疫反應(yīng)性，但沒有NF160免疫反應(yīng)性。為了測定哪種營養(yǎng)因子可能對細(xì)胞分化有用，進行了RT-PCR來檢測生長因子受體在永生化DRG培養(yǎng)物中的存在。PCR引物和條件根據(jù)大鼠DRG組織確定。在永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物中，發(fā)現(xiàn)了trkA、trkB和trkC、p75、c-RET、GDNFRα、gp130、CNTFRα、LIF-R和EGFR的大小正確的產(chǎn)物。因此，測試這些生長因子受體的配基促進神經(jīng)元分化的能力。
測試了營養(yǎng)因子以及試劑諸如視黃酸、毛喉素、PMA和血清的許多組合對永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物分化成神經(jīng)元的影響(圖12-14)。發(fā)現(xiàn)大鼠血清(RS)和視黃酸(RA)在分化培養(yǎng)基中的存在對得到大量的神經(jīng)元是至關(guān)重要的。在用大鼠血清、視黃酸和GDNF、CNTF、NGF、NT-3加BDNF分化后，24％的永生化的大鼠DRG細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記βⅢ微管蛋白。而且，在大鼠尾部膠原底層上分化1.5周比在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白上生長時，神經(jīng)元成熟(NF160表達(dá))得到顯著增強(圖15)。在大鼠尾部膠原底層上，某些因子與大鼠血清和視黃酸的組合將βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞所占的百分率增加到超過33％(圖16)。例如，用白介素-1,β(IL-1β)或IL-11(10ng/ml)與NGF組合誘導(dǎo)分化后，分別有33％和34％的細(xì)胞呈βⅢ微管蛋白陽性(圖16)。當(dāng)不存在NGF時，βⅢ微管蛋白所占的百分率略微降低。在這些分化細(xì)胞的一部分中還觀察到強NF160標(biāo)記，而所有βⅢ微管蛋白陽性神經(jīng)元都具有物質(zhì)P免疫反應(yīng)性(圖17)。這些結(jié)果說明IL-11和IL-1β驅(qū)動大約三分之一的細(xì)胞分化成神經(jīng)元譜系，而加入NGF可以輕微升高這個比例。NGF可能通過促進神經(jīng)元分化或神經(jīng)元存活發(fā)揮作用。
用NGF加上白血病抑制因子(LIF)或CNTF誘導(dǎo)分化還導(dǎo)致βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞所占的百分率達(dá)到顯著水平，雖然有點低(圖16)。有意思的是，向含有NGF加上LIF或CNTF的分化培養(yǎng)基中加入NT-3，導(dǎo)致神經(jīng)元成熟顯著增加(圖16和18)。當(dāng)不存在NT-3時，少于25％的βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)NF160。相反的，當(dāng)存在NT-3時，65％或更多的βⅢ微管蛋白陽性細(xì)胞表達(dá)NF160。這些結(jié)果說明NT-3可促進神經(jīng)元前體的成熟。
這些結(jié)果說明永生化的DRG前體中存在trkA、trkB、trkC、p75、c-RET、GDNFRα、CNTFRα、LIF-R和gp130。已經(jīng)測試了包括神經(jīng)營養(yǎng)素和細(xì)胞因子，額外試劑諸如血清、視黃酸、毛喉素和PMA的分化條件，而且鑒定出了使βⅢ微管蛋白陽性神經(jīng)元的數(shù)目顯著增加到～34％的條件，而單獨使用四環(huán)素為～2.5％。對分化特別有利的條件包括四環(huán)素、大鼠血清(2.5％)、視黃酸(0.5μM)和NGF，添加IL-11或IL-1β，并與大鼠尾部膠原底層組合。在這些條件中三分之一的細(xì)胞呈βⅢ微管蛋白陽性。加入NT-3顯著升高表達(dá)NF160(一種成熟神經(jīng)元標(biāo)記)的細(xì)胞所占的百分率，說明NT-3可促進神經(jīng)元成熟。實施例4條件永生化的DRG細(xì)胞的電生理學(xué)鑒定此實施例說明了條件永生化的大鼠和人DRG細(xì)胞分化后的電生理學(xué)特性。
使條件永生化的人和大鼠DRG細(xì)胞分別在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白和大鼠尾部膠原包被的培養(yǎng)皿上生長，并分化1-4周。選擇具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞用于全細(xì)胞膜片鉗記錄。
為了記錄動作電位或為了分離特殊類型的電壓和配基門控電流，聯(lián)合使用3種內(nèi)部溶液(表2)與2種外部溶液。浴液是含有(單位mM)2CaCl2、150NaCl、4KCl、2MgCl2、10葡萄糖、10HEPES(用NaOH調(diào)至pH7.4)和1-3單位/ml腺苷三磷酸雙磷酸酶的2Ca臺羅德氏液(Tyrode’s solution)。

