一種高表達(dá)cxcr5的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備和用圖
【專利摘要】一種高表達(dá)CXCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)及其制備方法和用途。過表達(dá)CXCR5，可以使MSCCXCR5在體內(nèi)定向遷移至炎癥區(qū)域發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的能力，而不是隨機(jī)散亂分布在體內(nèi)各個部位。用這種間充質(zhì)干細(xì)胞治療疾病將更有靶向性和有效性，將有效提高M(jìn)SC的治療效果。
【專利說明】
-種高表達(dá)CXCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及一種高表達(dá)CXCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSC)及 其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是最早從骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種非造 血類的干細(xì)胞(Friedenstein，A.J.，et al，1974)，參與構(gòu)成骨髓造血微環(huán)境，對造血干細(xì) 胞的增殖與分化具有明顯支持作用(Mendez-Fe;rre;r，S.，et al. ,2010) eMSC廣泛分布于全 身各個組織和器官，除骨髓外，還可W從廝帶，廝血，牙銀，骨骼肌等分離得到。MSC還有向成 骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，屯、肌細(xì)胞等分化的能力。MSC缺乏特異性標(biāo)志物，主要表達(dá) 〔029、〔044、〔073、〔090、〔0105和〔0166等間質(zhì)標(biāo)志物，不表達(dá)〔01化、〔014、〔019、〔0：34、〔045 等造血相關(guān)標(biāo)志物;不表達(dá)或低表達(dá)HLA-I類分子，不表達(dá)HLA-II類分子。
[0003] 近年來MSC獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用引起了越來越多關(guān)注。體外實(shí)驗(yàn)表明，MSC可抑制 特異性刺激的混合淋己細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中或者非特異性的絲裂原植物凝集素 (PHA)刺激誘 導(dǎo)的T淋己細(xì)胞的增殖(Di Nicola，M.，et al.，2002)dMSC能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的擴(kuò) 增，抑制殺傷性Τ細(xì)胞的細(xì)胞毒功能(Aggarwal，S.，et al.，2005) dMSC能影響B(tài)細(xì)胞的活化、 增殖、趨化W及其抗體的產(chǎn)生(Corcione，A.，et al.，2006)dMSC能抑制DC的生成，增殖，阻 斷DC的成熟和分化，從而減弱DC的抗原提成能力(Beyth，S.，et al.，2005)eMSC能強(qiáng)烈抑制 IL-2活化的NK細(xì)胞的增殖，細(xì)胞因子的分泌及其殺傷功能。MSC調(diào)控免疫細(xì)胞的機(jī)制尚不完 全清楚，其免疫調(diào)節(jié)作用不受血K限制，存在直接接觸作用方式W及分泌可溶性因子轉(zhuǎn)化生 長因子-β(transforming growth facto;r-0,TGF-0)、白細(xì)胞介素 -10(interle址in-10,化- 10)、前列腺素 E2(p;rostaglandin E2,PGE2)、肝細(xì)胞成長因子化epatoc}fte growth factor ,HGF)、腫瘤壞死因子α刺激基因 -6(tumornecrosis factor-astimulated gene-6, TSG-6)等發(fā)揮作用(Gebler，A.，0.Zabel and B.Seliger，2012)。由于MSC易于分離擴(kuò)增，免 疫原性低，具有旁分泌和免疫調(diào)節(jié)的功能，所WMSC在細(xì)胞治療方面應(yīng)用前景廣闊。目前間 質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn)有600多項(xiàng)(April 2015，clinicaltrials.gov)，適應(yīng)癥包括自身免疫 病、移植排斥、骨/軟骨疾病、屯、血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
【申請人】在前期工作中治療慢性 移植物抗宿主病的有效性證實(shí)了MSC對疾病的免疫調(diào)節(jié)功能(Peng,Y.，et al. ,2015)。據(jù)報 道，MSC還可用于治療多發(fā)性硬化癥化i，J.F.，etal.，2014)，潰瘍性結(jié)腸炎(Duijvestein， Μ.,et al.,2010)，糖尿病(Holmes,et al.,2014)等。
