本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)劑及細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，特別涉及一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)劑及方法。

背景技術(shù)：

成熟的T細(xì)胞具有免疫活性，可通過淋巴管、外周血和組織液等進(jìn)行再循環(huán)，發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。T細(xì)胞的再循環(huán)有利于廣泛接觸進(jìn)入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，加強(qiáng)免疫應(yīng)答，較長(zhǎng)期保持免疫記憶。通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增記憶性T細(xì)胞然后回輸至體內(nèi)，有望治療某些特定的疾病。

記憶性T細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增方法中，比較成熟的是使用抗CD3和抗CD28抗體聯(lián)合刺激誘導(dǎo)分化，刺激分化的T細(xì)胞明顯增殖活化，原態(tài)細(xì)胞減少，明顯轉(zhuǎn)為記憶細(xì)胞表型。然而這種T細(xì)胞在體內(nèi)存活的時(shí)間較短，療效難以滿足治療的需要。

干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞(T Stem Memory Cell, TSCM) 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)T細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞處于記憶細(xì)胞的分化上游，具有干細(xì)胞的特征，具有較強(qiáng)的多向分化潛能，TSCM細(xì)胞能分化為中樞性記憶性T細(xì)胞（TCM），效應(yīng)性記憶T細(xì)胞（TEM）和效應(yīng)性T細(xì)胞（TEF），進(jìn)而產(chǎn)生大量的IFN-γ等效應(yīng)分子，產(chǎn)生更為強(qiáng)大的殺傷力，在具有分化潛能的同時(shí)具有較強(qiáng)的自我更新能力。TSCM細(xì)胞展現(xiàn)出了更強(qiáng)的抗腫瘤能力，其在體內(nèi)的自我更新能力，第二次免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，在機(jī)體內(nèi)停留時(shí)間均強(qiáng)于傳統(tǒng)意義上的記憶性細(xì)胞，體外移植實(shí)驗(yàn)表明其具有很強(qiáng)的生存能力。

臨床上細(xì)胞治療的過繼回輸面臨著處于終末階段的細(xì)胞很難在體外培養(yǎng)的條件下長(zhǎng)期生存，并且難以獲得足夠量的細(xì)胞，而TSCM細(xì)胞所具備的這些特征解決了臨床上移植細(xì)胞體外擴(kuò)增難的問題。并且，TSCM細(xì)胞有很強(qiáng)的生存能力使得植入體內(nèi)細(xì)胞的生存時(shí)間延長(zhǎng)，自身產(chǎn)生的抗腫瘤功能的細(xì)胞因子也使得TSCM細(xì)胞成為最有效的細(xì)胞治療細(xì)胞類型。所以利用體外擴(kuò)增的TSCM進(jìn)行治療將成為細(xì)胞治療新的途徑與手段。

利用具有干細(xì)胞特性的T細(xì)胞進(jìn)行治療的方式將改變傳統(tǒng)的藥物與免疫治療的模式，開辟細(xì)胞治療的新技術(shù)，新方法，新思路。真正利用TSCM細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的關(guān)鍵在于充分認(rèn)識(shí)TSCM細(xì)胞特性并且找到在體外使得TSCM細(xì)胞大量擴(kuò)增的方法，因此，有目的、有針對(duì)性的推進(jìn)體外擴(kuò)增TSCM細(xì)胞的技術(shù)方法，找到經(jīng)濟(jì)方便副作用小的細(xì)胞因子或者藥物，具有極為重要的意義。然而，現(xiàn)有技術(shù)中缺乏較為簡(jiǎn)便高效的TSCM體外擴(kuò)增方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)劑及方法。

一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其主體為T細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加有組胺H1受體拮抗劑。

作為上述培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯雷他定、西替利嗪。

作為上述培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑為苯海拉明，其在培養(yǎng)基中的終濃度為10～50 μM，更佳為25μM。

一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：

1)分選出CD8⁺ T 細(xì)胞，置于T細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；

2)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑Anti-CD3抗體、Anti-CD28抗體、組胺H1受體拮抗劑，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，適時(shí)補(bǔ)充組胺H1受體拮抗劑；

