一種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了脂肪干細胞聯(lián)合內皮祖細胞在制備治療糖尿病性勃起功能障礙藥物中的應用，以及一種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑，是由人來源的脂肪干細胞（ADSCs）和人內皮祖細胞（EPCs）混合配制而成，充分發(fā)揮了ADSCs和EPCs兩種干細胞的優(yōu)勢，利用ADSCs的旁分泌作用促進EPCs的增殖和分化，從而修復受損傷的血管內皮，顯著改善大鼠糖尿病性勃起功能障礙癥狀；而且克服了ADSCs無法向血管內皮分化和EPCs移植入體內后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺點。本發(fā)明ADSCs聯(lián)合EPCs治療糖尿病性勃起功能障礙的技術操作簡單，制備簡便，具有非常重要的臨床意義和廣闊的應用前景。
【專利說明】
一種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域。更具體地，涉及一種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑。
【背景技術】
[0002]糖尿病性勃起功能障礙(diabetic erectile dysfunct1n，DED)患者逐年增多，現有療法對其療效不佳。目前臨床一線療法——5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE_5I)治療DED的有效率僅50%?60%。
[0003]現有研究認為DED的始發(fā)及核心發(fā)病機制為陰莖海綿體血管內皮功能障礙，在此基礎上繼發(fā)勃起相關的神經、平滑肌等損害及一系列病理生理變化。我們通過研究DED大鼠模型證實其海綿體內皮細胞eN0S、VEGF及其受體表達均下降Jesmin等發(fā)現DED大鼠海綿體血管內皮細胞凋亡增加，導致一氧化氮(NO)釋放減少，引起血管內皮細胞功能障礙;之后可造成海綿體血管壁增厚導致小動脈和毛細血管管腔的狹窄、血栓形成，導致海綿體組織缺血缺氧，進而導致陰莖勃起功能減退，而陰莖微小血管病變進一步造成神經、平滑肌缺血缺氧，加重勃起功能障礙。
[0004]近年來，干細胞移植療法的研究給DED的治療帶來了希望。脂肪干細胞(ADSCs)移植治療DED，能夠在一定程度上改善勃起功能，可通過分泌VEGF、HGF、FGF2、CXCL5等生長因子改善局部微環(huán)境，促進局部功能細胞(如血管內皮細胞)的增殖，改善了血管內皮功能;但是ADSCs在體內不能直接分化為血管內皮細胞，限制了其療效。2011年Gou等首次應用EPCs移植治療DED，試圖依靠EPCs的增殖、分化以修復受損的海綿體內皮功能及補充外周血的EPCs;結果發(fā)現EPCs確實可以整合到海綿體的血管區(qū)域并增殖、分化為內皮細胞，移植后DED大鼠的勃起功能得到部分改善，但療效欠佳。我們的研究也證實了上述結果，同時發(fā)現EPCs移植入體內后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降，限制了其療效和應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有治療糖尿病性勃起功能障礙藥物的不足以及干細胞在該領域應用的缺陷，提供一種合理、方便、治療效果更好的聯(lián)合干細胞制劑，涉及兩種干細胞在疾病治療中的應用，具體是脂肪干細胞(ADSCs)和內皮祖細胞(EPCs)聯(lián)合在制備治療糖尿病性勃起功能障礙藥物中的應用。
[0006]本發(fā)明的目的是提供脂肪干細胞聯(lián)合內皮祖細胞在制備治療糖尿病性勃起功能障礙藥物中的應用。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現:
脂肪干細胞(ADSCs)聯(lián)合內皮祖細胞(EPCs)在制備治療糖尿病性勃起功能障礙藥物中的應用。
[0009 ]其中，優(yōu)選地，所述內皮祖細胞為人內皮祖細胞。
[0010]優(yōu)選地，所述脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I?2:1?2。
[0011 ]更優(yōu)選地，所述脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I: I。
[0012]優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為1.0?10.0 X 1Vml。
[0013]更優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為3.0?6.0 X 106/ml。