在正在增殖的永生化大鼠DRG培養(yǎng)物中，正如期望的，沒有觀察到電壓門控鈉電流或ATP激活的電流。
動作電位。分化后，具有神經(jīng)元形態(tài)的條件永生化的人(圖19)和大鼠(圖20)DRG細(xì)胞(17/17個細(xì)胞)應(yīng)答電流刺激而激發(fā)動作電位。用KCl作為內(nèi)部溶液，由-70到+10mV的去極化電壓幅度(變化)激發(fā)了快速內(nèi)向電流，隨之為持續(xù)的外向電流，可能分別由鈉和鉀引起。在這些細(xì)胞中，0.5-1μM的TTX能夠阻斷動作電位以及內(nèi)向電流。然而，其激發(fā)動作電位的能力進一步確認(rèn)了分化細(xì)胞的神經(jīng)元表型，與它們的神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)元特異標(biāo)記的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果一致(見下)。
鈉電流。永生化的大鼠DRG細(xì)胞在四環(huán)素、大鼠血清(2.5％)、視黃酸(0.5μM)和營養(yǎng)因子(GDNF、CNTF、NGF、NT-3和/或BDNF)中分化～1周后，具有神經(jīng)元形態(tài)的大部分細(xì)胞(62％)展示TTX敏感的電壓門控鈉電流。
鉀電流。已分化的永生化的大鼠DRG細(xì)胞中的鉀電流是持續(xù)的，并在-25mV開始被激活(圖21)。這些特性與延遲矯正鉀電流一致。
鈣電流。在8個已分化的永生化大鼠DRG細(xì)胞的5個中觀察到鈣通道電流(882±315pA；由-80到-10mV去極化)，其中5-10mM Ba2+作為電荷載體。由Ba2+進行的穿過通道的電流比Ca2+進行的電流明顯更大(圖22)。這種電流的藥理學(xué)說明它是由N、L和P型鈣通道介導(dǎo)的，分別對3μMω-CTX-GⅥA、4μM印楝素酸(nimodipine)和100nMω-Aga-ⅣA的阻斷敏感。
ATP電流。在永生化的人PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10中，在四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)和NGF(25ng/ml)加上毛喉素(10μM)中分化1-2周，具有神經(jīng)元形態(tài)的所有細(xì)胞展示ATP應(yīng)答。10μMαβ-meATP激發(fā)快速激活和強脫敏電流(圖24)。
用四環(huán)素、大鼠血清、視黃酸、NGF和在某些情況下為GDNF加CNTF分化3-4周的永生化大鼠DRG細(xì)胞中，具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞中存在非脫敏的ATP應(yīng)答。100μM ATP(圖25)或αβ-meATP使用5秒鐘激發(fā)僅～15％脫敏性的電流。ATP激活的電流的表達(dá)依賴于分化的時長。分化1周后，沒有細(xì)胞(n=14)顯示ATP激活的電流，而分化3周后，～30％的細(xì)胞(5/17個細(xì)胞)具有ATP激活的電流。αβ-meATP應(yīng)答仍然少有，然而可在1/20的細(xì)胞中觀察到。
辣椒素電流。來自永生化的人PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10、具有神經(jīng)元形態(tài)的分化細(xì)胞對1μM辣椒素有應(yīng)答，它被20μMcapsazepine阻斷(圖26)。分化前，永生化人PNS HDRGⅧ-C10細(xì)胞中沒有展示辣椒素應(yīng)答的。相反的，已分化的永生化的大鼠DRG細(xì)胞不展示辣椒素應(yīng)答(n=6)。
質(zhì)子門控電流。來自永生化的人PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10、具有神經(jīng)元形態(tài)的分化細(xì)胞應(yīng)答從pH7.4到低pH(如pH4.5-5.7)的變化幅度展示內(nèi)向電流，其中含有瞬間和持續(xù)成分(圖27)。在永生化的人PNS HDRGⅧ-C10細(xì)胞分化前，也存在瞬間和持續(xù)的質(zhì)子門控電流。已分化的永生化的大鼠DRG細(xì)胞也展示質(zhì)子門控電流(圖28)。