[0004] 然而我們發(fā)現(xiàn)，在臨床治療中，效果有時并不理想。有些研究者認(rèn)為雖然MSC在體 夕巧很好的免疫調(diào)節(jié)功能，例如能夠有效抑制T細(xì)胞增殖等，但靜脈輸注的MSC并不能完全 治療小鼠 cGV皿(Sudres M.et al. ,2006);另一些研究者稱MSC在治療肝臟損傷時，發(fā)現(xiàn)聚 集在損傷部位的MSC數(shù)量少，并認(rèn)為運(yùn)可能是MSC治療效果局限的主要原因 （Gao J. etc, 2001);還有研究者通過示蹤發(fā)現(xiàn)MSC進(jìn)入體內(nèi)后散亂地分布在各個器官，例如肺、肝、骨髓 等等(Paul Lin.et al. ,2013)，相當(dāng)于MSC在體內(nèi)"被稀釋"，真正到達(dá)關(guān)鍵部位發(fā)揮作用的 MSC數(shù)量并不可觀，那么發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)功能也將大打折扣。所W，MSC在臨床治療中面臨的 主要問題是MSC輸注后在體內(nèi)無序地分布。
[0005] 趨化因子在疾病發(fā)生發(fā)展的過程中至關(guān)重要，而MSC表面表達(dá)的趨化因子受體有 很多，如CCR1，CCR4，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CXCR4，CXCR5，CXCR6，CX3CR等，不僅本身表達(dá) 量低，并且在擴(kuò)增傳代之后，MSC幾乎不再表達(dá)運(yùn)些受體(Sarkar，D.，et al.，2011)。而骨髓 中MSC的含量僅僅占0.001-0.01%，健康捐獻(xiàn)者一次捐獻(xiàn)的骨髓分離出原代MSC數(shù)量有限， 一般治療cGVHD病人一次輸注的細(xì)胞量為每公斤體重0.4-9 X106個，一次治療所需的細(xì)胞 量就達(dá)約0.2-4.5 X 108個。所W，MSC體外大量擴(kuò)增是目前為達(dá)到臨床應(yīng)用中所需的細(xì)胞量 的基本方法。運(yùn)就可能由于MSC受體表達(dá)的丟失，造成治療的不穩(wěn)定性。
[0006] 現(xiàn)在很多研究工作者將提高M(jìn)SC治療的祀向性作為研究方向：如用病毒轉(zhuǎn)染的方 法過表達(dá)CXCR4,促進(jìn)MSCs向大腦損傷部位趨化(Wang，Z.，et al. ,2015);用IGF-1預(yù)處理 MSCs，增加 MSCs上CXCR4的表達(dá)(Xinaris，C.，et al. ,2013);通過增加粘附分子PS化-1和 SLeX，增強(qiáng)MSCs向炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力化evy，0.，et al.，2013);將MSC上CD44分子轉(zhuǎn) 化為E-selectin/X-selectin，增加 MSCs向骨髓的趨化（Sackstein,R. ,et al. ,2013)等等。
[0007] 趨化因子CX化13在炎癥反應(yīng)中起到重要作用，例如在自身免疫性滑膜炎的炎性滑 膜液中檢測到CX化13的mRNA高表達(dá)(William H，et al. ,2013);在小鼠回腸炎的疾病模型 中，也發(fā)現(xiàn)了在炎癥部位高表達(dá)趨化因子CXCL13(A Viej〇-Borbolla，et al.，2010);在神 經(jīng)萊姆病中，腦脊液中的CX化13含量甚至可W作為急性發(fā)作期的高敏感性的一個指標(biāo) 化atie Kingwell ,2011)。我們在小鼠接觸性超敏反應(yīng)（contact hypersensitivity,C服） 模型中也發(fā)現(xiàn)了隨著局部耳朵炎癥的發(fā)展，CXCL13呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，并且運(yùn)種模型發(fā) 病快，炎癥反應(yīng)局限，利于觀察結(jié)果。于是我們利用運(yùn)一特點(diǎn)，構(gòu)建了趨化因子CXCL13相對 應(yīng)的受體CXCR5的質(zhì)粒，利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，使MSC表達(dá)受體CXCR5，并在疾病高峰期輸 注過表達(dá)CXCR5的MSC，通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CXCR5的MSC治療效果顯著，在體內(nèi)時能夠 定向遷移至病損部位，大大提高M(jìn)SC在體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明通過構(gòu)建表達(dá)CXCR5的質(zhì)粒，利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，使MSC過表達(dá)受體 CXCR5,使MSC由靜脈輸注入體內(nèi)時能夠定向遷移至病損部位，而不是無序地分散在體內(nèi)各 個部位，大大提高M(jìn)SC在體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的效率。
