胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化的方法
【專利摘要】一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化的方法，利用II型膠原酶消化法和貼壁培養(yǎng)法從胎盤(pán)分離制備間充質(zhì)干細(xì)胞，并應(yīng)用bFGF、EGF、BDNF、PDGF、NGF和RA誘導(dǎo)人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。本發(fā)明使用的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源充足，且誘導(dǎo)過(guò)程采用的細(xì)胞因子成分明確、分化效率高、耗時(shí)較短，誘導(dǎo)分化的神經(jīng)樣細(xì)胞可以用來(lái)移植治療多種神經(jīng)性疾病，在臨床有很好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)増和誘導(dǎo)分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，尤其涉及一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化的方法。【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下可被誘導(dǎo)分化成各種組織細(xì)胞，包括骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。最新研究表明MSCs易于外源基因?qū)氡磉_(dá)，而且具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，因此MSCs不僅可作為組織工程的種子細(xì)胞，也為基因治療提供了一個(gè)可靠的工具，同時(shí)在誘導(dǎo)移植耐受和治療自身免疫性疾病中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前報(bào)道的MSCs主要來(lái)源于骨髓，但骨髓中的含量很低，僅占骨髓中單個(gè)核細(xì)胞的1/106?1/105， 且有時(shí)因病毒感染或因衰老使骨髓中細(xì)胞數(shù)量顯著降低或骨髓增生分化功能降低，使骨髓來(lái)源的MSCs受到了限制。另外的牙髓、脂肪、臍血源的間充質(zhì)干細(xì)胞也有報(bào)道，但它們的MSC 含量稀少，分離困難，不適合規(guī)?；僮?。
[0003]胎盤(pán)絨毛膜富含間充質(zhì)干細(xì)胞，是一個(gè)可能優(yōu)于骨髓和其它組織的種子細(xì)胞源泉，具備以下優(yōu)點(diǎn):(1)來(lái)源充足，取材方便，作為一種分娩廢棄物，其采集不存在任何倫理問(wèn)題；(2)細(xì)胞數(shù)量豐富，增殖能力強(qiáng)；(3)分離出的MSC免疫表型不成熟，具有較弱的免疫細(xì)胞抗原性；(4)具有與BMSCs相似的干細(xì)胞特性，具有良好的自我更新和多向分化增殖能力， 因此可在較短的時(shí)間內(nèi)可獲得更多的細(xì)胞數(shù)量，以滿足臨床需求。
[0004]目前文獻(xiàn)報(bào)道的運(yùn)用間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的研究報(bào)道非常多， 主要有:(1)傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)劑(抗氧化劑)法，如:0-ME⑴-巰基乙醇)、二甲基亞砜(DMS0)、 丁基羥基茴香醚(BHA)聯(lián)合誘導(dǎo)等；(2)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)法，如:神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和維甲酸(RA)單獨(dú)或者聯(lián)合誘導(dǎo)等；(3)生長(zhǎng)因子與化學(xué)誘導(dǎo)劑聯(lián)合；(4)共培養(yǎng)或用接近生理狀態(tài)的條件培養(yǎng)基；(5)中藥成分如丹參、 黃芩苷等?；瘜W(xué)誘導(dǎo)劑毒性大，細(xì)胞死亡率高；中藥成分不確定，難于保證分化的穩(wěn)定性;神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)存在目標(biāo)細(xì)胞難以分離和潛在外源病原體的問(wèn)題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，集體外分離、擴(kuò)增和誘導(dǎo)分化于一體，實(shí)施簡(jiǎn)便。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，以胎盤(pán)來(lái)源的已分離和擴(kuò)增的間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)作為種子細(xì)胞，定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)方法。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，采用成分明確的誘導(dǎo)劑細(xì)胞因子，提高分化效率，縮短時(shí)間。
[0008]本發(fā)明提供的一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其包括如下步驟:
[0009]步驟1:將所采集的胎盤(pán)臍帶側(cè)的羊膜去除，分離得到絨毛膜；
[0010]步驟2:再去除絨毛膜表面黏附的結(jié)締組織；
[0011]步驟3:將絨毛膜剪碎成小塊(如;體積約為1mm3)，加入等體積II型膠原酶消化；