3)培養(yǎng)結(jié)束，分選出需要的TSCM。

作為上述干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯雷他定、西替利嗪。

作為上述干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑為苯海拉明，其在培養(yǎng)基中的終濃度為10～50 μM，更佳為25μM。

發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以在T細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中額外添加組胺H1受體拮抗，可以在體外快速將CD8初始T細(xì)胞誘導(dǎo)分化擴(kuò)增為TSCM細(xì)胞，且TSCM細(xì)胞占CD8細(xì)胞比例上有明顯抬高，TSCM細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)有顯著抬高。誘導(dǎo)分化擴(kuò)增的TSCM細(xì)胞保持了TSCM細(xì)胞的特性和功能。

組胺H1受體拮抗劑，對(duì)人體的安全性早已經(jīng)過臨床實(shí)踐的檢驗(yàn)，避免了新藥研發(fā)漫長(zhǎng)的周期。同時(shí)，組胺H1受體拮抗劑作為一種成熟的藥物，具有成本低廉、安全性好的優(yōu)點(diǎn)，加入組胺H1受體拮抗劑誘導(dǎo)分化擴(kuò)增的TSCM細(xì)胞無需進(jìn)行特別的處理即可用回輸，為腫瘤細(xì)胞治療提供了強(qiáng)有力的實(shí)踐基礎(chǔ)，具有重要的開發(fā)價(jià)值和推廣意義。

附圖說明

圖1 為不同組胺H1受體拮抗劑對(duì)TSCM細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果；

圖2 為不同組胺H1受體拮抗劑對(duì)TSCM細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

圖3 為不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明(Diphenhydramine)對(duì)TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果；

圖4為不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明(Diphenhydramine)對(duì)TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；

圖5為不同濃度苯海拉明對(duì)CD8⁺ T細(xì)胞細(xì)胞毒性檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其主體為T細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加有組胺H1受體拮抗劑。

作為上述培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑選自第一代組胺H1受體拮抗劑、第二代組胺H1受體拮抗劑和第三代組胺H1受體拮抗劑。

作為上述培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯苯那敏、賽庚啶、去氯羥嗪、羥嗪、氯雷他定、西替利嗪、特非那丁、阿斯咪唑、艾巴斯丁、非索那丁、阿化斯丁、甲喹吩嗪、咪唑斯丁、依巴斯丁、非索非那丁、去甲基阿司咪唑、脫羧基氯雷他啶。進(jìn)一步的，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯雷他定、西替利嗪。

H1受體拮抗劑既可以單獨(dú)使用，也可以組合使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行嘗試，確定合適的使用方式。

作為上述培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑為苯海拉明，其在培養(yǎng)基中的終濃度為10～50 μM，更佳為25μM。

一種干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法，包括如下步驟：

1)分選出CD8⁺ T 細(xì)胞，置于T細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；

2)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑Anti-CD3抗體、Anti-CD28抗體、組胺H1受體拮抗劑，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，適時(shí)補(bǔ)充組胺H1受體拮抗劑；

3)培養(yǎng)結(jié)束，分選出需要的TSCM。

作為上述干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯苯那敏、賽庚啶、去氯羥嗪、羥嗪、氯雷他定、西替利嗪、特非那丁、阿斯咪唑、艾巴斯丁、非索那丁、阿化斯丁、甲喹吩嗪、咪唑斯丁、依巴斯丁、非索非那丁、去甲基阿司咪唑、脫羧基氯雷他啶。進(jìn)一步的，組胺H1受體拮抗劑選自苯海拉明、異丙嗪、氯雷他定、西替利嗪。

H1受體拮抗劑既可以單獨(dú)使用，也可以組合使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行嘗試，確定合適的使用方式。

作為上述干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增誘導(dǎo)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，組胺H1受體拮抗劑為苯海拉明，其在培養(yǎng)基中的終濃度為10～50 μM，更佳為25μM。

