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I型干擾素及間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的新用圖

文檔序號:10483726閱讀:716來源:國知局
I型干擾素及間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的新用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及I型干擾素及間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的新用途。首次揭示了I型干擾素可以通過抑制間充質干細胞(MSCs)表達iNOS而使其發(fā)揮抗腫瘤作用,抑制腫瘤生長。本發(fā)明為I型干擾素及MSCs在抗腫瘤中的應用提供了新的重要的機制,提出了新型臨床治療途徑。
【專利說明】
I型干擾素及間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的新用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學領域,更具體地,本發(fā)明涉及I型干擾素及間充質干細胞在制 備抗腫瘤藥物中的新用途。
【背景技術】
[0002] 間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)因其具有的免疫調節(jié)作用在免疫 紊亂性疾病的治療中占有重要地位。更重要的是,MSCs的免疫抑制作用是需要炎癥因子的 刺激。并且,介導MSCs免疫抑制作用的核心分子具有物種差異性,在小鼠 MSCs中是誘導型 一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS),在人 MSCs 中是吲噪胺-2, 3-雙加氧酶。在小鼠 MSCs中,iNOS的產生主要依賴于IFNy和TNFa或IL-1的共同刺 激,其中IFNy是必不可少的。
[0003] 眾所周知,同屬干擾素家族的I型干擾素(IFNa和IFN0 )和II型干擾素 (IFNy ) 與TNF a協(xié)同均能很好地誘導小鼠巨噬細胞表達iNOS。然而,對于MSCs,I型干擾素 IFN a 或IFN0則不能替代IFNy與TNFa組合誘導iNOS的表達。
[0004] 干擾素(Interferon,IFN),是由英國科學家Isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊 膜研究流感病毒干擾現象時首先發(fā)現的,是一種細胞因子,具有抑制細胞分裂、調節(jié)免疫、 抗病毒、抗腫瘤等多種作用。其本質是蛋白質,類型可分為α、β、γ、ω等幾種。
[0005] IFN能誘導細胞對病毒感染產生抗性,它通過干擾病毒基因轉錄或病毒蛋白組分 的翻譯,從而阻止或限制病毒感染,是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品。但是I 型干擾素在臨床應用中,涉及毒副作用大,半衰期短的問題,限制了其應用價值。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供I型干擾素及間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的新用 途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面,提供一種間充質干細胞,所述的間充質干細胞是I型干擾 素預處理的間充質干細胞,或是過表達I型干擾素的間充質干細胞。
[0008] 在一個優(yōu)選例中,所述的預處理包括:
[0009] 將I型干擾素與間充質干細胞相混合,使得I型干擾素的終濃度為200-10000U/ ml ;較佳地為 300-8000U/ml ;更佳地為 500-5000U/ml ;例如 800U/ml,1000U/ml,15000U/ ml,2500U/ml〇
[0010] 在另一優(yōu)選例中,所述的過表達I型干擾素的間充質干細胞中轉化有編碼I型干 擾素的多核苷酸。
[0011] 在另一優(yōu)選例中,所述的I型干擾素選自:IFNa或IFN0 ;或所述的間充質干細 胞是骨髓來源的間充質干細胞,或是臍帶、脂肪、胎盤、牙齦等來源的間充質干細胞。
[0012] 在另一優(yōu)選例中,所述的I型干擾素是IFNa,其氨基酸序列如GenBank登錄號 ΝΡ_034633· 2 所示。