[0009] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 提供一種高表達(dá)巧CR5的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011] -種所述間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療下列疾病之一的藥物中的用途：自身免疫病、 移植排斥、骨/軟骨疾病、屯、血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。
[0012] -種包含所述間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物。
[0013] -種制備所述間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0014] 1)收集健康個體外周血中單個核細(xì)胞并培養(yǎng)W獲得獲得外周血單個核細(xì)胞；
[001引2)提取外周血單個核細(xì)胞RNA;
[0016] 3)逆轉(zhuǎn)錄；
[0017] 4)PCR反應(yīng)和回收CXCR5cDNA片段；
[0018] 5)克隆與轉(zhuǎn)化；
[0019] 6)構(gòu)建質(zhì)粒；
[0020] 7)病毒包裝；
[0021] 8)病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0022] 進(jìn)一步，步驟4)中引物為：
[0023] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[0024] R：CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCAo
[0025] 進(jìn)一步，步驟6)中引物為
[0026] F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
[00打]R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA。 [00%] 進(jìn)一步，步驟6)中質(zhì)粒結(jié)構(gòu)為：
[00 巧]pF i na1/PGK-pur0-EF1α-CXCR5-1RES-EGFP。
[0030] 進(jìn)一步，步驟7)中病毒為慢病毒。
[0031] 一種CXCR5引物序列：
[0032] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[00；33 ] R: CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA;
[0034] 用于制備所述的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0035] 一種PCR引物序列：
[00；36] F-attBl :GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
[00；37] R-attB2 :GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA
[0038] 用于制備所述的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0039] 本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著地進(jìn)步，具體地說，在不影響 MSC本身表型、分化能力及免疫調(diào)節(jié)能力的基礎(chǔ)上，過表達(dá)CXCR5，可W使MSC?Ks在體內(nèi)定向 遷移至炎癥部位。與普通MSC不同的是，MSC^Ks能夠快速有效地遷移至病損部位發(fā)揮免疫調(diào) 節(jié)的能力，而不是無目的地隨機(jī)分布在體內(nèi)各個部位。
[0040] 治療自身免疫性疾病的優(yōu)化治療方法，將CXCR5基因修飾MSC治療疾病將更有祀向 性和有效性，顯著提高M(jìn)SC的治療效果。
【附圖說明】
[0041 ]圖 1 :MSC?R5 和 MSCEGfp 表達(dá) CXCR5圖
[0042] 圖2:致敏后右偵陌朵(致敏)巧化13的mRNA隨時間變化圖
[0043] 圖3:致敏后右側(cè)耳朵(致敏)水腫程度隨時間變化圖
[0044] 圖4: C服小鼠造模與治療模式圖
[0045] 圖5:治療后小鼠耳朵水腫程度折線圖
[0046] 圖6:切片染色顯示結(jié)果
[0047] 圖7:ΜΚ)活性柱圖 [004引圖8:化ISA結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0049]為了使本發(fā)明的技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明 進(jìn)行詳細(xì)描述。
[(K)加]實(shí)施例1
[0051 ] 1、MSC培養(yǎng)與表型鑒定：
