金魚心臟細胞系及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金魚心臟細胞系及其應(yīng)用。該金魚心臟細胞系已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登記編號為CGMCC?No.9334。本發(fā)明所述的金魚心臟細胞系特性穩(wěn)定、成分均一，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。
【專利說明】金魚心臟細胞系及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種金魚心臟細胞系及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)于魚類細胞系的篩選建立的研究，國內(nèi)外取得了很大的研究進展。胖頭魚肌肉 細胞系、劍尾魚胚胎細胞系和巴拉圭鰺幼魚細胞系等多種包括海淡水魚類細胞系也陸續(xù)建 立起來。2013年，國外學(xué)者建立了條紋無須紕的尾鰭細胞系和團頭魴的鰭條細胞系。2007 年，國內(nèi)學(xué)者樊挺俊等建立了大菱鲆鰭細胞系；2003年薛淑群等建立了鯉魚尾鰭條細胞 系。目前尚無關(guān)于建立金魚心臟細胞系的相關(guān)報道。
[0003] 世界衛(wèi)生組織（0ΙΕ)推薦檢測水產(chǎn)動物病毒的"黃金標準"是通過細胞來分離病 毒。由此，國內(nèi)外的許多學(xué)者正在進行魚類細胞系的研究。魚類原代細胞系的建立技術(shù)目 前是一種較為成熟的技術(shù)，但是要獲得針對病毒敏感的細胞系仍存著很大的偶然性和困難 性，所以建立一株需要魚類細胞系有效的途徑是制備大批量的原代細胞，從而篩選出對病 毒敏感的細胞系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細胞系 (GH)，該細胞系是一些水產(chǎn)動物病毒的敏感細胞系，也是進一步研究未知病毒的良好材料。
[0005] 本發(fā)明還要保護所述金魚心臟細胞系的制備方法及該細胞系的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] 經(jīng)過篩選，本發(fā)明獲得了特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細胞系，該金魚心臟細 胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC No. 9334,保存地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，其分類命名為金魚心臟細胞系。
[0008] 進一步地，所述金魚心臟細胞系具有以下生物學(xué)特性：
[0009] (1)細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點；
[0010] (2)細胞具有較強的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種上述金魚心臟細胞系的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0012] (1)取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的心臟，放于濃 度為1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中；
[0013] ⑵用解剖刀切割成小塊（約1mm),胰酶消化液消化5min，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄 掉上清液，再用培養(yǎng)基進行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻；
[0014] (3)將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0015] (4)待細胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次；
[0016] (5)待細胞鋪滿板子，用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；
[0017] (6)傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細胞系命名為GH。
[0018] 進一步地，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特 級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0019] 進一步地，所述胰酶消化液的配制：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0. lg，氯化鈉 8. 0g，氯化鉀 0· 2g，EDTA 0· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0020] 進一步地，本發(fā)明所述的金魚心臟細胞系GH可以作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細 胞使用，用于水產(chǎn)動物病毒的分離。
[0021] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0022] 實驗中使用的是魚類細胞培養(yǎng)的最常用的培養(yǎng)基、且在簡單的條件進行原代細胞 篩選培養(yǎng)，保證最終獲得的細胞無需特殊試劑和條件就能增殖，為其提供了廣闊的應(yīng)用空 間。該金魚心臟細胞系是首次成功在體外培養(yǎng)。該細胞在培養(yǎng)7天，明顯出現(xiàn)延伸生長；15 天后鋪滿板子，進行消化后，具有較強的繁殖能力，呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)。細胞連續(xù)傳 代培養(yǎng)18個月已傳至50代，仍然保持上述形態(tài)特點、生長和增殖特性。因此，該細胞是一 種特性穩(wěn)定、成分均一的金魚心臟細胞系，是研究水產(chǎn)動物病毒的良好材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0024] 圖1相差顯微鏡下的金魚心臟細胞系的形態(tài)；