[0013] 在另一優(yōu)選例中,所述的I型干擾素是IFN0,其氨基酸序列如GenBank登錄號 AAA3789L 1 所示。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面,提供所述的間充質干細胞用途,用于制備抑制腫瘤的藥物。
[0015] 在一個優(yōu)選例中,所述的腫瘤是黑色素瘤。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面,提供一種用于抑制腫瘤的藥物組合物,所述的藥物組合物 中包含任一所述的間充質干細胞。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面,提供I型干擾素的用途,用于制備提高間充質干細胞中MHC I表達的組合物;或用于制備降低間充質干細胞的免疫抑制能力(即:調動間充質干細胞發(fā) 揮免疫促進作用)或提高機體抗腫瘤免疫反應的組合物。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面,提供I型干擾素的用途,用于制備抑制間充質干細胞中 STAT1的DNA結合能力的組合物;或用于制備減少間充質干細胞中誘導型一氧化氮合成酶 的表達的組合物。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面,提供前面任一所述的用途,所述的I型干擾素選自:IFNa 或 IFN0。
[0020] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容,對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0021] 圖1、IFNa單獨或與TNFa聯(lián)合作用,不能刺激MSCs的一氧化氮產生。
[0022] (A)骨髓來源的巨噬細胞或 MSCs,用 IFN γ (10ng/ml),TNF a (lOng/ml)或 IFNa (2500U/ml)的各種細胞因子組合刺激24小時后,通過Greiss試劑檢測培養(yǎng)上清中一 氧化氮的含量;Control為PBS。圖中數值為means土SD。
[0023] (B)MSCs 用 IFNy (10ng/ml),IFNa (2500U/ml)或 IFN0 (2500U/ml)刺激 12 小時, 然后通過流式細胞儀檢測MHC I類分子KbDb的表達。數據為3次獨立重復實驗中的1次代 表性結果。
[0024] 圖2、IFN a可以減弱MSCs的免疫抑制作用。
[0025] (A)MSCs與⑶3抗體激活的脾細胞共培養(yǎng),并同時用L-NMMA(lmM)或 IFNa (2500U/ml)處理48小時。培養(yǎng)上清中的一氧化氮通過Greiss法測定,細胞增殖水平 通過3H-TdR摻入法檢測。Control為PBS處理組。
[0026] ⑶不同密度的MSCs與CD3抗體激活的脾細胞(Spl)共培養(yǎng),并同時用 IFNa (2500U/ml)或IFN0 (2500U/ml)處理48小時。細胞增殖水平通過3H-TdR摻入法檢 測。圖中數值為means土SD。數據為2次獨立重復實驗中的1次代表性結果。Control為 PBS處理組。
[0027] 圖3、IFNa可在MSCs中抑制IFNy和TNFa介導的iNOS產生。
[0028] A-C、MSCs 用 IFNy (10ng/ml),TNFa (l〇ng/ml)或 IFNa (2500U/ml)的各種細胞 因子組合刺激24小時后,檢測了 iNOS的mRNA(A)和蛋白表達水平(B左)及上清中一氧化 氮的含量(B右);Control為PBS處理組。圖中數值為means土SD。數據為至少3次獨立 重復實驗中的1次代表性結果。
[0029] 圖4、IFNa不影響絕大多數本發(fā)明人所檢測的細胞因子、趨化因子等的表達。 MSCs 用 IFNy(10ng/ml)和 TNFa (lOng/ml)或 IFNy(10ng/ml)、TNFa (lOng/ml)和 IFN a (2500U/ml)處理24小時,上清通過Bio-Plex檢測;Control為PBS處理組。圖中數 值為means土SD。數據為至少2次獨立重復實驗中的1次代表性結果。每列圖下方的橫坐 標適用于該列所有圖作為橫坐標。
[0030] 圖5、IFNa處理不影響MSCs的IFNy受體表達。
[0031] (A)MSCs 用 IFNy (10ng/ml)和 TNFa (l〇ng/ml)或 IFNy (10ng/ml)、TNFa (l〇ng/ ml)和IFN a (2500U/ml)處理24小時。收集的總RNA用Affymetrix公司的小鼠 4302. 0表 達譜芯片檢測;Control為PBS處理組。左圖縱坐標適用于該行所有圖作為縱坐標。