[0014]最優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為5.0X 1Vml。
[0015]優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為1.0?10.0X 10%1。
[0016]更優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為3.0?6.0X 106/ml。
[0017]最優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為5.0X 106/ml。
[0018]—種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑，包含有效量的脂肪干細胞(ADSCs )聯(lián)合內皮祖細胞(EPCs)。
[0019]優(yōu)選地，在所述的干細胞聯(lián)合制劑中，脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I?2:1?2。
[0020]更優(yōu)選地，在所述的干細胞聯(lián)合制劑中，脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I: I。[0021 ]另外，更優(yōu)選地，所述干細胞聯(lián)合制劑是由脂肪干細胞、內皮祖細胞和PBS混合制備而成。
[0022]優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為1.0?10.0 X 106/ml。
[0023]更優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為3.0?6.0 X 106/ml。
[0024]最優(yōu)選地，所述脂肪干細胞的濃度為5.0X 106/ml。
[0025]優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為1.0?10.0X 10%1。
[0026]更優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為3.0?6.0X 106/ml。
[0027]最優(yōu)選地，所述內皮祖細胞的濃度為5.0X 106/ml。
[0028]優(yōu)選地，所述的PBS為1XPBS。
[0029]具體優(yōu)選地，所述干細胞聯(lián)合制劑的制備方法如下:
分別將脂肪干細胞和內皮祖細胞離心后用I XPBS洗滌I?3次(優(yōu)選I次)，并用細胞計數板計數，加入I X PBS中分別制備成細胞濃度為1.0?10.0 X 10%1的I X PBS制劑，將兩種制劑按照I?2:1?2(優(yōu)選1:1)的比例混合，得到脂肪干細胞和內皮祖細胞聯(lián)合注射液。
[0030]其中，優(yōu)選地，是加入I X PBS中分別制備成細胞濃度為3.0?6.0 X 106/ml的I XPBS制劑。
[0031]更優(yōu)選地，是加入I X PBS中分別制備成細胞濃度為5.0 X 10%1的I X PBS制劑。
[0032]另外，上述干細胞聯(lián)合制劑在制備防治糖尿病性勃起功能障礙的藥物中的應用，以及由此制備得到的防治糖尿病性勃起功能障礙的藥物，也都在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0033]本發(fā)明關于用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑中，脂肪干細胞(ADSCs)是源自脂肪組織的間充質干細胞，這種細胞擴增能力強，分泌細胞因子種類多，具有多向分化潛能，免疫原性低，獲取方法簡單。ADSCs治療勃起功能障礙一般采用陰莖海綿體內注射的方式，通過旁分泌作用改善內皮功能是治療的關鍵。而EPCs是一類能定向增殖分化為成熟血管內皮細胞的前體細胞，主要起源于骨髓，能定向迀移和粘附于受損傷的血管內壁，一方面分化為成熟血管內皮細胞，直接形成新生內皮修復損傷血管；另一方面釋放大量促血管生長因子(如VEGF等)，刺激損傷區(qū)域周圍內皮細胞增殖、迀移，加快受損血管的再內皮化，從而快速修復血管內皮功能。EPCs確實可以整合到海綿體的血管區(qū)域并增殖、分化為內皮細胞，移植后DED大鼠的勃起功能得到部分改善，但療效欠佳，EPCs移植入體內后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降，限制了其療效和應用前景。本發(fā)明充分發(fā)揮了ADSCs和EPCs兩種干細胞的優(yōu)勢，利用ADSCs的旁分泌作用促進EPCs的增殖和分化，從而修復受損傷的血管內皮，顯著改善大鼠糖尿病性勃起功能障礙癥狀;而且克服了 ADSCs無法向血管內皮分化和EPCs移植入體內后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺點。從而達到取長補短的目的。
