本發(fā)明涉及中藥應用技術領域，具體的說是涉及提取中藥材中的有效成分，并在提高CIK細胞增殖速率、CD3和CD56雙陽性和對腫瘤殺傷力的臨床的應用。

背景技術：

細胞過繼免疫治療是目前的研究熱點，并已進入臨床試驗，它是將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，殺滅患者體內的腫瘤細胞，并在此基礎上修復、完善機體免疫系統(tǒng)的生物治療方法。CIK細胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在體外經(jīng)過多種細胞因子共同誘導，能夠同時表達兩種膜蛋白分子即CD3和CD56的異質細胞，它不僅具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性殺瘤特點，還具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性，具有重要的免疫治療臨床應用價值。因此，CIK細胞的體外大量增殖，即提高其體外增殖速率和對腫瘤細胞的殺傷力，是大規(guī)模使用CIK細胞免疫治療的關鍵所在。多糖作為一種免疫調節(jié)和促進劑對巨噬細胞、T/B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)的功能都有調節(jié)作用，本發(fā)明應用人參多糖對CIK細胞的誘導和調節(jié)方面的研究有助于其更好地應用于臨床。

技術實現(xiàn)要素：

利用人參多糖提取液有機地結合CIK細胞免疫治療在腫瘤治療中的強大優(yōu)勢，建立人參多糖促進免疫細胞的大量增殖和提高殺傷力的工藝體系，從而間接改善腫瘤患者的生活質量，延長生存期。本發(fā)明目的在于提供最優(yōu)人參多糖提取液濃度在提高CIK細胞增殖速率、CD3和CD56雙陽性和對腫瘤殺傷力方面的應用。

本發(fā)明提供了一種促進CIK細胞增殖分化的人參多糖，所述人參多糖是采用水提醇沉法從人參中提取得到。

本發(fā)明提供了一種CIK細胞培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和人參多糖。

進一步地，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為3～300μg/mL。優(yōu)選的，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為30μg/mL。

進一步地，所述基礎培養(yǎng)基選自RPM1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基。

進一步地，所述培養(yǎng)基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

本發(fā)明提供了一種CIK細胞培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

(1)制備CIK細胞的出發(fā)細胞；

(2)配制含有人參多糖的培養(yǎng)基，并添加入步驟(1)中的出發(fā)細胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得CIK細胞。

進一步地，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為3～300μg/mL。優(yōu)選的，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為30μg/mL。

進一步地，所述培養(yǎng)基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

進一步地，步驟(2)的方法包括37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d，定期更換1/2對應培養(yǎng)液。

本發(fā)明還提供人參多糖在促CIK細胞增殖分化中的應用。

本發(fā)明還提供了利用所述制備方法制得的CIK細胞在制備腫瘤治療藥物中的應用。

以上所述人參多糖采用經(jīng)水提醇沉法從人參中提取得到。

更進一步的，本發(fā)明還提供了一種水提醇沉法提取人參多糖的方法，包括以下步驟：

(1)取人參，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取時間為2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液用離心機低溫離心20-40分鐘(離心轉速為4000轉/分)、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；

(2)人參多糖粗品加10倍重量水加熱煮沸10-30分鐘，降溫，過濾，向濾液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液用離心機在4℃下離心20-40分鐘(離心轉速為4000轉/分)，收集沉淀；

(3)重復水煮醇沉、冷藏離心過程2-3次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加10倍重量水溶解，藥液用冷凍離心機在-20℃凍實后，在4℃下融解離心20-30分鐘(離心轉速為4000轉/分)，取上清液，上清液重復凍融離心1次后，將上清減壓，減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所述的人參多糖與其他化學誘導增殖因子相比，符合細胞培養(yǎng)要求，即對人體無毒副作用，故誘導增殖后的CIK細胞直接可以用于臨床試驗。(2)與相應的多糖刺激因子相比，本發(fā)明所述的多糖提取方法精練，劑型先進，該多糖提取液功效明顯，成分明確，質量可控。(3)本發(fā)明所述的人參多糖具有明顯提高CIK細胞增殖速率的作用，CD3和CD56雙陽性顯著提高，激活后的細胞殺傷力明顯高于對照CIK細胞處理。

附圖說明

圖1人參多糖不同濃度誘導細胞增值趨勢圖。

圖2最優(yōu)濃度人參多糖誘導后CIK細胞的表型。其中A:30μg/mL人參多糖；B:空白培養(yǎng)基。

圖3最優(yōu)濃度人參多糖誘導后CIK細胞對腫瘤的殺傷力評價。

具體實施方式

下面結合具體附圖對本發(fā)明進行詳細的說明。這些具體的實施例僅僅是在不違背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領域的一般技術人員把現(xiàn)有技術和本發(fā)明結合而產(chǎn)生的其他具體的實施方案，或者利用已有的臨床中藥注射劑而產(chǎn)生的其他具體的實施方案。

主要材料的準備。

一種對CIK細胞增殖分化有明顯提高作用的人參多糖，所述多糖提取物的方法，包括如下步驟：

(1)取人參，加入水煎煮。合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮后；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液用離心機低溫離心、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；