[0化2] 取健康志愿者骨髓20ml，與1XPBS按1:1稀釋，采用Ficoll-Paque淋己分離液用密 度梯度離屯、法從骨髓中分離出單個核細(xì)胞（200化pm，30min)，收集到的單個核細(xì)胞按1 X lOVcm2密度接種到75cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。用kDMBl培養(yǎng)基在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)3天 后，去除懸浮細(xì)胞，換液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80 %密度后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗涂2次，用 0.125%膜酶消化l-2min，傳代比例為1: 3dMSC由健康供者捐獻(xiàn)的骨髓分離得到，臨床用MSC 的分離、擴(kuò)增、凍存、復(fù)蘇等均在符合GMP(good manu化cturing practice)標(biāo)準(zhǔn)的條件下進(jìn) 行。在倒置顯微鏡下每日觀察原代和傳代細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征，拍片記錄。取體外培 養(yǎng)的MSCs消化成單細(xì)胞懸液，用含0.1 %BSA+0.05%化化的PBS(pH 7.4)洗涂一遍，棄去上 清，調(diào)整細(xì)胞密度為lOVml于流式管，采用流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、 CD105、CD166標(biāo)記MSCs，充分震蕩混勻，4°C，避光解育30min，然后用含0.1%BSA+0.05% 船化的?85(抑7.4)洗涂兩遍，^去除多余抗體;棄上清，用20〇1111%?。4重懸細(xì)胞，流式檢 測MSCs細(xì)胞表型（CD29+，CD34-，CD44+，CD45-，CD73+，CD90+，CD 105+，CD 166+)，證明體外培養(yǎng)對 MSCs細(xì)胞表型無影響。
[0化3]將P2代細(xì)胞傳至六孔板，長至60 %左右待用。
[0054] 2、外周血單個核細(xì)胞的獲?。?br>[0055] 取健康志愿者新鮮外周血20ml，用1XPBS按1:1稀釋，采用Ficoll-Paque淋己分離 液通過密度梯度離屯、法分離，收集全部白膜層單個核細(xì)胞，用無菌PBS按1:4稀釋。200化pm， 離屯、lOmin，棄上清。再加足量PBS洗涂兩次。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，即獲得人外 周血單個核細(xì)胞(PBMC)。
[0化6] 3、Trizol法提取外周血單個核細(xì)胞RNA:
[0057]將獲得的人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)加入1ml化izol溶液，吹打混勻，使細(xì)胞充 分裂解，靜置5min;加入20化1氯仿，劇烈振蕩混勻20s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置 15min ;4°C下，12000g離屯、15min，可見分為Ξ層，RNA在上層水相，小屯、移至另一個新的 RNase free EP管;加入0.5ml異丙醇，輕柔地充分混勻，于室溫靜置lOmin，沉淀RNA; 4°C下， 12000g離屯、lOmin，收集RNA沉淀，去上清；用75%乙醇洗管壁兩次，超凈臺風(fēng)干;加入5〇41 DEPC水溶解沉淀，Nano化op超微量分光光度計測量濃度。
[0化引 4、逆轉(zhuǎn)錄：
[0059] 去除基因組DNA:RNA(lyg)+DNase I(lyl)+Buffer 面ase I with MgCl2(lyl) + DEPC 水，10μ1 體系，37°C 解育 30min;加入邸 了4(化1)，65°(：解育1〇111111;加入011旨〇((11')(化1)， 65°C解育lOmin;最終，加入5 X Reaction Buffθ；Γ(5μ1)，RNase-R;Lbonuclease Inhibitor!； 1 μ1)，10πιΜ dNTP Mix(2yl)，M-MLV RT(lyl)，R化se Free Water共25μ1 體系，42°C解育 60min，收取cDNA產(chǎn)物。
[0060] 5、PCR反應(yīng)和回收CXCRScDNA片段：
[0061 ] PCR反應(yīng)：2XStar mix(含Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mgh、反應(yīng)緩沖液和穩(wěn)定劑 等）10μ1，DEPC水7μ1，上游引物1μ1，下游引物化1，cDNAlyl，總體系20ul; CXCR5片段大小 1119bp。膠回收:鋒利手術(shù)刀切割目的片段條帶，使用瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒切膠回收 PCR目的產(chǎn)物CXCR5片段。
[0062] CXCR5引物序列：
[0063] F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
[0064] R：CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA；
[00化]6、TA克隆與轉(zhuǎn)化：
[0066] TA克?。后w系：PMD19-T Vector*l(化l)，CXCR5cDNA(4yl)，Solution Ι(5μ1)，16 °C，2h，獲得ΤΑ克隆產(chǎn)物。