這些結(jié)果說明，分化后具有神經(jīng)元形態(tài)的永生化人DRG細(xì)胞表達(dá)動作電位。此外，HDRGⅧ-C10是展示下列特性的人無性系的永生化的PNS細(xì)胞系◆分化后電壓門控鈉電流◆分化后αβ-meATP電流◆分化后辣椒素激活的電流◆分化后質(zhì)子激活的電流分化后，具有神經(jīng)元形態(tài)的永生化的大鼠DRG細(xì)胞表達(dá)下列特性◆動作電位◆鈉電流◆鉀電流◆鈣電流(L、N和P型)◆ATP電流◆質(zhì)子激活的電流這些功能性特性的存在進一步確認(rèn)了已分化的永生化DRG細(xì)胞的神經(jīng)元表型。而且，功能性辣椒素受體的存在確認(rèn)了HDRGⅧ-C10的傷害感覺神經(jīng)元表型。實施例5人PNS細(xì)胞系的進一步發(fā)展此實施例說明了分化成神經(jīng)元的其它人無性系的條件永生化PNS細(xì)胞系的發(fā)展。A．HDRGⅧ-C10的亞克隆神經(jīng)元分化的最適條件。為了增加分化后神經(jīng)元的數(shù)目，我們分離了6株HDRGⅧ-C10或亞克隆。6個亞克隆展示的倍增時間與親代細(xì)胞系HDRGⅧ-C10大致相同。此外，用四環(huán)素測試了6個亞克隆的v-myc調(diào)控；在所有情況中，正如期望的，癌蛋白被用四環(huán)素誘導(dǎo)的分化抑制。由于在增殖條件中βⅢ微管蛋白標(biāo)記的存在通常是神經(jīng)元分化的預(yù)示，在增殖生長條件中對6個亞克隆進行了βⅢ微管蛋白的免疫標(biāo)記；展示βⅢ微管蛋白表達(dá)的細(xì)胞所占的平均百分率的范圍為，從亞克隆HDRGⅧ-C10.3中的0％(如同HDRGⅧ-C10)到HDRGⅧ-C10.6的15.5％(圖29)。與在增殖生長條件中HDRGⅧ-C10.6的βⅢ微管蛋白高表達(dá)一致，根據(jù)形態(tài)學(xué)顯示，在T、HS、Fsk、G、C和N中分化后，HDRGⅧ-C10.6具有最多的神經(jīng)元(＞50％)(圖30)。
感覺神經(jīng)元分化的鑒定。為了測試感覺神經(jīng)元分化，我們測試了不同底層和培養(yǎng)條件對Islet-1、外周蛋白和辣椒素敏感性表達(dá)的影響。Islet-1是一種同源異型框的lim-domain轉(zhuǎn)錄因子，在DRG細(xì)胞分化早期表達(dá)。在敲除了Islet-1的小鼠PNS中，不能形成DRG(Pfaff等人，細(xì)胞(Cell)84:309-320,1996)，說明Islet-1在感覺神經(jīng)元的發(fā)育中具有至關(guān)重要的功能性作用。由于感覺神經(jīng)元的體內(nèi)發(fā)育需要Islet-1，我們測試了Islet-1在人PNS細(xì)胞系中的存在情況。在T、HS、Fsk、G、C和N，有或無NT-3(23ng/ml)存在時，將HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞培養(yǎng)5天，并測試Islet-1和外周蛋白的表達(dá)和辣椒素敏感性。在用T、HS、Fsk、G、C和N，有或無NT-3分化后的所有HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中，Islet-1在大約50％細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)(圖31)。分化后，具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞中，大部分表達(dá)Islet-1免疫反應(yīng)性。在T、HS、Fsk、G、C加上N，以及T、HS、Fsk、G、C、N和加上NT-3中分化后，分別有31±9％和43±8％的細(xì)胞表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)記外周蛋白(圖31)。分化后，具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞中，大部分表達(dá)外周蛋白免疫反應(yīng)性，而NT-3顯示略微升高由HDRGⅧ-C10.6分化的神經(jīng)元所占的百分率。在T、HS、Fsk、G、C、N和NT-3中，在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白底層上分化7天后，使用鈷組織學(xué)(參閱Wood等人，神經(jīng)科學(xué)雜志(J.Neurosci.)8:3208-3220,1988)來檢測HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中辣椒素敏感性(圖32)。加入10μM辣椒素后，30.8±2.9％具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞展示對鈷的攝取。
穩(wěn)定性。無性系的人PNS細(xì)胞系HDRGⅧ-C10.6分化后，在早期代數(shù)(第5代)表達(dá)與非常晚的代數(shù)(第20代)相當(dāng)水平的三種細(xì)胞類型特異標(biāo)記βⅢ微管蛋白、NF160和GFAP。估算第5和20代之間有65次倍增或世代。在四環(huán)素(1μg/ml)、人血清(2.5％)、毛喉素(10μM)、GDNF(25ng/ml)、CNTF(25ng/ml)和NGF(50ng/ml)中分化4.5-5天后，第5代的免疫染色細(xì)胞所占的百分率，βⅢ微管蛋白陽性為56±2％、NF160陽性為42±7％,GFGAP陽性為0％。相似的，第20代的免疫染色細(xì)胞所占的百分率，βⅢ微管蛋白陽性為61±8％、NF160陽性為42±6％,GFGAP陽性為0％。