[0032] (B)MSCs 用 IFNy (10ng/ml)和 TNFa (l〇ng/ml)或 IFNy (10ng/ml)、TNFa (l〇ng/ ml)和IFN a (2500U/ml)處理后,通過流式細胞儀檢測IFN γ受體的表達水平。圖中數值為 means 土 SEM ;Control 為 PBS 處理組。
[0033] 圖6、IFNa抑制MSCs中STAT1的結合活性。
[0034] (A)MSCs 用各種細胞因子(TNFa (l〇ng/ml)、IFNy (10ng/ml)、IFNa (2500U/ml)) 處理24小時后收集總蛋白。STAT1和p65通過與連接了各自結合位點寡核苷酸序列的瓊脂 糖微珠孵育并富集,然后通過western blotting檢測。
[0035] (B)MSCs先用STAT1轉錄活性的報告質粒-2XSIE熒光素酶質粒轉染,然后用各種 細胞因子及其組合處理,最后在不同的時間點用熒光素酶檢測試劑盒檢測STAT1的轉錄活 性。左圖縱坐標適用于該行所有圖作為縱坐標。
[0036] (C)MSCs 用各種細胞因子(TNFa (l〇ng/ml)、IFNy (10ng/ml)、IFNa (2500U/ml)) 組合處理,在不同時間點分別檢測IL-6和iNOS的mRNA水平。圖中數值為means土SEM。數 據為3次獨立重復實驗中的1次代表性結果。
[0037] 圖7、IFNa預處理的MSCs在體內顯著地抑制了小鼠黑色素瘤的生長。
[0038] (A) B16-F0黑色素瘤細胞(1 X 106/25 μ 1)與IFN a (〇· 25 μ g/g小鼠體重)處理的 MSCs、MSC-GFP或MSC-IFNa (IX 1〇6/25 μ 1)共同注射到C57BL/6小鼠的腿部肌肉。12天 后,從處死的小鼠腿部剝離腫瘤并稱重。
[0039] (B)MSCs 先用 IFNa (2500U/ml)預處理(IFNa primed MSC) 24 小時,然后用 Α 中的 方法與B16-F0黑色素瘤細胞共同注射到C57BL/6小鼠的腿部肌肉。每隔3天往腫瘤部位 注射用IFNa預處理24小時的MSCs(2X106)。14天后,從處死的小鼠腿部剝離腫瘤并稱 重。圖中數值為means土SEM。數據為2次獨立重復實驗中的1次代表性結果。
【具體實施方式】
[0040] 本發(fā)明人經過深入的研究,首次揭示了 I型干擾素可以通過抑制間充質干細胞 (MSCs)表達iNOS而使其發(fā)揮抗腫瘤作用,抑制腫瘤生長。本發(fā)明為I型干擾素及MSCs在 抗腫瘤中的應用提供了新的重要的機制,并提出了新型臨床治療途徑。
[0041] 為了明確I型干擾素在MSCs中是否有信號轉導,本發(fā)明人首先檢測I型干擾素所 調控的基因在MSCs上的表達。結果表明I型干擾素能上調MSCs上MHC I的表達,其效果 與二型干擾素無明顯差別。然而I型干擾素可以消除MSCs的免疫抑制作用。鑒于IFNa 和IFNi3對MSCs的調控作用相同,在后續(xù)實驗中均采用IFNa。對于信號通路的分析發(fā)現, IFNa并未影響IFNy受體表達、STAT1和NF-κΒ的磷酸化及其入核。螢光素酶實驗和特 異性寡核苷酸結合實驗表明,IFNa抑制STAT1的結合能力,而非NF-κΒ。因此,IFNa通 過抑制STAT1的結合能力減少iNOS的表達,從而降低MSCs的免疫抑制能力。MSCs免疫抑 制的發(fā)揮還依賴于其表達的高水平趨化因子。借助趨化因子,MSCs可以把T細胞等免疫細 胞募集至其周圍,從而發(fā)揮其強大的免疫抑制作用。然而,microbead-based多通道細胞因 子實驗結果顯示IFN α并未影響MSCs趨化因子的表達,因此,IFN α對MSCs免疫抑制作用 的調節(jié)主要體現在調控iNOS的表達上,但是對趨化因子的表達沒有顯著影響。更為重要的 是,本發(fā)明人通過體內腫瘤生長實驗證明,IFNa預處理的MSCs可通過下調其一氧化氮表 達,從而抑制B16-F0黑色素瘤的發(fā)展。
[0042] 基于本發(fā)明人的新發(fā)現,本發(fā)明提供了一種MSCs,其是I型干擾素預處理的MSCs, 或是過表達I型干擾素的MSCs。優(yōu)選的是I型干擾素預處理的MSCs,其制備方法簡單,無 需轉基因操作,不涉及外源基因的插入,給藥時不會存在安全性問題。
[0043] -個方面,所述的MSCs是經I型干擾素預處理的MSCs ;較佳地,所述的預處理包 括:將I型干擾素與間充質干細胞相混合,使得I型干擾素的終濃度可以為200-10000U/ ml〇
[0044] 所述的I型干擾素作為一種已知的蛋白質(多肽),其可以是重組多肽、合成多肽。
[0045] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的I型干擾素是IFNa,其可以具有GenBank登錄號 NP_996753. 1所示的氨基酸序列。編碼IFNa的多核苷酸的核苷酸序列可以是GenBank登 錄號 NC_000070· 6。