[0067] 轉(zhuǎn)化:-80°C取出感受態(tài)細(xì)胞D冊α，冰上溶解5min; 3化1感受態(tài)巧μΙΤΑ克隆產(chǎn)物，輕 彈，置于冰上30min;42°C熱擊45s~Imin，立即置于冰上2min;加 37°C解育的LB600yl，在37 °C，150化pm的搖床上解育化；離屯、3500巧m，4~5min，倒上清，重懸，將10化1轉(zhuǎn)化物涂在預(yù) 熱的含有50μg/ml Amp的LB平板上，37°C解育過夜;挑出3~5個菌落進(jìn)行PCR檢測和測序。 [006引 7、6曰16*曰戶法構(gòu)建003?5-11?65斗6。?基因的質(zhì)粒
[0069] ① PCR 擴(kuò)增 attB-PCR 產(chǎn)物
[0070] 10XLA PCR Buffer(Mg2+plus)：3yl; 2???Μ dNTP Mix 3μΙ,
[0071] ΙΟμΜ上游引物 1.5μ1； ΙΟμΜ下游引物 1.5μ1; TaKaRa LA Taq 1 μ1:;
[0072] Template plasmid 1 Op呂-1 μ呂； 補(bǔ)加水至總體狼30以心；
[0073] 所用引物序列：
[0074] F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAA CGCTGG [00巧]R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAG AGAGGTGGCA
[0076] ②PCR產(chǎn)物回收
[0077] 使用瓊脂糖凝膠DM回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物 [007引③BP重組反應(yīng)
[0079] 室溫混合W下成分：
[0080] CXCR5的attB-PCR產(chǎn)物 7.5-75ng;
[0081 ] PD0NR221 質(zhì)粒 75ng;
[0082] 補(bǔ)加洗脫緩沖液邸至總體積4.化1;
[0083] 冰上溶解BP Clonase II enzyme mix 2分鐘，短暫縱滿2次；
[0084] 加入W上反應(yīng)樣品中加入化L BP Clonase II enz;yme mix,短暫縱滿混勻2次，短 暫離屯、；
[0085] 25Γ解育1小時；
[0086] 加入0.5化蛋白酶K中止反應(yīng)，37 °C解育10分鐘；
[0087] -20°C保存或取化L進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[008引④BP反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0089] 過程同上。
[0090] 篩選出重組子進(jìn)行PCR檢測和測序。
[0091] ⑤LR重組反應(yīng)
[0092] 小提質(zhì)粒
[0093] 測質(zhì)粒濃度
[0094] 室溫混合W下質(zhì)粒： pUp EF-la 5 fmoles pDOWN CXC民5 5掛的1巧
[0095] pTail IRES-EGFP 5 fmoles pDes pLV.Des3d.P/puiO 10 fmoles
[0096] 補(bǔ)加 1 XtE buffer(pH 8.0)至4.^iL，混勻。
[0097] 冰上溶解LR Clonase? II Plus Enzyme Mix 2分鐘，短暫縱滿2次；
[0098] 加入W上反應(yīng)樣品中加入化L LR Clonase? II Plus Enzyme Mix,短暫縱滿混勻 2次，短暫離屯、；
[0099] 室溫解育16小時；
[0100] 加入化L蛋白酶K中止反應(yīng)，37°C解育10分鐘；
[0101] ⑥LR反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0102] 轉(zhuǎn)化步驟同上；
[0103] 構(gòu)建成功的慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如下：
[0104] pFinal/PGK-pur〇-EFla-CXCR5-IRES-EGFP
[0105] 對照組質(zhì)粒：
[0106] pFinal/PGK-puro-EFla-EGFP
[0107] 8、慢病毒包裝
[0108] 將293T細(xì)胞接種在10cm皿中，待其90%滿的時候換新鮮不含雙抗的293新鮮培養(yǎng) 液，放入培養(yǎng)箱中；
[0109] 2小時后將構(gòu)建成功的過表達(dá)CXCR5基因的載體質(zhì)粒與慢病毒載體質(zhì)?；旌霞尤?無血清的0PTI-MEM培養(yǎng)基中，靜置5分鐘后加入X-化eme HP，顛倒混勻后靜置15分鐘，加入 293T細(xì)胞；
[0110] 12-16小時左右換液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時-48小時左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液；
[0111] 慢病毒超速離屯、濃縮，棄上清，溶于1 XPBS后，分裝保存于-80°C。
[0112] 9、慢病毒轉(zhuǎn)染MSC
[0113] 將P2代的MSC傳至六孔板，長至60 %左右待用；