[0025] 圖2金魚心臟細胞系懸浮特性分析；
[0026] 圖3金魚心臟細胞系的最佳血清濃度的確定；
[0027] 圖4金魚心臟細胞系的最佳培養(yǎng)溫度的確定；
[0028] 圖5金魚心臟細胞系的倍增曲線分析；
[0029] 圖6金魚心臟細胞系的增殖病毒的初步應(yīng)用。

【具體實施方式】
[0030] 為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā) 明的保護范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0031] 實施例1金魚心臟細胞的分離和原代培養(yǎng)
[0032] 一、實驗材料和試劑
[0033] 實驗動物：10g_20g的健康的金魚。
[0034] 實驗器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科鑷子和紗布等。
[0035] 培養(yǎng)基和相關(guān)試劑：
[0036] 青霉素-鏈霉素雙抗溶液濃度為10000u/ml ;
[0037] 培養(yǎng)基：含有濃度為100u/ml青霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級胎牛血清（杭 州四季青生物工程材料有限公司）的M199培養(yǎng)基（gibco公司）；
[0038] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0. lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0. 2g，EDTA 〇.2g，胰酶 0.6g，水 1000ml ;
[0039] 醫(yī)用酒精；
[0040] 0· 01M 的 PBS 緩沖液（NaCl 80g，Na2HP04 · 12H20 29g，KH2P042g，KC1 2g，水 1000ml)。
[0041] 二、實驗方法
[0042] 經(jīng)過檢測的健康金魚，在實驗室內(nèi)暫養(yǎng)15天，經(jīng)過檢測無其他疾病，開始實驗。具 體方法：
[0043] (1)取一條金魚在醫(yī)用酒精中浸泡5min，無菌條件下，取金魚的心臟，放于濃度為 lOOOu/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液（蒸餾水配制）中，放置15min ;
[0044] (2)用解剖刀切割成小塊（約1mm),胰酶消化液消化5min。加入培養(yǎng)基，重懸。離 心lOOOrmp，20min。棄掉上清液，再次加入培養(yǎng)基，進行重懸，離心，棄掉上清液，最后加入培 養(yǎng)基，重懸混勻。
[0045] (3)將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0046] (4)待培養(yǎng)2天后觀察細胞貼壁情況，適當加入培養(yǎng)基（保證培養(yǎng)基的pH)。待細 胞鋪板到1/3的時候（約7天），更換新鮮的培養(yǎng)基一次。
[0047] (5)待細胞鋪滿板子（約15天），用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基 進行培養(yǎng)。
[0048] (6)每隔7天傳代1次。
[0049] 三、實驗結(jié)果：
[0050] 圖1為相差顯微鏡下的金魚心臟細胞系的形態(tài)；圖2是金魚心臟細胞系懸浮特性 分析，結(jié)果表明細胞均一性比較好，集中在直徑12-18微米。
[0051] 實施例2金魚心臟細胞系的傳代培養(yǎng)和凍存保種
[0052] -、試劑
[0053] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0054] 凍存液：含10 % DMS0、25 %的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0055] 二、實驗方法
[0056] 1.待細胞生長至90 %時，棄掉舊的培養(yǎng)基，加入5ml胰酶消化液進行消化；
[0057] 2.待細胞呈現(xiàn)"白霧"狀的時候，加入2ml的凍存液，以終止胰酶的作用，輕輕幌 動，使細胞混勻，計數(shù)。
[0058] 3.收集細胞到凍存管中，于凍存管上注明細胞的名稱、細胞數(shù)和凍存日期。
[0059] 4. -個月后，按照常規(guī)細胞復(fù)蘇的方法，進行細胞復(fù)蘇，細胞增殖能力仍然很強， 狀態(tài)良好。
[0060] 獲得的金魚心臟細胞系（GH)已于2014年7月3日保存在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC No. 9334。
[0061] 實施例3金魚心臟細胞系的最適條件確定
[0062] -、試劑
[0063] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0064] 培養(yǎng)基：不同濃度的特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
[0065] 二、實驗方法
[0066] 1、最適血清的確定
[0067] 分別配制特級胎牛血清濃度為10 %和20%的培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為 3 X 105πι?Λ二種血清濃度培養(yǎng)基各按lmL/孔的量接種于24孔板，于25°C，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每天從每個實驗組里取出3孔細胞，消化收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)7天，連續(xù)計數(shù)7次，繪制 其生長曲線。
[0068] 2、最適溫度的確定
[0069] 選擇201：、251：、301：三個不同培養(yǎng)溫度，使用添加20%特級胎牛血清的組99培 養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為3 X ΚΛιιΓ1，細胞懸液按lmL/孔的量接種于24孔板并置于三個不同 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每天從每個實驗組里取出3孔細胞，收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)7天，連 續(xù)計數(shù)7次，繪制其生長曲線。