[0046] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的I型干擾素是IFNi3,其可以具有GenBank登錄號 AAA37891. 1所示的氨基酸序列。
[0047] 經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的、但保留了本發(fā)明實施 例中所用I型干擾素相同功能的I型干擾素變體或生物活性片段也包括在本發(fā)明中。I型 干擾素變體或生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列,所述經氨基酸替換的序列 并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領域公知的技術,所述技 術可以很容易地被實施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術使本領域人員認 識到,一般來說,在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見 Watson 等,Molecular Biology of The Gene,第四版,1987,The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224〇
[0048] 任何一種I型干擾素的生物活性片段都可以被應用到本發(fā)明中。在這里,I型干擾 素的生物活性片段的含義是指作為一種多肽,其仍然能保持全長的I型干擾素的全部或部 分功能。通常情況下,所述的生物活性片段至少保持50%的全長I型干擾素的活性。在更 優(yōu)選的條件下,所述活性片段能夠保持全長的I型干擾素的60%、70%、80%、90%、95%、 99%、或100%的活性。
[0049] 本發(fā)明也可采用經修飾或改良的I型干擾素,比如,可采用為了促進其半衰期、有 效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的I型干擾素。也就是說,任何不影響I 型干擾素的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。
[0050] 本發(fā)明中,可將編碼過表達I型干擾素的多核苷酸序列插入到重組表達載體中, 轉化MSCs。只要能在MSCs內復制和穩(wěn)定,任何質粒和載體都可以用于本發(fā)明。表達載體的 一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
[0051] 本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含I型干擾素的多核苷酸序列和合適 的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內 重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上,以指導mRNA合成。 轉化載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0052] 基于本發(fā)明的新發(fā)現,還提供了一種I型干擾素預處理的MSCs或過表達I型干擾 素的MSCs的用途,用于制備抑制腫瘤的藥物。
[0053] 所述的腫瘤可以為各種良性或惡性腫瘤,如黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺 癌、肺癌、腦腫瘤、卵巢癌、骨腫瘤、結腸、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、小腸腫瘤、腎腫瘤、腎上腺 腫瘤、膀胱腫瘤、睪丸腫瘤、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經系統(tǒng)腫瘤等。
[0054] MSCs具有趨化性,其能夠聚集于腫瘤區(qū)域,因此,所述的干擾素預處理的MSCs或 過表達I型干擾素的MSCs能夠在腫瘤部位實現抗腫瘤的功能。
[0055] 基于本發(fā)明的新發(fā)現,還提供了 I型干擾素的用途,用于制備提高間充質干細胞 中MHCI表達的組合物;或用于制備降低間充質干細胞的免疫抑制能力(即:調動間充質干 細胞發(fā)揮免疫作用,提高機體抗腫瘤免疫反應)的組合物;或用于制備抑制間充質干細胞 中STAT1的DNA結合能力的組合物;或用于制備減少間充質干細胞中誘導型一氧化氮合成 酶的表達的組合物