[0114] 感染前換新鮮培養(yǎng)液L-DMEM培養(yǎng)基，取出濃縮病毒加入上清并加基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑 polybrene(聚凝胺），12-16小時后更換新鮮培養(yǎng)基。
[0115] 10、檢測巧CR5mRNA和蛋白的表達(dá)情況：
[0116] 72小時后收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀分選純化得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系并擴(kuò)增；
[0117] 實(shí)時巧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-PCR)檢測感染后的MSC表達(dá) CXCR5mRNA 的含量：
[0118] ①提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄:步驟參考本部分3、4; 感反應(yīng)體系：cDNA 1μ1;
[0119] SYB民 mix ]0μΙ; ΙΟμΜ上游引物 1μ1; ΙΟμΜ下游引物 1μ1,
[0120] d 地 2〇 7μ1;
[0121] 總體系 20μ1;
[0122] 反應(yīng)條件:95°C10min;3 步法，40 個循環(huán):95°(：153,6〇1：3〇3,72°(：153;融解曲線:55 °(：-95°(：，每分鐘讀1次。
[0123] 使用引物
[0124] GATOH:
[01 巧]F:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC [01 %] R:GAAGATGGTGATGGGATTTC
[0127] CXCR5:
[0128] F:CCTTGAAGGAGGCCATGAG [01 巧]R:TAACGCTGGAAATGGACCTC
[0130] Western Blot檢測感染后的MSC表達(dá)巧CR5的蛋白水平：
[OU1] ①提取蛋白：取培養(yǎng)中的過表達(dá)CXCR5的MSC(MSC?5)和對照組msC(MSCEgfp)，置于 冰上，去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗兩遍后，加入含5 %DTT的1 X SDS上樣緩沖液（62.5mM 化13-肥1(9冊.8)，2%(*八）505，10%邑17。6'〇1，50111101'1'，0.1%(*八）漠酪蘭），迅速用11111 的移液槍來回吹打(約10次），充分裂解細(xì)胞。吹打后吸取液體放入1.5mL的化pendorf離屯、 管內(nèi)，4 °C超聲破碎3次，每次1秒；100°C煮沸5分鐘，置4 °C冷卻并于4 °C W 15000g離屯、5分鐘， 準(zhǔn)備電泳或-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0132] ②凝膠電泳分離樣品：變性聚丙締酷胺凝膠（denatured polyacrylamide gel， SDS-PAGE):加分離膠4. ImL，用去離子水封層，待出現(xiàn)明顯界面后，傾掉水封層，加入已經(jīng)配 制好的濃縮膠至短玻璃塊的頂端。插梳，當(dāng)膠面出現(xiàn)不規(guī)則形狀時，表明膠已經(jīng)聚合好，可 W拔梳、上樣。
[0133] 按順序，每泳道加入100°C煮沸5分鐘的樣本15化，于SDS電泳緩沖液中W恒壓120V 電泳約45分鐘。
[0134] ③轉(zhuǎn)膜:在電泳的同時，把轉(zhuǎn)膜所需要的材料，如海綿、濾紙、PVDF膜等浸泡在轉(zhuǎn)膜 緩沖液(25mM Tris base，0.2M glycine，20%methanol P冊.5)中。電泳結(jié)束后，取下凝膠， 去掉上面的濃縮膠部分。把膠放在轉(zhuǎn)膜液中平衡15~30分鐘，W去除膠表面附著的SDS。然 后開始裝轉(zhuǎn)膜夾層盒，從負(fù)極到正極按照海綿、一層濾紙、凝膠、PVD刊莫、一層濾紙和海綿的 順序裝置夾層盒，固定之后放于轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，PVDF膜面朝著正極方向。將夾層盒和冰盒放置于 轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，注入600mL轉(zhuǎn)移緩沖液，恒流200mA2小時。
[0135] ④抗原抗體反應(yīng)：
[0136] 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下PVDF膜，在25血的TBS(50mM Tris-肥1 pH7.4，150mM化C1)中洗 10分鐘，然后轉(zhuǎn)至20mL封閉液[含5%脫脂奶的lXTBST(0.05%Tween-20inTBS)]中，室溫 下振蕩封閉1小時，加入相應(yīng)的用含5%(w/v)脫脂奶稀釋的一抗稀釋液。4°C溫和振蕩過夜。 次日用1 XTBST洗膜3次，每次5分鐘，然后加入用封閉液稀釋的由辣根過氧化酶 化orseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗（1: 2000) 15mL，室溫振蕩 1小時。之后用 1 X TBST洗膜3次，每次10分鐘，于暗房內(nèi)顯影、定影:取E化試劑盒A、B液配成工作液均勻涂于 PVDF膜表面，解育1分鐘后，盡量去除膜表面的反應(yīng)殘液，在X-光感光盒內(nèi)用塑料保鮮膜固 定膜，放入X-光膠片進(jìn)行適度曝光，取出X-光膠片于顯影液中反應(yīng)1分鐘，把顯影好的膠片 在清水中漂洗幾次，再于定影液中反應(yīng)1分鐘，然后清水沖洗，驚片。