[0070] 三、實驗結(jié)果
[0071] 1.最適血清的確定（圖3)，金魚心臟細胞系在特級胎牛血清20 %的M199培養(yǎng)基 中，增長繁殖最好。
[0072] 2.最適溫度的確定（圖4)，金魚心臟細胞系在25°C生長，繁殖最好。
[0073] 實施例4金魚心臟細胞系的生長曲線
[0074] -、試劑
[0075] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0076] 培養(yǎng)基：20%的特級胎牛血清（FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0077] 二、實驗方法
[0078] 取對數(shù)生長期的細胞，收集計數(shù)細胞，使用含20 % FBS的M199培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度 為1. 5 X ΙΟ%!/1，按lmL/孔的量接種至24孔板中，置培養(yǎng)箱中25°C培養(yǎng)。每天取3個孔細 胞，胰酶消化消化制成細胞懸液，混勻后用細胞計數(shù)儀進行計數(shù)，實驗重復(fù)3次，連續(xù)進行 7d，以培養(yǎng)時間（d)為橫坐標，細胞濃度（細胞/mL)為縱坐標，繪制生長曲線。
[0079] 三、實驗結(jié)果
[0080] 金魚心臟細胞系對數(shù)生長期在第l-4d，當4d時進入到平穩(wěn)期（圖5)。
[0081] 實施例5金魚心臟細胞系的初步應(yīng)用
[0082] -、試劑
[0083] 胰酶消化液：磷酸氫二鈉2. 3g，磷酸二氫鉀0· lg，氯化鈉8. 0g，氯化鉀0· 2g，EDTA 〇· 2g，胰酶 0· 6g，水 1000ml。
[0084] 培養(yǎng)基：20%的特級胎牛血清（FBS)的M199培養(yǎng)基。
[0085] 由 ATCC 購買傳染性膜臟壞死病毒（infectious pancreatic necrosis virus， IPNV，ATCC VR-877)。
[0086] 二、實驗方法
[0087] 對金魚心臟細胞系用胰酶消化液進行消化，含有20 %的特級胎牛血清（FBS)的 M199培養(yǎng)基1:1傳代，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞增殖在24h內(nèi)接入傳染性胰臟壞死病毒，置 于16°C培養(yǎng)箱中，每天觀察變化。
[0088] 三、實驗結(jié)果
[0089] 細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的細胞病變，說明金魚心臟細胞系能夠增殖病毒傳染性胰臟壞死 病毒，見圖6。
[0090] 顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對 本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可 以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【權(quán)利要求】
1. 一種金魚心臟細胞系GH，其保藏編號為CGMCC No. 9334。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的金魚心臟細胞系GH，其特征在于，所述細胞系具有以下生物 學(xué)特性： (1) 細胞呈現(xiàn)典型的上皮細胞形態(tài)，連續(xù)傳代培養(yǎng)50代仍保持該形態(tài)特點； (2) 細胞具有較強的增殖能力，連續(xù)培養(yǎng)50代仍保持該增殖和生長特性。
3. -種權(quán)利要求1所述的金魚心臟細胞系GH的制備方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟： (1) 取金魚一條，用醫(yī)用酒精浸泡l_5min，于無菌條件下剪取金魚的心臟，放于濃度為 1000u/ml的青霉素-鏈霉素雙抗溶液中； (2) 用解剖刀切割成小塊，胰酶消化液消化5min，用培養(yǎng)基重懸，離心，棄掉上清液，再 用培養(yǎng)基進行重懸，離心，棄掉上清，最后加入培養(yǎng)基，重懸混勻； (3) 將步驟（2)制備的重懸混勻液加入到細胞培養(yǎng)瓶中，25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4) 待細胞鋪板到1/3的時候，更換新鮮的培養(yǎng)基一次； (5) 待細胞鋪滿板子，用胰酶消化液進行初步消化后，加入新的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)； (6) 傳代3次后，凍存，復(fù)蘇后能夠繼續(xù)穩(wěn)定增殖生長，該細胞系命名為GH。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含有濃度為lOOu/ml青 霉素-鏈霉素雙抗溶液和20 %特級胎牛血清的M199培養(yǎng)基。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述胰酶消化液的配制：磷酸氫二鈉 2. 3g，磷酸二氫鉀 0. lg，氯化鈉 8. 0g，氯化鉀 0. 2g，EDTA 0. 2g，胰酶 0. 6g，水 1000ml。
6. 權(quán)利要求1所述的金魚心臟細胞系GH作為研究水產(chǎn)動物病毒宿主細胞的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的金魚心臟細胞系GH在水產(chǎn)動物病毒分離中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N7/00GK104152399SQ201410395208
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】景宏麗, 張旻, 王娜, 高隆英, 張利峰, 林祥梅, 吳紹強, 王樹云, 江育林 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院