[0034]另外，本發(fā)明的方案中，對于脂肪干細胞(ADSCs)和內皮祖細胞(EPCs)的來源和制備方法并不做嚴格的限制，可以是任意已知的制備方法或獲取方法。如已經授權的發(fā)明專利200910196288.3公開的一種獲得內皮祖細胞的方法，將市購的骨髓細胞孵育即可得到的懸浮細胞為內皮祖細胞。發(fā)明專利201010568873.4公開的一種脂肪干細胞的分離培養(yǎng)方法，以及發(fā)明專利201210018269.3公開的一種脂肪干細胞的獲取方法等。
[0035 ]本發(fā)明實施例部分提供了一種可實施的選擇方案:
(I)脂肪干細胞的分離培養(yǎng)
局麻下通過抽脂術獲取人皮下脂肪(如患者腹部皮下脂肪)，I型膠原酶消化法獲取原代脂肪干細胞，離心得細胞沉淀，加入基礎培養(yǎng)基重懸后，在飽和濕度、5%C02、37 °C標準環(huán)境下，利用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)并適時傳代。細胞消化時，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗滌細胞，ADSCs重新接種于心的培養(yǎng)瓶，每三天傳代一次，直至細胞達到所需要的細胞濃度，即終止傳代培養(yǎng)。使用成骨誘導和Von Kossa染色、成脂誘導和油紅O染色鑒定其多向分化能力。
[0036](2)內皮祖細胞的分離培養(yǎng):收集到的外周靜脈血(如抽取患者外周靜脈血)經I3BS等倍稀釋后，將稀釋液按2:1比例加至于Ficoll淋巴細胞分離液上進行密度梯度離心，取懸液中間層的單個核細胞，用EGM-2MV培養(yǎng)基重懸后，接種于預包被纖維粘連蛋白的培養(yǎng)皿內，在飽和濕度、5%C02、37°C標準環(huán)境下培養(yǎng)。72h后換液，去除非貼壁細胞，以后每3天換液。細胞消化時，使用EDTA-胰酶消化，I3BS洗滌細胞，EPCs重新接種于新的培養(yǎng)瓶，每三天傳代一次，直至細胞達到所需要的細胞濃度，即終止傳代培養(yǎng)。流式細胞分析檢測CD31，CD34，CD73，CD105，CDl 17，CDl33等EPCs細胞表面標志；免疫熒光分析檢測CD31，vWF，VEGFRl等EPCs細胞表面標志;利用血管腔樣結構形成試驗檢測其分化為血管內皮細胞和形成血管的能力。使用上述方法鑒定EPCs。
[0037]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明研究發(fā)現，ADSCs和EPCs兩種干細胞聯(lián)合使用用于治療糖尿病性勃起功能障礙，可以達到協(xié)同增效的作用，將ADSCs和EPCs干細胞混合制劑移植到糖尿病性勃起功能障礙的大鼠體內，能顯著改善大鼠的勃起功能情況，改善糖尿病所導致的陰莖海綿體內皮功能障礙。
[0038]ADSCs和EPCs兩種干細胞聯(lián)合使用，能夠充分利用兩種干細胞的優(yōu)點，發(fā)揮ADSCs和EPCs兩種干細胞的優(yōu)勢，利用ADSCs的旁分泌作用促進EPCs的增殖和分化，從而修復受損傷的血管內皮，顯著改善大鼠糖尿病性勃起功能障礙癥狀;而且克服了 ADSCs無法向血管內皮分化和EPCs移植入體內后存活率不高，移植后其增殖、分化能力下降的缺點，從而達到取長補短的目的。
[0039]另外，ADSCs和EPCs兩種干細胞具有擴增能力強、制備簡單、免疫原性低等優(yōu)點，而且，ADSCs和EPCs干細胞聯(lián)合制劑的制備方法簡單，利用ADSCs和EPCs干細胞聯(lián)合制劑治療糖尿病性勃起功能障礙，以此為思路開發(fā)可用于臨床治療的干細胞混合制劑具有非常重要的臨床意義和廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0040]圖1為ADSCs和cEPC共培養(yǎng)14天后形態(tài)學(A)及增殖能力(B)分析結果。
[0041 ] 圖2為ADSCs和EPCs聯(lián)合移植治療DED大鼠28天后海綿體內壓(ICP)和海綿體內壓/平均動脈壓(ICP/MAP)測定結果。
[0042]圖3為ADSCs和EPCs聯(lián)合移植治療DED大鼠28天后陰莖海綿體內皮細胞標志物⑶31和eNOS的免疫熒光結果。
【具體實施方式】
[0043]以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。
[0044]除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0045]實施例1脂肪干細胞與內皮祖細胞聯(lián)合制劑的制備 1、脂肪干細胞的分離培養(yǎng)