[0056] 本發(fā)明還提供了一種組合物,它含有有效量(如0.000001-50wt% ;較佳的 0.00001-20wt%;更佳的,0.0001-10wt% )的所述的干擾素預處理的MSCs或過表達I型干 擾素的MSCs,以及藥學上可接受的載體。
[0057] 通常,可將所述細胞配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中,其 中pH通常約為5-8,較佳地,pH約為6-8。
[0058] 如本文所用,術語"含有"表示各種成分可一起應用于本發(fā)明的混合物或組合物 中。因此,術語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術語"含有"中。如本文所用,術 語"有效量"或"有效劑量"是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物 所接受的量。
[0059] 如本文所用,"藥學上可接受的"的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(如毒性、刺激和變態(tài)反應)的,即具有合理的效益/風險比的物質。術語"藥學上 可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體,包括各種賦形劑和稀釋劑。
[0060] 下面結合具體實施例,進一步闡述本發(fā)明。應理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著,分子克隆實驗指南,第三版,科學出版社,2002中所述的條件, 或按照制造廠商所建議的條件。
[0061] 材料和方法
[0062] 1.試劑
[0063] 流式細胞分析所用的焚光標記流式抗體和同型對照抗體均購自eBioscience公 司;免疫印跡所用抗體:分別抗iNOS、STAT1、p-STATl、p65、p-p65、GAPDH的抗體購自Cell Signaling Technology公司。RNA抽提試劑盒和反轉錄試劑盒購自Tiangen biotech公 司;RIPA裂解液購自Millipore公司;Nucleofector kit V購自Amaxa公司;培養(yǎng)MSCs所 用培養(yǎng)液組分全部購自Gibco公司。
[0064] MSCs的獲得:從小鼠骨髓分離純化而來。分離獲得的MSCs培養(yǎng)于低糖的DMEM培 養(yǎng)液中。
[0065] 本實施例中,處理細胞用的IFNa蛋白(獲自PBL assay science),其氨基酸序 列如GenBank登錄號NP_996753. 1中第1位所示。MSCs中過表達的IFNa,其多核苷酸的 序列如GenBank登錄號NC_000070. 6所示或其簡并序列。所述的IFNI3,其氨基酸序列如 GenBank 登錄號 AAA37891. 1 所示。
[0066] 2.實驗動物
[0067] 實驗小鼠購自中國科學院斯萊克上海實驗動物中心,飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院 實驗動物科學部SPF屏障環(huán)境中。在所有實驗中,使用性別和年齡對應的小鼠進行實驗,所 有動物操作均通過動物倫理審查。
[0068] 3.免疫印跡分析
[0069] (1)蛋白樣品的制備
[0070] a)準備:冰,預冷的PBS,預冷的EP管,預冷離心機。
[0071] b)把經過實驗處理的細胞及時放置冰上,中斷刺激信號,棄掉上清,用預冷的PBS 洗一遍;加入lml預冷PBS用細胞刮將細胞刮下,并轉入預冷的EP管中。
[0072] c)離心:3000rpm,5min ;去上清。
[0073] d)再次離心 3000rpm,2min,徹底去除 PBS。
[0074] e)用適量裂解液(用時加入PI及PMSF)重懸細胞(盡量避免產生氣泡),冰上放 置30min ;每lOmin,用混勾一次。
[0075] d)離心,1. 32X105rpm,15min。取上清,_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0076] (2)免疫印跡分析
[0077] a)實驗準備:配置合適濃度的電泳膠(PAGE);準備電泳緩沖液以及轉膜緩沖液。
[0078] b)蛋白樣品處理:把樣品從_80°C取出,冰上融化,BCA法測定總蛋白濃度,并將各 樣品的總蛋白稀釋至相同濃度備用;加入3X SDS上樣緩沖液,100°C,孵育lOmin,結束后冰 上冷卻2min,離心,混勾。
[0079] c)將準備好的電泳膠放入電泳槽,加入電泳緩沖液,將處理好的蛋白樣品點樣 (50 μ g/ 孔)。
[0080] d)常規(guī)方法進行電泳。
[0081] 4.流式細胞分析