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。

誘導(dǎo)劑對(duì)對(duì)TSCM細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果

1)流式細(xì)胞儀分選出初始 CD8⁺ T 細(xì)胞(CD8⁺ 、CD45RO^- 、CD62L⁺)，將分選出來的CD8⁺T細(xì)胞鋪在12孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每孔預(yù)期的細(xì)胞數(shù)為1×10⁶個(gè)；

2)對(duì)鋪板后的CD8⁺T細(xì)胞加入1μg/ml（終濃度）Anti-CD3抗體 + 1μg/ml（終濃度）Anti-CD28抗體，以及不同的組胺H1受體拮抗劑，分別為25μM的苯海拉明（Diphenhydramine）、西替利嗪（Cetirizine）和氯雷他定（Loratadine）；對(duì)照組加入相應(yīng)體積的PBS。每種處理設(shè)置三個(gè)復(fù)孔作為平行對(duì)照，并在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天，第7天，第10天，第13天補(bǔ)加藥物或PBS刺激；

3)細(xì)胞培養(yǎng)14天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，孵育檢測(cè)CD8+ TSCM的流式抗體（CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、CD95、CD122）運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均為同一供體的CD8+ T細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取不同供體的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1和2所示。從圖1和2中可以看出，隨機(jī)選擇每一代的組胺受體拮抗劑均可在體外促進(jìn)CD8⁺、CD45RA⁺、CD45RO^-、CCR7⁺、CD62L⁺、CD95⁺、CD122⁺ TSCM細(xì)胞的分化發(fā)育，最終顯著抬高TSCM的比例，而其中苯海拉明的效果最為顯著。

不同濃度誘導(dǎo)劑對(duì)TSCM細(xì)胞的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增效果

1)流式細(xì)胞儀分選出初始CD8⁺ T 細(xì)胞(CD8⁺ 、CD45RO^- 、CD62L⁺)，將分選出來的CD8⁺T細(xì)胞鋪在12孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每孔預(yù)期的細(xì)胞數(shù)為1×10⁶個(gè)；

2)對(duì)鋪板后的CD8⁺T細(xì)胞加入1μg/ml（終濃度）Anti-CD3抗體 + 1μg/ml（終濃度）Anti-CD28抗體，以及不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明，每種處理設(shè)置三個(gè)復(fù)孔作為平行對(duì)照，并在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天，第7天，第10天，第13天補(bǔ)加藥物以及細(xì)胞因子刺激；

3)細(xì)胞培養(yǎng)14天后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，孵育檢測(cè)CD8+ TSCM的流式抗體（CD8、CD45RA、CD45RO、CCR7、CD62L、CD95、CD122）運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均為同一供體的CD8+ T細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取不同供體的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖中可以看出，TSCM的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增和組胺H1受體拮抗劑的濃度成正相關(guān)關(guān)系，TSCM與苯海拉明相關(guān)系數(shù)r²=0.9913。結(jié)合藥物濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響，苯海拉明體外誘導(dǎo)擴(kuò)增TSCM的最適濃度為25μM。

不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明對(duì)CD8⁺ T細(xì)胞的體外毒性的研究

流式細(xì)胞儀分選出初始CD8+ T 細(xì)胞(CD8⁺ 、CD45RO^- 、CD62L⁺)，將分選出來的CD8+T細(xì)胞鋪在96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每孔預(yù)期的細(xì)胞數(shù)為1×10⁵個(gè)；

對(duì)鋪板后的CD8⁺T細(xì)胞加入1μg/ml（終濃度）Anti-CD3抗體 + 1μg/ml（終濃度）Anti-CD28抗體，以及不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明，每種處理設(shè)置三個(gè)復(fù)孔作為平行對(duì)照。培養(yǎng)72小時(shí)之后，使用CCK8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒，對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，表明不同濃度的組胺H1受體拮抗劑苯海拉明對(duì)細(xì)胞活性沒有影響。與之前文獻(xiàn)報(bào)道可以在體外誘導(dǎo)TSCM的化合物TWS119相比，毒性非常低。