一種適用于臨床的高效擴增nk細胞的培養(yǎng)體系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于臨床的高效擴增NK細胞的培養(yǎng)體系。具體提供了一種不含血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系，所述的培養(yǎng)體系包含以下各成分：1640培養(yǎng)基、碳酸氫鈉、人血清白蛋白、轉鐵蛋白、亞油酸、油酸、棕櫚酸、丙酮酸鈉、人重組胰島素、非必需氨基酸、2-巰基乙醇、白細胞介素-2。還提供了一種含體積分數(shù)1%-12%人自體血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系。本發(fā)明的培養(yǎng)體系成分簡單，避免了動物血清中的動物成分對細胞治療帶來的風險及動物血清中不確定的成分對細胞培養(yǎng)造成的不確定性，提高了NK細胞得率，所獲得的活化的NK細胞腫瘤殺傷效果顯著，因此除了能應用于科研，也可應用于臨床治療。
【專利說明】一種適用于臨床的高效擴增NK細胞的培養(yǎng)體系

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物領域，具體地說，是一種適用于臨床的高效擴增NK細胞的培養(yǎng)體 系。

【背景技術】
[0002] NK細胞（natural killer cell)于1975年被發(fā)現(xiàn)，屬淋巴細胞譜系，是含有穿孔 蛋白和粒酶顆粒的細胞毒淋巴細胞，為機體重要的免疫細胞。NK細胞來源于骨髓,在形態(tài) 上屬于大顆粒淋巴細胞，占外周血淋巴細胞總數(shù)的5%-10%，其對靶細胞的識別無 MHC限制 性，無需預先致敏即可直接殺傷腫瘤細胞，也可分泌細胞因子調節(jié)其他免疫細胞的功能，是 機體天然免疫的主要承擔者，也是獲得性細胞免疫的核心調節(jié)細胞，在腫瘤免疫、抗病毒感 染及清除非己細胞中發(fā)揮重要作用。
[0003] 目前，基于NK細胞的腫瘤生物治療取得了較大進展，其中基于NK細胞天然免疫識 別的腫瘤生物治療途徑有很多新的設想，人們通過免疫放療和化療方案大幅度提高NK細 胞的抗癌功效。近期研究證明，適度放療和化療可以使腫瘤細胞高表達NK細胞活化受體識 別的配基(如NKG2D)，使腫瘤細胞易于被NK細胞識別而清除；同時，還發(fā)現(xiàn)組蛋白脫乙酰酶 抑制劑和蛋白酶體抑制劑可以誘導腫瘤細胞DR2,從而被NK細胞以TRAIL途徑殺傷；另外， 基于NK細胞的ADCC效應設計的生物治療方案，采用治療性單抗或治療性雙功能抗體結合 NK細胞體內運輸可以極大地提高臨床腫瘤生物治療的療效。
[0004] 目前臨床上獲得NK細胞的方法一般是從外周血單個核細胞中進行擴增，培養(yǎng)過 程中一般需要加入動物血清來提高培養(yǎng)效果。然而，其主要存在以下缺陷： ① NK細胞只占正常外周血淋巴細胞的5%-20%，含量很少，從外周血中分離NK細胞成 本高，且分離出來的NK細胞一般處于非活化狀態(tài)，在很大程度上限制了在臨床上的應用。
[0005] ②大多數(shù)體外擴增和活化NK細胞的方法都需要應用到基因工程細胞，即應用 ⑶64、⑶86修飾K562細胞構建人工抗原遞呈細胞（aAPC)，然后將4-1BBL(⑶137L)和膜固 定IL15等導入此細胞中，構建CD64-CD86-41BBL-Mill5-aAPC，并利用此人工抗原遞呈細胞 進行NK細胞體外擴增，這種方法可以獲得較強細胞毒性的NK細胞，但NK細胞增殖受到限 制，5-6周后細胞不再擴增。而且K562細胞是紅白血病細胞，這種方法操作復雜，細胞得率 低，一定程度上降低了臨床使用的安全性。
[0006] ③動物血清成分復雜，含有對細胞有害的成分，如多胺氧化酶，能與來自高度繁 殖細胞的多胺反應形成有細胞毒性作用的聚精胺、補體、抗體、細菌毒素等，這些會影響細 胞生長，甚至造成細胞死亡；動物個體不同，血清產地、批次不同，其成分不能保持一致；取 材中可能帶入支原體、病毒，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠；大規(guī)模生產中，血清來 源困難，價格昂貴。不能適用于臨床細胞治療體系。
[0007] ④一些NK細胞培養(yǎng)基產品在使用過程中需要使用大量的抗體包被培養(yǎng)耗材，抗 體價格昂貴，增加成本。
[0008] 中國專利文獻CN201410118900. 6,
【公開日】2014. 06. 11，公開了一種適用于培養(yǎng)NK 細胞的無血清培養(yǎng)基，由基礎培養(yǎng)基組份I、NK細胞特異性培養(yǎng)組份II以及水組成。所述 基礎培養(yǎng)基組份I是由以下濃度的組分組成的：無水氯化鈣28?33. 82mg/L，i-肌醇13? 19mg/L，L-酪氨酸4?5. 9mg/L，L-蛋氨酸3?5mg/L，L-纟顏氨酸6?13. 7mg/L，L-苯丙氨酸 4?7mg/L，D_葡萄糖1789?1802mg/L，鹽酸批卩多醇（維生素 Β6)0· 055?0· 066mg/L，次黃 噪呤3?5mg/L，L-絲氨酸7?15mg/L，氯化鈉 7200?7599mg/L，核黃素 0· 022?0· 048mg/ L，亞油酸0· 077?0· 094mg/L，L-蘇氨酸10?13. 9mg/L，磷酸氫二鈉 120?149mg/L，鹽 酸硫胺0· 22?0· 34mg/L，硫辛酸0· 12?0· 29mg/L，L-天門冬酰胺7?18. 01mg/L，L-精 氨酸鹽酸鹽198?213mg/L，L-天門冬氨酸6?19. 3mg/L，l，4 一丁二胺二鹽酸鹽(λ 11? 0· 19mg/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽22?39. 12mg/L，L-谷氨酰胺113?149mg/L，L-谷氨酸2? 17. 7mg/L，丙酮酸鈉 100?110mg/L，氯化膽堿12?13. 99mg/L，甘氨酸6?8mg/L，L-亮氨 酸11?13. 4mg/L，維生素 H0. 004?0· 008mg/L，L-賴氨酸鹽酸鹽34?39. 5mg/L，L-組氨 酸鹽酸鹽9?25mg/L，L-脯氨酸25?34. 5mg/L ;所述NK細胞特異性培養(yǎng)組份II是由以 下濃度的組分組成的：表皮生長因子1?l〇〇mg/L，⑶16單抗20?100mg/L，神經生長因子 1 ?10mg/L，IL-21 20 ?100mg/L，成纖維素細胞生長因子 1 ?100mg/L，IL-18 50 ?150mg/ L，卵泡刺激因子 50 ?500mg/L，IL-12 50 ?500mg/L，CD3 單抗 50 ?500mg/L，CD125 單抗 50?500mg/L。經實驗證明，該無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)NK細胞，能夠得到數(shù)量更多，純度更高且 殺傷效果更好的NK細胞。然而，上述培養(yǎng)基的成分十分復雜。
[0009] 綜上所述，亟需一種成分更簡單的臨床級別的高效擴增NK細胞的完全培養(yǎng)基。