[0137] 結(jié)果可見附圖1，MSC?K嗦達(dá)蛋白CXCR5，MSCEGfp不表達(dá)CXCR5，二者都表達(dá)綠色巧 光蛋白EGFP。
[013引實(shí)施例2
[0139] DNFB誘導(dǎo)的小鼠接觸性超敏反應(yīng)
[0140] DNFB(2,4-dini1:;r〇-1-f luo;robenzene，2,4-二硝基-1-氣苯)誘導(dǎo)的小鼠接觸性超 敏反應(yīng)模型造模，具體如下：
[0141] 1.6-8周雄性 BALB/c小鼠，16-18g，SPF 環(huán)境飼養(yǎng)；
[0142] 2.試劑配制：
[0143] ① DNFB預(yù)致敏溶液：
[0144] 配制混合液(丙酬:橄攬油4:1)，劇烈震蕩混勻；
[0145] 配制預(yù)致敏混合液：用混合液配制0.5 %的DWB混合液，即預(yù)致敏混合液。②DNFB 致敏溶液:用混合液配制0.2 %的DNFB混合液，即致敏混合液。
[0146] 3.預(yù)致敏:第1天，用電動剌刀在小鼠背部近頭部皮膚處刮出1.5X1.5cm區(qū)域，將 2化10.5%的DNFB預(yù)致敏混合液涂抹在被刮皮膚處，處理后常規(guī)飼養(yǎng)。
[0147] 4.致敏:第5天，用0.2 %的DNFB混合液涂抹小鼠耳朵，耳朵兩面各10μ1。
[014引 5.將動物分為4組，每組8只：
[0149] ①空白對照（Control)組；
[0150] ②模型（C服)組；
[0151] ③ MSCEGfp 治療（CHS+MSCEGfp)組；
[0152] ④msc?R日治療（C服+msc?R日）組。
[01對造模后第2天，C服+MSCEGFP組靜脈注射MSCEgfp，1 X 106個cells/只；
[0154] C 服+MSC?R 日組靜脈注射 MSC?R 日，1 X 106 個 cells/只。
[0155] 6.記錄治療后第1，2,3,4,5天小鼠耳朵厚度，用千分尺測量。
[0156] 結(jié)果顯示：
[0157] 1、致敏后，小鼠右耳(致敏)在發(fā)生炎癥后趨化因子CX化13的mRNA不斷升高（附圖 2 )，厚度逐漸增厚，水腫程度加深(附圖3)
[0158] 2、見附圖4，化廠4天，用20μ10.5 %的DNFB預(yù)致敏混合液涂抹在背部，Day 0天，小 鼠右側(cè)耳朵致敏，致敏后第2天，即Day 2天，當(dāng)CX化13分泌增多，小鼠尾靜脈注射MSC進(jìn)行治 療：
[0159] C 服+MSCEGFP 組靜脈注射 MSCEGfp，1 X 1〇6 個 cells/只；
[0160] C 服+MSC?R 日組靜脈注射 MSC?R 日，1 X 106 個 cells/只；
[0161] Control 組注射 PBS。
[0162] 3、記錄治療后第1，2,3,4,5天小鼠耳朵厚度，用千分尺測量耳朵外緣厚度，每天由 同一操作者同一時間測量Ξ次取均值，結(jié)果顯示在附圖5中，C服+MSC?Ks組小鼠耳朵厚度下 降最快，治療效果最好，邸S+MSCEgfp組治療效果在CHS組和CHS+MSC?K5組之間。
[0163] 4、切片染色觀察小鼠耳朵MSC的數(shù)量：
[0164] 冰凍切片:將小鼠斷頸處死，取各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵，取10倍耳朵體積的多聚甲醒固 定化，轉(zhuǎn)移至30 %薦糖脫水，4 °C過夜，0CT固定，冰凍切片機(jī)-20°C切片，7皿;免疫巧光染色： 烘片，60°C，30分鐘，撕去0CT，0.01M的PBS洗脫5分鐘X 3次，用免疫組化筆劃線圈起有組織 部分，滴加山羊血清，封閉30分鐘，加一抗，4 °C解育過夜，室溫放置30分鐘，0.01M的PBS洗脫 5分鐘X 3次，加二抗，30分鐘，0.01M的PBS洗脫5分鐘X 3次，力陽API，10分鐘，0.01M的PBS洗 脫5分鐘X 3次，封片。
[0165] 從附圖6可見治療后MSC?5組耳朵厚度明顯低于MSCEGfp組耳朵厚度，更重要的是 MSCGxgks組耳朵中MSC的數(shù)量明顯多于MSCEgfp組，證明MSC?Ks能夠祀向地遷移至炎癥部位。
[0166] 5、局部炎癥細(xì)胞的浸潤-髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MP0)檢測，髓過氧化物 酶又稱過氧化物酶，是血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過氧化物酶超家族成員之一。 髓過氧化物酶是中性粒細(xì)胞所特有，即使在有強(qiáng)吞隧作用的巨隧細(xì)胞中也極少或完全沒有 運(yùn)種酶。在細(xì)胞化學(xué)上，一般將運(yùn)種髓過氧化物酶作為中性粒細(xì)胞得到的標(biāo)志，每個細(xì)胞所 含的酶的量是一定的，約占細(xì)胞干重的5%，該酶具有使過氧化氨還原的能力，利用運(yùn)一特 點(diǎn)可W分析酶的活力，并定量測定中性粒細(xì)胞的數(shù)目。