局麻下通過抽脂術獲取人皮下脂肪(如患者腹部皮下脂肪)，I型膠原酶消化法獲取原代脂肪干細胞，離心得細胞沉淀，加入基礎培養(yǎng)基重懸后，在飽和濕度、5%C02、37 °C標準環(huán)境下，利用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)后接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)并適時傳代。細胞消化時，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗滌細胞，ADSCs重新接種于心的培養(yǎng)瓶，每三天傳代一次，直至細胞達到所需要的細胞濃度，即終止傳代培養(yǎng)。
[0046]使用成骨誘導和VonKossa染色、成脂誘導和油紅O染色鑒定其多向分化能力。
[0047]2、內皮祖細胞的分離培養(yǎng)
收集到的外周靜脈血(如抽取患者外周靜脈血)經PBS等倍稀釋后，將稀釋液按2:1比例加至于Ficoll淋巴細胞分離液上進行密度梯度離心，取懸液中間層的單個核細胞，用EGM-2MV培養(yǎng)基重懸后，接種于預包被纖維粘連蛋白的培養(yǎng)皿內，在飽和濕度、5%C02、37°C標準環(huán)境下培養(yǎng)。72h后換液，去除非貼壁細胞，以后每3天換液。細胞消化時，使用EDTA-胰酶消化，PBS洗滌細胞，EPCs重新接種于新的培養(yǎng)瓶，每三天傳代一次，直至細胞達到所需要的細胞濃度，即終止傳代培養(yǎng)。
[0048]流式細胞分析檢測CD31，CD34，CD73，CD105，CD117，CD133等EPCs細胞表面標志；免疫熒光分析檢測⑶31，vWF，VEGFRl等EPCs細胞表面標志；利用血管腔樣結構形成試驗檢測其分化為血管內皮細胞和形成血管的能力。
[0049]使用上述方法鑒定EPCs。
[0050]3、干細胞聯(lián)合制劑的配制
將收集到的ADSCs和EPCs離心后用I XI3BS洗滌I次，用細胞計數板計數，加入I X PBS中分別制備成細胞濃度為5.0 X 1iVml的I XPBS制劑，將兩種制劑按照1:1比例混合成為脂肪干細胞和內皮祖細胞聯(lián)合注射液。
[0051]
實施例2脂肪干細胞與內皮祖細胞體外共培養(yǎng)及ADSCs在體外對于EPCs增殖和分化的影響
1、方法
將EPCs置于transwelI與ADSCs或SMC共培養(yǎng)，一定時間后取EPCs進行下列檢測:在第I，7，14天通過MTS法分析測定EPCs的增殖能力;使用H202-1njured和CCK-8法，檢測抗凋亡能力(存活)；使用In Vitro Ang1genesis Assay Kit試劑盒，檢測EPCs分化為血管內皮細胞的能力和血管形成能力；觀察ADSCs對于EPCs增殖和分化的影響。使用ELISA、Westernblot、PCR等方法，檢測ADSCs分泌細胞因子情況(VEGF，HGF，FGF2，CXCL5)、EPCs增殖凋亡分化等相關基因表達(燈-67、0&8-3、1'1]肥10。
[0052]2、結果如附圖1所示。
[0053]ADSCs和EPCs共培養(yǎng)14天后，形態(tài)學如圖A所示，增殖能力如圖B所示，將ADSCs與EPCs共培養(yǎng)14天后，EPCs的增殖能力較單獨EPCs或SMC與EPCs共培養(yǎng)更高(*p〈0.05)，且在形態(tài)學上也可見EPCs明顯增多(圖A)。
[0054]
實施例3脂肪干細胞與內皮祖細胞聯(lián)合制劑的應用試驗
1、糖尿病性勃起功能障礙(DED)大鼠模型的構建
(I)大鼠適應性飼養(yǎng)I周后，用鏈脲佐菌素(STZ)按40mg/kg體重左下腹腔內注射。STZ溶液的配制方法:使用0.1 m ο I / L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液(P H 4.0 )，在冰浴中配制1 m g /mlSTZ，注意避光，即配即用;對照組用檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液行左下腹腔注射。觀察注射STZ后大鼠癥狀，一周后檢測血糖，任意時間血糖值>16.7mmoI/L為糖尿病(DM)大鼠模型。
[0055](2)DM大鼠模型的建立10周后，選擇一安靜的房間，將大鼠放在玻璃箱中，適應環(huán)境lOmin，室內保持安靜，燈光調暗，僅夠觀察即可，然后在頸項松弛皮膚處注射阿撲嗎啡(AP0)100ug/kg，AP0溶解于0.5mg/kg的VitC與生理鹽水中，調整體積為5ml/kg，每只大鼠于注射后立刻觀察30min，并記錄陰莖有無勃起、陰莖勃起次數。龜頭充血及末端陰莖體出現為陰莖勃起I次。未見勃起者為DED大鼠。