此外，通過HDRGⅧ-C10.6的基因組雜交實驗，正如期望的，HindⅢ限制性消化后，與v-myc探針雜交的DNA片段大小是4.7kb。而且，在HDRGⅧ-C10.6的第3代和第17代培養(yǎng)物中有相同大小的單一條帶。這些結(jié)果證明v-myc在克隆HDRGⅧ-C10.6中的整合位點在大約65個細(xì)胞世代中是穩(wěn)定的。B．其它HDRGⅧ克隆的鑒定進一步鑒定克隆C1、C2、C5、C7、C11、C18、C22、C23和C26。在增殖條件中，克隆C1、C2、C5、C11、C18、C22、C23和C26對p75和v-myc呈陽性，而對GFAP呈陰性。相反地，增殖克隆C7不含任何對p75呈陽性的細(xì)胞。在增殖條件中，在克隆C1(微弱染色)、C2和C11中檢測到具有βⅢ微管蛋白免疫反應(yīng)性的細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)學(xué)和βⅢ微管蛋白、NF160和外周蛋白的免疫反應(yīng)性，分化后，克隆C2、C11和C22形成神經(jīng)元。神經(jīng)元通常聚集成團(3個或更多細(xì)胞)，它們的突起形成長束。具有神經(jīng)元形態(tài)的所有細(xì)胞都表達(dá)βⅢ微管蛋白和NF160，而且大約82-85％的神經(jīng)元還表達(dá)物質(zhì)P。C．HDRGⅧ-C11神經(jīng)元分化的最適條件NT-3和IL-11的影響。為了測定NT-3能否增加由永生化人DRG細(xì)胞分化來的神經(jīng)元的數(shù)目，將克隆C11在NT-3存在或不存在時分化，然后計數(shù)βⅢ微管蛋白陽性神經(jīng)元所占的百分率。當(dāng)向常規(guī)分化培養(yǎng)基中加入NT-3時，4.0±2.2％的C11細(xì)胞分化成神經(jīng)元，比不加NT-3時的1.4±0.6％略微上升。因此，NT-3似乎可略微增加由HDRGⅧ-C11分化成的神經(jīng)元所占的百分率。
IL-11和NGF的組合導(dǎo)致永生化的大鼠DRG培養(yǎng)物分化成神經(jīng)元所占的百分率最高(＞30％)。為了測定這些因子能否也增加HDRGⅧ-C11培養(yǎng)物中神經(jīng)元所占的百分率，用T、HS、Fsk、NGF和IL-11誘導(dǎo)HDRGⅧ-C11細(xì)胞的分化。這導(dǎo)致1.5±0.9％的βⅢ微管蛋白陽性神經(jīng)元，與用T、HS、Fsk、G、C和N觀察到的百分率近似。因而，與它對永生化的大鼠DRG細(xì)胞的影響不同，IL-11不增加永生化的人DRG細(xì)胞系HDRGⅧ-C11的神經(jīng)元分化。
神經(jīng)元分化的最適條件底層的影響。如上所述，當(dāng)在大鼠尾部膠原底層上生長時，永生化大鼠DRG細(xì)胞分化成神經(jīng)元所占的百分率比在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白上較高。然而，HDRGⅧ-C11在這兩種底層上分化的比較揭示了在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白上生長導(dǎo)致神經(jīng)元所占的百分率(4.2±1.8％)比在大鼠尾部膠原上生長(2.8±1.2％)時略微高一些。因此，與它對永生化大鼠DRG細(xì)胞的影響不同，在大鼠尾部膠原底層上分化不增加永生化的人DRG細(xì)胞系HDRGⅧ-C11的神經(jīng)元分化。
感覺神經(jīng)元分化的鑒定。為了研究傷害感覺神經(jīng)元分化，我們測試了Islet-1的表達(dá)和辣椒素敏感性。在T、HS、Fsk、G、C、N和NT-3中分化的HDRGⅧ-C11培養(yǎng)物中，一些但不是所有神經(jīng)元表達(dá)Islet-1。
HDRGⅧ-C11細(xì)胞在T、HS、Fsk、G、C、N和NT-3中分化后，進行鈷組織學(xué)來測定神經(jīng)元是否對辣椒素有應(yīng)答。大約30％的具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞對辣椒素(10μM或100μM)敏感，正如鈷沉淀的存在所證實。當(dāng)不存在辣椒素時未觀察到標(biāo)記的細(xì)胞，而辣椒素(10μM)誘導(dǎo)的標(biāo)記在加入capsazepine(100μM)后顯著降低。這些結(jié)果說明已分化的HDRGⅧ-C11培養(yǎng)物中大約三分之一的神經(jīng)元對辣椒素有應(yīng)答，與傷害感受器表型一致。
這些結(jié)果說明細(xì)胞系HDRGⅧ-C10.6能夠產(chǎn)生＞50％的神經(jīng)元。HDRGⅧ-C10.6表達(dá)◆Islet-1(感覺神經(jīng)元發(fā)育需要的轉(zhuǎn)錄因子)◆外周蛋白(成熟神經(jīng)元標(biāo)記)◆辣椒素受體(傷害感覺神經(jīng)元標(biāo)記)