[0167] MP0檢測:準(zhǔn)備待測樣品-各組小鼠耳朵，稱重，W試劑盒中相應(yīng)試劑為勻漿介質(zhì)， 按重量體積比為1:19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，然后按照試劑盒步驟檢測MP0活 性，結(jié)果如附圖7，C服+MSC?K5組MP0活性明顯低于C服+MSCEGFP組和C服組。
[016引結(jié)果顯示MSC?KS組中性粒細(xì)胞的浸潤明顯低于MSCEGfp組，證明MSCGXgks能夠祀向地 遷移至炎癥部位，發(fā)揮免疫功能，減輕炎性浸潤。
[0169] 6、局部炎癥因子的分泌
[0170] ELISA檢測：96孔化ISA板，用1 Xwashing buffer洗涂2次，加標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品， lOOul/孔，室溫避光解育化，棄液體，用1 Xwashing buffer洗涂5次，加檢測抗體lOOul/孔， 室溫避光解育化，棄液體，用1 Xwashing buffer洗涂5次，去除多余抗體，加酶結(jié)合物工作 液lOOul/孔，室溫避光解育30min，棄液體，用IX washing buffer洗涂5次，加顯示底物 50ul/孔，避光解育20min，加終止液50ul/孔，混勻后酶標(biāo)儀檢測450nm 0D值。
[0171] 見附圖8，結(jié)果顯示，顯示CHS+MSC?K5組局部的炎性因子TN化和IFN 丫的浸潤明顯 低于CHS+MSCEgfp組和CHS組，證明MSC?K5能夠祀向地遷移至炎癥部位，發(fā)揮免疫功能，減輕 炎性反應(yīng)。
[0172] 上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說 明，它們并非用W限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式 或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高表達(dá)CXCR5的間充質(zhì)干細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療下列疾病之一的藥物中的用途：自身免 疫病、移植排斥、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、糖尿病。3. -種包含如權(quán)利要求1所述間充質(zhì)干細(xì)胞的藥物。4. 一種制備如權(quán)利要求1所述間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟： 1) 收集健康個體外周血中單個核細(xì)胞并培養(yǎng)以獲得外周血單個核細(xì)胞； 2) 提取外周血單個核細(xì)胞RNA; 3) 逆轉(zhuǎn)錄； 4. PCR反應(yīng)和回收CXCR5cDNA片段； 5) 克隆與轉(zhuǎn)化； 6) 構(gòu)建質(zhì)粒； 7) 病毒包裝； 8) 病毒轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞。5. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟4)中引物為： F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG， R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇6. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟6)中引物為： F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇7. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟6)中質(zhì)粒結(jié)構(gòu)為： pFinal/PGK-pur〇-EFla-CXCR5-IRES-EGFP〇8. 如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟7)中病毒為慢病毒。9. 一種用于制備如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的CXCR5引物序列： F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG， R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇10. -種用于制備如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的PCR引物序列： F-attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG； R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA 〇
【文檔編號】A61P1/04GK106011074SQ201610420076
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】項(xiàng)鵬, 張小然, 陳小勇
【申請人】中山大學(xué)