[0056]2、脂肪干細胞與內皮祖細胞聯(lián)合制劑移植實驗
(I)陰莖海綿體注射
戊巴比妥30mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，剪開包皮，暴露陰莖組織，在陰莖根部加止血帶，Iml注射器抽取脂肪干細胞與內皮祖細胞聯(lián)合制劑0.2ml，打入陰莖海綿體；I分鐘后松開止血帶，縫合包皮。
[0057](2)大鼠勃起狀況的評價
主要通過測量平均動脈壓(MAP)、海綿體內壓(ICP)檢測，具體方法如下:戊巴比妥30mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，在奧林巴斯顯微鏡下進行游離并暴露右側勁總動脈，環(huán)形切開包皮，暴露陰莖腳、同時暴露盆神經節(jié)、后將含250IU/ml的肝素鹽水PE-50導管置入以監(jiān)測MAP;海綿體內置入一根23G的不銹鋼針(充滿250IU/ml的肝素鹽水)，另一端連接至PE-50導管上，上述兩根導管與壓力換能器連接，并通過Power Lab四道生理記錄儀記錄。雙極不銹鋼電極盆神經節(jié)發(fā)出約3?4_處勾住海綿體神經，總時間lmin。刺激器參數:單相矩形脈沖刺激5ms、電壓3?5V、頻率15Hz，波寬Ims，間隔1min后重復一次。
[0058](3)陰莖海綿體形態(tài)學指標
測定ICP后處死大鼠，完整切取陰莖海綿體組織，剪去包皮及軟骨，橫切一小段立即置液氮中保存，利用HE染色、免疫組織化學染色、western blot和PCR等方法檢測海綿體:血管密度指標(CD31)、增殖和凋亡指標(K1-67、Cas-3、TUNEL)、血管內皮功能指標(eN0S、vWF)等表達情況。
[0059]3、試驗結果
結果如附圖2，ADSCs和EPCs聯(lián)合移植治療DED大鼠28天后，海綿體內壓(ICP)和海綿體內壓/平均動脈壓(ICP/MAP)測定顯示，單獨移植ADSCs或ECPs，或者聯(lián)合移植ADSCs和ECPs，都能明顯改善DED大鼠的ICP&ICP/MAP(p〈0.05)，其中與單獨移植ADSCs或ECPs組相比，聯(lián)合移植組改善作用大幅提升，最明顯、最顯著，表現出了協(xié)同增效的作用(p〈0.05)。
[0060]如附圖3，ADSCs和EPCs聯(lián)合移植治療DED大鼠28天后，陰莖海綿體內皮細胞標志物⑶31和eNOS的免疫熒光結果顯示，ADSCs和EPCs聯(lián)合移植能顯著增加DED大鼠海綿竇內皮細胞標志的表達。
【主權項】
1.脂肪干細胞聯(lián)合內皮祖細胞在制備治療糖尿病性勃起功能障礙藥物中的應用。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述內皮祖細胞為人內皮祖細胞。3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I?2:I?2ο4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述脂肪干細胞的濃度為1.0?10.0 X 16/ml，所述內皮祖細胞的濃度為1.0?10.0 X 106/ml。5.—種用于治療糖尿病性勃起功能障礙的干細胞聯(lián)合制劑，其特征在于，包含有效量的脂肪干細胞和內皮祖細胞。6.根據權利要求5所述的干細胞聯(lián)合制劑，其特征在于，所述脂肪干細胞和內皮祖細胞的比例為I?2:1?2。7.根據權利要求5所述的干細胞聯(lián)合制劑，其特征在于，所述干細胞聯(lián)合制劑由脂肪干細胞、內皮祖細胞和PBS混合制備而成。8.根據權利要求7所述的干細胞聯(lián)合制劑，其特征在于，所述脂肪干細胞的濃度為1.0?I 0.0 X 10 Vml，所述內皮祖細胞的濃度為1.0?10.0 X 1 Vml，所述的PBS為I XI3BS。9.根據權利要求8所述的干細胞聯(lián)合制劑，其特征在于，所述干細胞聯(lián)合制劑的制備方法如下: 分別將脂肪干細胞和內皮祖細胞離心后用I XPBS洗滌，并計數，加入I X PBS中分別制備成細胞濃度為1.0?10.0 X 106/ml的I X PBS制劑，將兩種制劑按照I?2:1?2的比例混合，得到脂肪干細胞和內皮祖細胞聯(lián)合注射液。10.權利要求5?9任一所述干細胞聯(lián)合制劑在制備防治糖尿病性勃起功能障礙的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/28GK106074603SQ201610535281
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】鄧春華, 劉貴華, 孫祥宙, 陳鑫, 楊其運, 韓大愚, 夏凱
【申請人】中山大學附屬第醫(yī)院, 中山大學附屬第一醫(yī)院, 中山大學附屬第六醫(yī)院