【發(fā)明內容】

[0010] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種不含人自體血清的擴增NK細 胞的培養(yǎng)體系。
[0011] 本發(fā)明再一的目的是，提供一種含人自體血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系。
[0012] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是： 一種不含人自體血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系，所述的培養(yǎng)體系包含以下質量比的 各成分：

【權利要求】
1. 一種不含人自體血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含 以下質量比的各成分：
2. 根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含以下質量比的 各成分：
3. 根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含以下質量比的 各成分：
〇
4. 一種含人自體血清的擴增NK細胞的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含以 下質量比的各成分：
5.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含以下質量比的 各成分：
6. 根據(jù)權利要求2所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系包含以下質量比的 各成分：
7. 根據(jù)權利要求1-6任一所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的1640培養(yǎng)基的成分 為：

8. 根據(jù)權利要求1-6任一所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分 為：
9. 根據(jù)權利要求8所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分為：
10.根據(jù)權利要求1-6任一所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述的培養(yǎng)體系pH: 7. 0-7. 4 ;滲透壓：260-320m0sm/kg ;細菌、真菌檢測：陰性；衣原體、支原體檢測：陰性；內 毒素：〈0· 5EU/ml。
【文檔編號】C12N5/0783GK104152412SQ201410395117
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權日:2014年8月13日
【發(fā)明者】鄭敦武, 莫筱縈, 羅晴燕, 梁心田, 楊燕燕, 胡紅, 姜莎莎, 徐文靜 申請人:賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司