[0012]步驟4:分離得到hPMSCs(如:采用離心方式去除組織塊和膠原酶)，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(如:T25型)，進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；[〇〇13]步驟5:取第二代或第三代細(xì)胞進(jìn)行流式表面抗原鑒定；[〇〇14]步驟6:取第三代或第四代細(xì)胞接種(如:接種于6孔板):[〇〇15]步驟7:培養(yǎng)至間充質(zhì)干細(xì)胞愈合度達(dá)60 %?80 %時(shí)棄掉培養(yǎng)基，更換含有細(xì)胞因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0016]步驟8:誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，2天?3天后進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。[0〇17]本發(fā)明方法，其n型膠原酶的終濃度0.lw/v%?0.2w/v%，消化時(shí)間為90分鐘? 100分鐘，消化溫度為37°C。消化采用振蕩消化，速率為200rpm?300rpm。[〇〇18]本發(fā)明方法，原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還含有10v/v%胎牛血清、lv/v%青霉素、lv/v%鏈霉素和lv/v%谷氨酰胺。原代培養(yǎng)過(guò)程中每隔3天更換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞愈合度達(dá)到80%進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。[〇〇19]本發(fā)明方法，流式表面抗原鑒定使用的抗體為下列鼠抗人單克隆抗體<090_ ?11'(:、〇)105-?￡、〇)73-厶？(:、〇)14-/〇)20-/〇)34-/〇)45-?6^^，以鼠抗人的1861-卩11'(:、1861-PE、IgGl-APC、IgGl-PerCP、IgG2a-PerCP作為同型對(duì)照。[〇〇2〇]本發(fā)明方法，優(yōu)先選擇hPMSCs愈合度為70 %時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。[〇〇21]本發(fā)明方法，所使用的細(xì)胞因子及其濃度分別為20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、10ng/ml腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、10ng/ml血小板衍生因子(PDGF)、100ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和1 OyM維甲酸(RA)。
[0022]本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果:
[0023]本發(fā)明提供的一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，將分離自胎盤(pán)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后，載定向分化成神經(jīng)樣細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有分化能力強(qiáng)和免疫原性低等特點(diǎn)，誘導(dǎo)過(guò)程不使用具有細(xì)胞毒性的化學(xué)物質(zhì)，不會(huì)引起假陽(yáng)性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，也不使用神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)，因此不存在目標(biāo)細(xì)胞難以分離和潛在外源病原體的問(wèn)題。同時(shí)，本發(fā)明方法誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)因子的使用，最大程度地模擬了神經(jīng)細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中所處的微環(huán)境。因此，本發(fā)明不僅能夠獲得豐富的高質(zhì)量MSC，并且能夠更加有效地促進(jìn)MSC 向神經(jīng)細(xì)胞的分化。
[0024]本發(fā)明提供的方法不使用具有細(xì)胞毒性的化學(xué)物質(zhì)、不使用神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)、不使用中藥成分作用、誘導(dǎo)劑細(xì)胞因子成分明確、分化效率高、耗時(shí)較短的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明提供的方法能簡(jiǎn)便和穩(wěn)定地獲得大量神經(jīng)樣細(xì)胞，為治療神經(jīng)退行性疾病提供可能?！靖綀D說(shuō)明】[〇〇25] 圖1為原代hPMSCs光學(xué)顯微鏡下形態(tài)；[〇〇26]圖2為hPMSCs表面抗原分子的流式細(xì)胞儀鑒定圖；[〇〇27]圖3為hPMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后神經(jīng)元樹(shù)突標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白(MAP2)免疫熒光圖；
[0028]圖4為hPMSCs誘導(dǎo)為經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光圖?！揪唧w實(shí)施方式】[〇〇29]以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例其它所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自西格瑪一奧德里奇(Sigma — Aldrich)公司。
[0031]實(shí)施例1胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞分離制備
[0032]使用經(jīng)產(chǎn)婦同意授權(quán)的新生兒胎盤(pán)作為間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源。