已經(jīng)鑒定了HDRGⅧ-C11是新的人無性系的永生化PNS細(xì)胞系，能夠分化成神經(jīng)元。而且，功能性辣椒素受體的存在說明HDRGⅧ-C11可以分化成傷害感覺神經(jīng)元。對于這些細(xì)胞◆在增殖生長條件中88％的細(xì)胞表達(dá)v-myc◆分化后1.8％的細(xì)胞表達(dá)v-myc◆NT-3可以輕微促進神經(jīng)元分化◆IL-11不促進神經(jīng)元分化◆多聚鳥氨酸/層粘連蛋白(對比大鼠尾部膠原)可以輕微促進神經(jīng)元分化◆存在Islet-1(感覺神經(jīng)元發(fā)育需要的轉(zhuǎn)錄因子)◆存在辣椒素受體(傷害感覺神經(jīng)元標(biāo)記)結(jié)果還說明克隆HDRGⅧ-C5、C7、C22和C26在增殖生長條件中表達(dá)v-myc癌蛋白，但是在四環(huán)素中生長后表達(dá)程度不明顯，說明這些克隆含有可調(diào)控的v-myc癌蛋白?？寺DRG-C22可以分化成神經(jīng)元。實施例6人PNS細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄因子mRNA的檢測此實施例說明了RT-PCR在檢測人PNS細(xì)胞系中感覺神經(jīng)元選擇性轉(zhuǎn)錄因子方面的使用。
轉(zhuǎn)錄因子，Brn3a和DRG11，最近已經(jīng)被指明是感覺神經(jīng)元的標(biāo)記。POU結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子Brn3a，已經(jīng)在遷移的感覺神經(jīng)元前體中(Fedtsoya和Turner,Mech.Devel.53.291-304,1995)以及在大多數(shù)有絲分裂后DRG神經(jīng)元中(Nankina等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)21:3175-31821993)檢測到，但是在自主神經(jīng)節(jié)中不表達(dá)(Fedtsoya和Turner,Mech.Devel.53:291-304,1995)。同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)DRG11，在遷移后的感覺神經(jīng)元中特異表達(dá)，但是在自主神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)中不表達(dá)(Saito等人，分子和細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)(Mol.Cell.Neurosci.)6:280-292,1995)。DRG的發(fā)育表達(dá)模式說明它是比Brn3a較晚的感覺神經(jīng)元標(biāo)記。根據(jù)這些報告，設(shè)計了針對人Brn3a和大鼠DRG11的PCR引物，在人DRG組織上驗證，然后用來測試克隆HDRGⅧ-C10.6。
Brn3a mRNA存在于增殖的和已分化的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中(圖33A)，與克隆HDRGⅧ-C10.6屬于感覺神經(jīng)元譜系是一致的。由于人DRG11序列還沒有報導(dǎo)，大鼠序列被用來設(shè)計與人序列有交叉反應(yīng)的引物。通過序列分析，確定了被這些引物擴增的人序列與大鼠序列是～80％同源的。在分化成神經(jīng)元的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中清楚的檢測到DRG11，而在增殖的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中只存在非常微弱的信號。有可能在增殖的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞中檢測到的微弱信號是由于基因組DNA的擴增，因為DRG11引物對不跨越一個內(nèi)含子，而且在來自增殖的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞的cDNA制備物中檢測到輕微的DNA污染。然而，這個結(jié)果與大鼠中DRG11的發(fā)育表達(dá)模式是一致的，而且強烈暗示克隆HDRG-C10.6屬于感覺神經(jīng)元譜系。
結(jié)果說明HDRGⅧ-C10.6在增殖生長條件中和分化成神經(jīng)元后都表達(dá)Brn3a，與關(guān)于Brn3a體內(nèi)發(fā)育表達(dá)的文獻(xiàn)中的報告是一致的。DRG11在HDRGⅧ-C10.6分化成神經(jīng)元后上調(diào)，暗示這些細(xì)胞已經(jīng)分化成感覺神經(jīng)元。感覺神經(jīng)元選擇性轉(zhuǎn)錄因子Brn3a和DRG11的表達(dá)強烈暗示克隆HDRGⅧ-C10.6是由感覺神經(jīng)元譜系衍生的。
堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子hASH-1是MASH-1的人achaete-scute同源物。MASH-1在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(除自主神經(jīng)元前體)的發(fā)育早期短暫表達(dá)；MASH-1在感覺神經(jīng)元譜系細(xì)胞中不表達(dá)。因此，在人PNS細(xì)胞系中不存在hASH-1將為人PNS細(xì)胞系衍生自感覺神經(jīng)元譜系提供進一步證據(jù)。設(shè)計RT-PCR引物，并在人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32上驗證，然后測試增殖的和分化成神經(jīng)元的HDRG-C10.6。在增殖的或分化成神經(jīng)元的HDRG-C10.6中用PCR沒有檢測到明顯程度的hASH-1，這與HDRGⅧ-C10.6衍生自感覺神經(jīng)元譜系是一致的。實施例7條件永生化的人DRG細(xì)胞系的電生理學(xué)鑒定此實施例說明了永生化的人DRG細(xì)胞系HDRGⅧ-C10.6在分化之前和之后的電生理學(xué)特性。
使用了全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜片鉗記錄。在2Ca-臺羅德氏液(單位mM,2CaCl2、150NaCl、4KCl、2MgCl2、10葡萄糖、10HEPES，用NaOH調(diào)pH7.4)中用腺苷三磷酸雙磷酸酶(4單位/ml)形成封蓋。細(xì)胞用2Ca-臺羅德氏液灌注來記錄鈉電流，或用0.5Ca-臺羅德氏液灌注來記錄質(zhì)子、αβ-meATP和辣椒素激活的電流。內(nèi)部溶液含有(單位mM)108Cs-甲烷磺酸、4.5MgCl2、9HEPES、9EGTA、4ATP(Mg2+鹽)、14磷酸肌氨酸(Tris鹽)和0.3GTP(Tris鹽)(用CsOH調(diào)pH7.4)。為了激發(fā)鈉電流，將細(xì)胞由持有電位-80mV去極化到測試電位-10mV。為了引起質(zhì)子、αβ-meATP和辣椒素激活的電流，將細(xì)胞電位保持在-80mV。
這種電生理學(xué)鑒定說明增殖的HDRG-C10.6細(xì)胞不展示電壓門控電流或辣椒素激活的電流。它們具有微弱的αβ-meATP(100μM)應(yīng)答和微弱的質(zhì)子門控電流(pH5.1)(表3)。
在多聚鳥氨酸/層粘連蛋白上用四環(huán)素、人血清、毛喉素、GDNF、CNTF和NGF(THSFskGCN)誘導(dǎo)神經(jīng)元分化8-11天后，具有神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞表達(dá)對TTX敏感的電壓門控鈉電流(圖34，表3)、辣椒素(1μM)激活的電流(圖35，表3)、αβ-meATP(100μM)激活的電流(圖36，表3)和質(zhì)子門控電流(圖37，表3,pH5.1)。

結(jié)果說明HDRGⅧ-C10.6的分化是功能性電壓和配基門控電流的表達(dá)所必需的。具有神經(jīng)元形態(tài)的HDRGⅧ-C10.6細(xì)胞在分化后展示下列功能性電流◆TTX敏感的電壓門控鈉電流(與神經(jīng)元表型一致)◆辣椒素激活的電流(與傷害感覺神經(jīng)元表型一致)◆α,β-meATP激活的電流(與感覺神經(jīng)元表型一致)◆質(zhì)子門控電流(與感覺神經(jīng)元表型一致)由此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然為了舉例說明已經(jīng)在此描述了本發(fā)明的特定實施方案，但是可以在不偏離本發(fā)明的精神和范圍情況下作各種改變。
權(quán)利要求
1．產(chǎn)生條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞的方法，包括(a)將鋪在適宜增殖的第一種生長培養(yǎng)基中第一種表面上的大鼠神經(jīng)嵴細(xì)胞用編碼選擇標(biāo)記和可調(diào)控的生長促進基因的DNA轉(zhuǎn)染；和(b)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代到適宜附著和增殖的第二種生長培養(yǎng)基中第二種表面上；并由此產(chǎn)生條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞。
2．權(quán)利要求1的方法，其中第一種和第二種表面獨立選自含有多聚氨基酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原或組織培養(yǎng)塑料中一種或多種的底層。
3．權(quán)利要求1的方法，其中生長促進基因是一種癌基因。
4．權(quán)利要求3的方法，其中癌基因是v-myc。
5．能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的大鼠神經(jīng)嵴干細(xì)胞。