[0082] 取1X106細胞用100 μ 1 FACS緩沖液重懸,加入熒光標記的抗體混勻后,置于4°C 避光孵育30min。離心,棄上清,用FACS緩沖液洗三次。最后用300 μ 1 FACS緩沖液重懸 細胞,用 FACS Calibur flow cytometer 進行檢測。用 FCS Express software 進行數據分 析。
[0083] 5.熒光素酶報告基因實驗
[0084] 將含STAT1特異性結合位點的2X SIE質粒(參見Wu,T. R.等(2002) · SHP-2is a dual-specificity phosphatase involved in Statldephosphorylation at both tyrosine and serine residues in nuclei. J Biol Chem 277, 47572-47580)通過 Amaxa Nuleofector device轉染到MSCs中,接種到24孔板中過夜培養(yǎng)在不同的細胞因子處理 后,分別在不同時間點收集細胞(6hr,12hr和24hr),使用焚光素酶檢測試劑盒(Promega) 測量熒光素酶活性。
[0085] 6. MSCs免疫抑制實驗
[0086] 3H-methyl_thymidine法:首先,將一定數目的MSCs接種于96孔板過夜培養(yǎng)。吸 去上清,每孔接種2X106小鼠脾臟細胞(分別加1 μ g/ml anti-⑶3和1 μ g/ml anti-⑶28 激活)。與MSCs混合培養(yǎng)2-3天后,于最后6小時在每100 μ 1細胞培液中加入1 μ Ci3H-methyl-thymidine。6小時后將培養(yǎng)板放入-80°C冰箱保存,測量之前室溫反復凍融2 次,通過真空吸附轉至專用濾膜,加入閃爍液,使用Wallac Microbeta閃爍計數器測量T細 胞增殖情況。
[0087] 7.熒光定量PCR檢測基因的表達
[0088] a) RNA 抽提:用 RNAprep pure Cell/Bacteria Kit (TianGen)抽提細胞中的總 RNA〇
[0089] b)逆轉錄合成 cDNA :用 TaqMan Reverse Transcription Reagents 將上一步抽提 得到的RNA逆轉錄合成cDNA。
[0090] TaqMan Reverse Transcription Reagents所有試劑均在冰上融化,按照下面的 反應體系配制放入RNase-free管中。
[0091] RN Λ 1 l〇x TaqMan Buffer 1,5 μ,Ι 25 in M MgCl2 3 3 μL dNTF 3 μL Random Hexmamers 0.75 μ 1 RNase inhibitors 0.3 μL Enzyme .3.:8: μ! ddH20 加個:15μ1
[0092] 熱循環(huán)參數:25°C lOmin - 48°C 30min - 95°C 5min。
[0093] c)將上述得到的cDNA-20°C保存或用無菌ddH20稀釋至100 μ 1備用。
[0094] d) Takara SYBR Green 反應體系:
[0095] SYBR Green PCR Master Mix 5 μ 1
[0096] Primers (5 μ M) 各 0· 5 μ 1
[0097] cDNA 4 μ 1
[0098] 將加好樣品的384孔板,放置在ABI: PRISM? 7900HT進行PCR反應。
[0099] 8.轉化 MSCs
[0100] 過表達 IFN α 的 MSCs (MSC-IFN α )的制備
[0101] 通過PCR的方法將小鼠 I型干擾素 IFN α編碼序列從骨髓來源的DC細胞cDNA中 擴增出來,引物序列分別為:5'ACGCTCGAGGCCACCATGGCTAGACTCTGTGC 3'(SEQ ID N0:1)和 5'ACGTCTAGATCACTCCTTCTCTTCACTCAG 3'(SEQ ID N0:2)。所得片段使用 Xho I 和 Xba I 酶切,酶切產物插入到慢病毒穿梭質粒pLVX-IRES-zsGreenl中(帶GFP,購自Clontech Laboratories),得到質粒 pLVX-IRES-zsGreenl-mlFN α。
[0102] 使用三質粒系統(tǒng)進行病毒包裝,包括pMD2G、pSPAX2和穿梭質粒 (pLVX-IRES-zsGreenl 或 pLVX-IRES-zsGreenl-mIFNa )。使用 Lipofectamine2000 將 3 個 質粒一起轉染到293FT細胞中,48h后收集細胞培養(yǎng)上清,800g離心10min去除細胞碎片。 再使用裝有Ultracel-100膜的Ultra-15超濾管進行濃縮病毒并測定病毒滴度。使用Μ0Ι =30左右的病毒分別感染MSCs,GFP和GFP連同IFNa感染的MSCs分別命名為MSC-GFP 和 MSC-IFN a。