[0033]無(wú)菌條件下取產(chǎn)后新鮮胎盤(pán)，采用胎盤(pán)保存液(參見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利第 ZL201410028687.X號(hào))和胎盤(pán)采集保存裝置(參見(jiàn)中國(guó)實(shí)用新型專利第ZL2014203904164 號(hào))進(jìn)行胎盤(pán)的保存運(yùn)輸。48h內(nèi)無(wú)菌條件下采用機(jī)械法將羊膜從胎盤(pán)組織上剝離，然后小心剪取胎盤(pán)絨毛膜，盡量多的去除掉黏附在絨毛膜上的結(jié)締組織，用含lv/v%P/S的PBS浸泡漂洗3次?5次，將漂洗后的絨毛膜用眼科剪剪成約1_3碎塊，加入n型膠原酶(酶消化終濃度〇.1 % )37°C消化90min，并于200rpm振蕩。加入培養(yǎng)基500rpm離心5min(去除組織塊和膠原酶)，取上清加入培養(yǎng)基2,000rpm離心lOmin(進(jìn)一步去除膠原酶)，棄上清，加入培養(yǎng)基 2，000rpm離心10min(更進(jìn)一步去除膠原酶)，棄上清，加入培養(yǎng)基吹打均;取20yl細(xì)胞懸液加入到80yl紅細(xì)胞裂解液中，室溫下裂解5min，計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0 X 106細(xì)胞/ml，接種于T25cm2型細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37°C，5%⑶2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察;培養(yǎng)2天?3天后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每2-3d全量換液一次;觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80-90 %匯合時(shí)，以0.25 %胰蛋白酶-0.01 % EDTA消化，所得細(xì)胞為原代細(xì)胞(參見(jiàn)圖1)。[〇〇34] 觀察原代hPMSCs細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80 %?90 %匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液， 吸取10ml0.01M PBS緩沖液輕輕加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液1.0ml，浸漫覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下觀察;加入1.0mlFBS中止胰酶消化； 加入10ml 0.01M PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下1200rpm離心5min ;棄去上清液，加入5ml DMEM重懸細(xì)胞，按1:2?1:3比例傳代培養(yǎng);置37°C，5%C02，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 計(jì)為第1代hPMSCs(P1)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80 %?90 %匯合時(shí)，重復(fù)上述操作進(jìn)行P2、P3、P4…代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0035]實(shí)施例2胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型鑒定[〇〇36]取培養(yǎng)第2或第3代hPMSCs，首先用0.25%的胰蛋白酶消化離心，然后用含1 %小牛血清白蛋白的PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至lX107/ml;分別加入鼠抗人單克隆標(biāo)記抗體⑶90-FITC、 〇0105-卩已、〇)73-厶？(:、〇014-/^020-/^034-/^045-?6^^，以鼠抗人的1861-卩11'(:、1861-?￡、 IgGl-APC、IgGl-PerCP、IgG2a-PerCP作為同型對(duì)照，室溫避光孵育lOmin，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。結(jié)果顯示分離制備所得細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CD73、 ⑶90和⑶105均在99%以上，而不表達(dá)⑶14、⑶20、⑶34和⑶45等表面抗原，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，制備所得的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞純度很高。
[0037]實(shí)施例3胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)[〇〇38] 取3?4代培養(yǎng)細(xì)胞，5 X 104接種于6孔板，待hPMSCs生長(zhǎng)密度達(dá)到70 %時(shí)，換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基;培養(yǎng)基成分為:DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還加入10 % FBS、1 % P/S、1 % Glu、20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、10ng/ml腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、10ng/ml血小板衍生因子、l〇〇ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子和10yM維甲酸，37°C，5%C02，飽和濕度靜置培養(yǎng)。
[0039]實(shí)施例4胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的檢測(cè)