6．產(chǎn)生條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞的方法，包括(a)將鋪于適宜增殖的第一種生長培養(yǎng)基中第一種表面上的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞用編碼選擇標(biāo)記和可調(diào)控的生長促進基因的DNA轉(zhuǎn)染；和(b)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代到適宜附著和增殖的第二種生長培養(yǎng)基中第二種表面上；并由此產(chǎn)生條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。
7．權(quán)利要求6的方法，其中背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
8．權(quán)利要求6的方法，其中背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞是人細(xì)胞。
9．權(quán)利要求6的方法，其中第一種和第二種表面獨立選自含有多聚氨基酸、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原或組織培養(yǎng)塑料中一種或多種的底層。
10．權(quán)利要求6的方法，其中生長促進基因是一種癌基因。
11．權(quán)利要求10的方法，其中癌基因是v-myc。
12．能夠分化成神經(jīng)元的條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。
13．權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染的大鼠背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。
14．權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染的人背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞。
15．權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中細(xì)胞能夠分化成感覺神經(jīng)元。
16．權(quán)利要求12的細(xì)胞，其中細(xì)胞能夠分化成傷害感覺神經(jīng)元。
17．產(chǎn)生神經(jīng)元的方法，包括在抑制生長促進基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或6產(chǎn)生的細(xì)胞。
18．權(quán)利要求17的方法，其中細(xì)胞是條件永生化的大鼠或人背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞，并且細(xì)胞在有一種或多種分化劑的情況下在底層上培養(yǎng)。
19．根據(jù)權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的神經(jīng)元。
20．產(chǎn)生神經(jīng)元的方法，包括在抑制生長促進基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求5或12的細(xì)胞。
21．權(quán)利要求20的方法，其中細(xì)胞是條件永生化的大鼠或人背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞，并且細(xì)胞在有一種或多種分化劑情況下培養(yǎng)。
22．根據(jù)權(quán)利要求20產(chǎn)生的神經(jīng)元。
23．鑒定條件永生化的背根神經(jīng)節(jié)始祖細(xì)胞能否分化成神經(jīng)元的方法，包括鑒定在增殖生長條件下是否存在βⅢ-微管蛋白陽性細(xì)胞，并由此鑒定細(xì)胞能否分化成神經(jīng)元的步驟。
24．將PNS細(xì)胞移植到哺乳動物中的方法，包括給予哺乳動物根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
25．將PNS細(xì)胞移植到哺乳動物中的方法，包括給予哺乳動物權(quán)利要求5或12的細(xì)胞。
26．治療病人的方法，包括給予病人根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
27．治療病人的方法，包括給予病人權(quán)利要求5或12的細(xì)胞。
28．權(quán)利要求27的方法，其中病人患有慢性疼痛和/或特征在于神經(jīng)退化的病理狀況。
29．權(quán)利要求28的方法，其中所述病理狀況是神經(jīng)病。
30．篩選可調(diào)節(jié)由PNS細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的試劑的方法，包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑調(diào)節(jié)由所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的能力。