(2)人參多糖粗品加水煮沸，降溫，過濾，向濾液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液離心后收集沉淀；

(3)重復水煮醇沉、冷藏離心過程數(shù)次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加水溶解，藥液冷凍后，在4℃下融解離心。取上清液重復凍融離心后，將上清液減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

(4)精密稱取經(jīng)50℃真空干燥的人參多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即為人參多糖溶液。

實施例l一種人參多糖的提取方法

取人參1kg，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取時間為2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液用離心機低溫離心20-40分鐘(離心轉速為4000轉/分)、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；人參多糖粗品加10倍重量水加熱煮沸10-30分鐘，降溫，過濾，向濾液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過夜，將冷藏后的藥液用離心機在4℃下離心20-40分鐘(離心轉速為4000轉/分)，收集沉淀；重復水煮醇沉、冷藏離心過程2-3次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加10倍重量水溶解，藥液用冷凍離心機在-20℃凍實后，在4℃下融解離心20-30分鐘(離心轉速為4000轉/分)，取上清液，上清液重復凍融離心1次后，將上清減壓，減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

精密稱取經(jīng)50℃真空干燥的人參多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即為人參多糖溶液。

實施例2利用細胞增殖速率篩選人參多糖的最優(yōu)濃度

按常規(guī)CIK細胞培養(yǎng)方法，即第0天加入IFN-γ(1 000U/mL)，CD3單抗(25ng/mL)，置于CO₂培養(yǎng)箱37℃孵育24h后獲得的CIK細胞作為出發(fā)細胞。

在出發(fā)細胞中分別加入含3種濃度梯度的人參多糖(已高溫滅菌)的RPMI1640培養(yǎng)基，置于12孔板內培養(yǎng)，其中濃度梯度為300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL(即沒1mL培養(yǎng)體系中含有的人參多糖的量分別為300μg、30μg和3μg/mL)；將加入不含人參多糖的RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7d，定期更換1/2對應培養(yǎng)液(定期是指根據(jù)細胞生長情況來確定，例如約3d更換培養(yǎng)基)。每天計算細胞濃度，分析每組細胞的增殖趨勢

結果見圖1。從對比實驗結果可以看出，與不含人參多糖的對照相比，實驗組的300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL三組濃度梯度均能有效提高CIK細胞增殖速率，其中人參多糖的最優(yōu)濃度為30μg/mL。

實施例3在最優(yōu)濃度下的進行細胞流式檢測細胞表型。

將上述方法獲得的CIK出發(fā)細胞分別進行測試，A、B組代表最優(yōu)濃度的人參多糖RPMI 1640培養(yǎng)基和不含人參多糖的RPMI 1640培養(yǎng)基(對照)。37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，約3d更換1/2對應培養(yǎng)液。培養(yǎng)7d后將細胞液混勻取出置于15mL離心管中，1500rpm離心15min后分別加入CD₃FITC-H、CD₅₆PE-H單抗各10μl，室溫避光孵育30min。流式細胞儀(Flow cytometry)檢測細胞，Cellquest軟件獲取分析細胞。30μg/mL人參多糖誘導后的細胞雙陽性為0.63％(圖2A)，為對照0.35％(圖2B)的1.8倍。細胞經(jīng)過多糖誘導培養(yǎng)后，具有CD3﹢單陽性的細胞明顯增加；人參多糖誘導后為51.65％，為對照40.48％的1.27倍。

實施例4在最優(yōu)濃度誘導下的CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力測定。

在人參多糖的最優(yōu)濃度下，用人參多糖培養(yǎng)細胞，將培養(yǎng)瓶中已培養(yǎng)7d的細胞吸出置于15mL離心管中，離心棄去上清液，用0.9％NaCl洗脫CIK細胞兩次后，加0.8mL RPMI 1640培養(yǎng)基，計數(shù)，得出細胞濃度。棄去A549腫瘤細胞培養(yǎng)瓶中的上清液，加1.5mL胰酶漂洗并棄去漂洗液，再加入1mL胰酶，37℃，3min。輕拍后加5mL預熱的RPMI 1640終止反應。1200rpm，5min離心收集腫瘤細胞，洗脫兩次后，加10mL培養(yǎng)液，計數(shù)，得出細胞濃度。稀釋細胞濃度，并按細胞個數(shù)比等體積加液(CIK細胞液與A549腫瘤細胞液各100μl，共200μl一孔)。陽性對照：100μl腫瘤細胞稀釋液+100μlCIK細胞液，陰性對照：200μlCIK細胞液。加好液后，放于37度，CO2濃度5％培養(yǎng)12小時。2小時后取出孔板，將原各孔中200μl液體吸去并用200μl RPMI 1640培養(yǎng)基清洗5次。各孔平均加入100ul含10％CCK8的RPMI 1640培養(yǎng)基對細胞進行染色，放于37度，CO2濃度5％中培養(yǎng)4小時。取出孔板，拿到酶標儀上檢測，得出人參多糖誘導的CIK細胞對腫瘤細胞殺傷力結果。結果如圖3所示，在靶效比E：T＝10：1時，人參多糖誘導后的CIK細胞對A549腫瘤細胞的殺傷力達到97.4％，明顯高于對照。