[0040]加入誘導(dǎo)液2小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)即明顯變化，光鏡下hPMSCs的細(xì)胞質(zhì)向核收縮，呈典型的核周體形態(tài)，3小時(shí)?5小時(shí)后多數(shù)細(xì)胞能形成神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，胞體呈圓形，突起較長(zhǎng)，在突起末端出現(xiàn)分支，部分相鄰細(xì)胞的突起連接成網(wǎng)，但細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯增加;3天后大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殡p極或多極神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)，伸出突觸(類似軸突或樹(shù)突)，部分細(xì)胞之間拉成網(wǎng)狀。[〇〇411 hPMSCs在誘導(dǎo)分化3天后采用免疫熒光染色。貼壁細(xì)胞去培養(yǎng)基，用roS洗3次，經(jīng) 4%的多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗滌3次，0.3 % TritonX-100處理20分鐘，PBS漂洗3次，10 % 羊血清室溫封20分鐘，吸出血清，分別加入鼠抗人MAP2(1:500)、GFAP( 1:1000)，4°C過(guò)夜，然后PBS洗3次，加入羊抗鼠-FITC( 1: 500)孵30分鐘，染色可見(jiàn)50 %?70 %MAP2(參見(jiàn)圖3)、 25%?50%GFAP陽(yáng)性(參見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了神經(jīng)樣細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其步驟如下:步驟1:將所采集的胎盤(pán)臍帶側(cè)的羊膜去除，分離得到絨毛膜；步驟2:再去除絨毛膜表面黏附的結(jié)締組織；步驟3:將絨毛膜剪碎成小塊，加入等體積II型膠原酶消化；步驟4:分離得到hPMSCs，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；步驟5:取第二代或第三代細(xì)胞進(jìn)行流式表面抗原鑒定；步驟6:取第三代或第四代細(xì)胞接種:步驟7:培養(yǎng)至間充質(zhì)干細(xì)胞愈合度達(dá)60 %?80 %時(shí)棄掉培養(yǎng)基，更換含有細(xì)胞因子的 誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；步驟8:誘導(dǎo)培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，2天?3天后進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于II型膠原 酶的終濃度0.lw/v%?0.2w/v%，消化時(shí)間為90分鐘?100分鐘，消化溫度為37°C。消化采 用振蕩消化，速率為200rpm?300rpm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于所述原代 培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)所用培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還含有10v/v%胎牛血清、lv/v% 青霉素、1 v/v %鏈霉素和1 v/v %谷氨酰胺。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的原 代培養(yǎng)過(guò)程中每隔3天更換一次培養(yǎng)基，直至細(xì)胞愈合度達(dá)到80%進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的流 式表面抗原鑒定使用的抗體為下列鼠抗人單克隆抗體:CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、 CD 14-/CD20-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的 I gG 1 -FITC、I gG 1 -PE、I gG 1-APC、I gG 1 -PerCP 和IgG2a-PerCP作為同型對(duì)照。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于hPMSCs愈 合度為70%時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)方法，其特征在于所述的細(xì) 胞因子選自于20ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子、10ng/ml腦源性神 經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、l〇ng/ml血小板衍生因子、100ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子和10yM維甲酸之一種或幾種。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK106032529SQ201610528188
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】章毅, 陳亮, 王哲
【申請(qǐng)人】章毅, 中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)上海生物科技有限公司, 重慶市干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 陜西省干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 蘇州市干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 三亞市干細(xì)胞技術(shù)有限公司, 中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)海南博鰲附屬干細(xì)胞醫(yī)院有限公司