[0103] 實施例1、IFN a不能誘導MSCs產生iNOS但可使其上調MHC I類分子
[0104] 為了研究IFNa是對MSCs的免疫調節(jié)作用的影響,本發(fā)明人首先檢測了 IFNa 能否與TNFa協(xié)同作用,誘導MSCs產生一氧化氮(Nitric Oxide,NO)。與文獻報道一致, IFNa和IFNy均能與TNF a協(xié)同誘導骨髓來源的巨噬細胞大量產生N0。但本發(fā)明人發(fā)現, 與IFNy在MSCs中的作用不同,IFNa和TNFa組合卻不能誘導MSCs產生N0(圖1A)。幾 乎所有類型的細胞都會表達I型干擾素受體,本發(fā)明人的基因芯片數據也表明,MSCs表達 IFNa 受體:IFNAR1 和 IFNAR2。
[0105] 為了檢測IFNa的信號能否在MSCs中正常傳導,本發(fā)明人檢測了 MSCs在IFNs作 用下MHC class I(KbDb)的表達。結果顯示IFNa和IFN0均能像IFNy -樣,上調1(?? MSCs上的表達(圖1B)。這證明經典的I型干擾素信號在小鼠 MSCs中是存在的。
[0106] 實施例2、IFN a削弱MSCs的免疫抑制作用
[0107] 既然I型干擾素不能誘導MSCs產生其免疫調節(jié)作用的核心分子一氧化氮,那么 IFNa是否影響MSCs的免疫調節(jié)作用呢?為解決這一問題,本發(fā)明人把IFNa加入到MSCs 與激活的小鼠脾臟細胞(splenocytes,spl)共培養(yǎng)的免疫抑制系統(tǒng)里,以研究其作用。本 發(fā)明人發(fā)現,與iNOS抑制劑L-NMMA類似,IFNa的加入不但解除了 MSCs對激活脾臟細胞 增殖的抑制作用,與對照組相比,反而增加了脾細胞的增殖(圖2A左圖)。
[0108] 同時,本發(fā)明人檢測了共培養(yǎng)體系里N0的量,發(fā)現IFNa也與L-NMMA類似,都抑 制了 MSCs的N0產生(圖2A右圖)。
[0109] I型干擾素家族的另一種分子IFN0,也能很好地解除MSCs的免疫抑制作用(圖 2B),也意味著可提高機體抗腫瘤免疫反應。后續(xù)實施例中均采用IFNa。
[0110] 實施例3、IFN a抑制IFN γ和TNF a刺激的MSCs產生iNOS
[0111] IFNa能夠削弱MSCs的免疫抑制作用,而且減少了共培養(yǎng)體系里NO的量。因此本 發(fā)明人假設,IFNa可能抑制了 iNOS的表達或阻斷了 iNOS的功能,從而減少了 N0的產生。 首先,本發(fā)明人將IFNa或IFNy和TNFa -起刺激MSCs,24hr后收取RNA和蛋白,分別用 熒光定量PCR、蛋白免疫印跡檢測iNOS在mRNA和蛋白水平的表達。結果顯示,IFNa能在 mRNA水平部分抑制iNOS的表達(圖3A),而對其蛋白水平的抑制作用則更顯著(圖3B)。
[0112] 本發(fā)明人之前的研究表明,MSCs發(fā)揮免疫抑制作用還需要產生大量的趨化因子, 招募免疫細胞迀移至MSCs附近,使N0得以在短距離內發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。那么, IFNa是否對MSCs產生趨化因子也有作用呢?本發(fā)明人將MSCs用IFNy和TNFa或者 IFNa、IFNy和TNFa共同刺激24hr,并收集上清,用Bio-Plex懸浮芯片系統(tǒng)檢測趨化因 子的表達。結果發(fā)現,IFNa除了相對特異地抑制MSCs表達N0,促進IL-6的表達,它對其 他趨化因子的表達沒有顯著影響(圖4)。
[0113] 實施例4、IFN α不影響MSCs上IFN γ受體的表達及STAT1和p65的表達、磷酸化 水平和入核能力
[0114] 接下來,本發(fā)明人集中研究了 IFNa通過什么機制抑制MSCs的iNOS表達。有文 獻報道,IFN a / β通過下調巨噬細胞表面IFN γ受體IFNGRs的表達,抑制巨噬細胞激活,使 宿主易感Listeria monocytogenes。本發(fā)明人的芯片數據分析表明,IFNy受體IFNGR1/2 表達均未受IFNa影響,作為陽性對照干擾素可以上調H2-DUH2-K1的表達(圖5A)。
[0115] 本發(fā)明人用流式細胞術分析得到了類似的結果(圖5B)。
[0116] 實施例5、IFN a通過抑制STAT1的結合能力,降低MSCs中iNOS表達