31．篩選可調(diào)節(jié)由PNS細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的試劑的方法，包括(a)將權(quán)利要求5或12的細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑調(diào)節(jié)由所述細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)活性的能力。
32．檢測樣品中是否存在一種蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將樣品與根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞接觸；和(b)隨后檢測細(xì)胞中的應(yīng)答，并由此檢測樣品中是否存在蛋白質(zhì)。
33．檢測樣品中是否存在蛋白質(zhì)的方法，包括(a)將樣品與權(quán)利要求5或12的細(xì)胞接觸；和(b)隨后檢測細(xì)胞中的應(yīng)答，并由此檢測樣品中是否存在蛋白質(zhì)。
34．鑒定人PNS基因或蛋白質(zhì)的方法，包括檢測根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在基因或蛋白質(zhì)。
35．鑒定人PNS基因或蛋白質(zhì)的方法，包括檢測權(quán)利要求5或12的細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在基因或蛋白質(zhì)。
36．篩選影響PNS細(xì)胞死亡的試劑的方法，包括(a)在候選試劑不存在時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的條件下，將根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法產(chǎn)生的細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑影響細(xì)胞死亡的能力，并由此鑒定影響PNS細(xì)胞死亡的試劑。
37．篩選影響PNS細(xì)胞死亡的試劑的方法，包括(a)在候選試劑不存在時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的條件下，將權(quán)利要求5或12的細(xì)胞與候選試劑接觸；和(b)隨后測量候選試劑影響細(xì)胞死亡的能力，并由此鑒定影響PNS細(xì)胞死亡的試劑。
38．篩選可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)的方法，包括(a)改變蛋白質(zhì)在根據(jù)權(quán)利要求1或6產(chǎn)生的細(xì)胞中的表達(dá)水平；和(b)隨后測量該改變對細(xì)胞死亡的影響，并由此鑒定可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。
39．篩選可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)的方法，包括(a)改變蛋白質(zhì)在權(quán)利要求5或12的細(xì)胞中的表達(dá)水平；和(b)隨后測量該改變對細(xì)胞死亡的影響，并由此鑒定可調(diào)控PNS細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。
40．根據(jù)權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞。
41．權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
42．根據(jù)權(quán)利要求6的方法產(chǎn)生的條件永生化的PNS始祖細(xì)胞。
43．權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中細(xì)胞是大鼠細(xì)胞。
44．權(quán)利要求42的細(xì)胞，其中細(xì)胞是人細(xì)胞。
45．權(quán)利要求40或42的細(xì)胞，其中細(xì)胞存在于無性細(xì)胞系中。
46．權(quán)利要求40或42的細(xì)胞，其中細(xì)胞能夠分化成神經(jīng)元。
全文摘要
提供了條件永生化的PNS始祖細(xì)胞系。這些細(xì)胞系可以是無性系的,它們可以用來產(chǎn)生神經(jīng)元。該細(xì)胞系和/或分化細(xì)胞可以用于預(yù)防和治療各種PNS相關(guān)疾病的治療用藥劑的開發(fā)。該細(xì)胞系和/或分化細(xì)胞還可以用于實驗和PNS細(xì)胞發(fā)育、死亡和異常的常規(guī)研究。
文檔編號A61P25/04GK1303425SQ99806762
公開日2001年7月11日 申請日期1999年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月14日
發(fā)明者D·W·Y·薩, H·K·雷蒙 申請人:信號藥物公司