[0117] 上述結果表明,IFNa并不影響MSCs上IFNy受體的表達及STAT1和p65的表 達、磷酸化水平和入核能力。一般,激活的STAT1可以進入細胞核,與特定基因(如iNOS) 啟動子中的特異識別位點結合,行使其基因轉錄活性的調控能力。接下來本發(fā)明人用能與 轉錄因子特異性結合的寡核苷酸序列(STAT1 :5' GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC 3'(SEQ ID N0:3) ;p65:5'AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG 3'(SEQ ID N0:4))聯(lián)接的瓊脂糖珠子,沉淀 STAT1 或NF- κ B以分別檢測其DNA結合能力。結果發(fā)現,經IFN a處理的MSCs中,其STAT1的結 合能力顯著下降,而NF- κ B的結合能力則沒有受明顯影響(圖6A)。
[0118] 熒光素酶報告基因實驗的結果也進一步證實,IFNa可以抑制STAT1的轉錄活性 (圖 6B)。
[0119] 在不同時間點收取了 IFN γ /TNF a和IFN γ /TNF a /IFN a刺激下的MSCs,抽提總 RNA,用熒光定量PCR檢測了 iNOS以及IL-6在24hr內的表達模式。結果與前面bio-plex 結果一致,IFNa抑制iNOS表達而促進IL-6表達(圖6C)。
[0120] 同時,還發(fā)現IFNa在6hr內對iNOS的表達抑制非常微弱,而隨著時間的推遲, IFNa對iNOS表達的抑制效果更加顯著(圖6C)。
[0121] 實施例6、IFNa預處理的MSCs抑制腫瘤生長
[0122] 腫瘤微環(huán)境中的基質細胞對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。此前的報道表明,從 腫瘤中可分離出MSCs,其產生一氧化氮的調控機制與骨髓來源的MSCs十分類似。體外實驗 表明,腫瘤基質細胞可通過產生一氧化氮抑制免疫反應。體內實驗也在證明,抑制腫瘤基質 細胞的一氧化氮產生可以顯著緩解腫瘤的發(fā)展。
[0123] 因此本研究首先采用了過表達IFNa的MSCs(MSC-IFNa),將其與B16-F0黑 色素瘤細胞共同注射于小鼠腿部肌肉;以注射PBS+B16-F0、注射IFN a +B16-F0、注射 MSC-GFP+B16-F0的小鼠作為對照。結果表明,MSC-IFNa可顯著抑制黑色素瘤的生長(圖 7A) 〇
[0124] 為了排除IFNa對腫瘤生長的直接抑制作用,本發(fā)明人又采用了 IFNa預處理24 小時的MSCs與B16-F0共同注射的方式。結果顯示,IFNa預處理的MSCs仍可抑制腫瘤生 長(圖7B)。因此本發(fā)明人的研究證明,I型干擾素可通過減少MSCs的一氧化氮產生,影響 其在腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制作用,從而在體內抑制腫瘤生長。
[0125] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后,本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種間充質干細胞,其特征在于,所述的間充質干細胞是I型干擾素預處理的間充 質干細胞,或是過表達I型干擾素的間充質干細胞。2. 如權利要求1所述的間充質干細胞,其特征在于,所述的預處理包括: 將I型干擾素與間充質干細胞相混合,使得I型干擾素的終濃度為200-10000U/ml。3. 如權利要求1所述的間充質干細胞,其特征在于,所述的過表達I型干擾素的間充質 干細胞中轉化有編碼I型干擾素的多核苷酸。4. 如權利要求1-3任一所述的間充質干細胞,其特征在于,所述的I型干擾素選自: IFN α 或 IFN β。5. 權利要求1-4任一所述的間充質干細胞用途,用于制備抑制腫瘤的藥物。6. 如權利要求5所述的用途,其特征在于,所述的腫瘤是黑色素瘤。7. -種用于抑制腫瘤的藥物組合物,其特征在于,所述的藥物組合物中包含權利要求 1-4任一所述的間充質干細胞。 8. I型干擾素的用途,用于制備提高間充質干細胞中MHC I表達的組合物;或用于制備 降低間充質干細胞的免疫抑制能力或提高機體抗腫瘤免疫反應的組合物。 9. I型干擾素的用途,用于制備抑制間充質干細胞中STAT1的DNA結合能力的組合物; 或用于制備減少間充質干細胞中誘導型一氧化氮合成酶的表達的組合物。10. 如權利要求8或9任一所述的用途,其特征在于,所述的I型干擾素選自:IFNa或 IFN0 〇
【文檔編號】A61K35/28GK105838671SQ201510023359
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月16日
【發(fā)明人】時玉舫, 陳箐, 王瑩
【申請人】中國科學院上海生命科學研究院
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