一種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑，包含：a.從人體血液或組織器官中分離提取的干細(xì)胞和/或由所述干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的胰島樣細(xì)胞，細(xì)胞含量為1×105-5×107個(gè)/ml；及b.含0.5％肝素鈣的細(xì)胞保存液。本發(fā)明還提供這種干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：（1）干細(xì)胞的分離純化；（2）干細(xì)胞體外培養(yǎng)，或干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞；（3）將步驟（2）獲得的細(xì)胞用保存液稀釋，制成干細(xì)胞制劑；（4）干細(xì)胞制劑的質(zhì)量檢測(cè)。該干細(xì)胞制劑移植到體內(nèi)可以分化為胰島素分泌細(xì)胞，分泌胰島素，有效降低糖尿病人血糖濃度，從而為克服糖尿病依賴胰島素治療、根治糖尿病提供了新的途徑。
【專利說(shuō)明】—種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞研究領(lǐng)域，尤其涉及用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素功能障礙引起的一類(lèi)代謝疾病，主要包括I型和II型糖尿病。近年來(lái)，糖尿病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，而且更趨年輕化。預(yù)計(jì)截止到2025年，世界范圍內(nèi)將有3.34億人次患有糖尿病，糖尿病已成為威脅人類(lèi)健康的一大頑疾。
[0003]目前治療糖尿病的方法主要為傳統(tǒng)的治療方法，有注射胰島素、口服降糖藥、控制飲食、適度運(yùn)動(dòng)等。臨床上一般采用注射胰島素來(lái)維持血糖，但胰島素注射既不能精確調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖水平，也不能阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生，而且往往最終會(huì)造成患者的胰島素依賴。目前并無(wú)更有效的治療糖尿病的方法，因此各國(guó)學(xué)者在不斷地探索并尋找出更好的治療方案，提高糖尿病患者的治療效果或控制糖尿病患者的胰島素使用量。例如，采用細(xì)胞滲透修復(fù)療法替代異常β細(xì)胞工作，使自體β細(xì)胞得以修養(yǎng)恢復(fù)；用β細(xì)胞重組激活技術(shù)修復(fù)功能受損、衰竭的胰島β細(xì)胞；對(duì)晚期糖尿病患者采用胰島移植手術(shù)療法，等等。胰島移植手術(shù)療法雖然可以避免胰島素注射引起的低血糖或胰島素抵抗，但是受到胰腺供體嚴(yán)重缺乏的限制，并且因手術(shù)并發(fā)癥和免疫排斥反應(yīng)等而使移植的遠(yuǎn)期效果不理想。
[0004]近年來(lái)，干細(xì)胞可塑性研究為各種疾病的治療提供了一種新的手段。干細(xì)胞是一種具有巨大增殖潛能的細(xì)胞，可分化為多種細(xì)胞類(lèi)型，因而為組織器官的再造移植和重大疾病的治療提供了希望。目前研究表明人體干細(xì)胞可以分化成多種細(xì)胞類(lèi)型包括胰島細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。干細(xì)胞移植治療對(duì)許多慢性疾病和退化性疾病有很好的治療前景。移植到體內(nèi)的干細(xì)胞可以分化為多種組織細(xì)胞從而重建損傷組織和器官。已有研究表明干細(xì)胞能在體內(nèi)體外轉(zhuǎn)化成胰島細(xì)胞，在臨床上具有治療糖尿病的可能(王愛(ài)紅等，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞的分化，中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，200812(21):4102-4106)。然而，尚未見(jiàn)關(guān)于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑開(kāi)發(fā)成功的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑及其制備方法，其具有穩(wěn)定性高、療效好、安全性高、適用于臨床大規(guī)模使用、應(yīng)用前景廣闊的特點(diǎn)，能夠克服上述糖尿病治療方法的缺點(diǎn)，為臨床上干細(xì)胞的使用提供新的途徑。
[0006]本發(fā)明提供的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑，包含:
[0007]a.從人體血液或組織器官中分離提取的干細(xì)胞和/或由所述干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的胰島樣細(xì)胞，細(xì)胞含量為I X 105-5 X IO7個(gè)/ml ;及
[0008]b.含0.5%肝素鈣的細(xì)胞保存液。
[0009]上述人體血液或組織器官包括但不限于人體的臍帶、臍帶血、月經(jīng)血、骨髓、牙齒、脂肪組織、胰腺和肝臟。[0010]本發(fā)明提供的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑，其中的主要活性成分可以是:
[0011]從人體血液或組織器官中分離提取的干細(xì)胞；或
[0012]由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的胰島樣細(xì)胞；或
[0013]上述兩種細(xì)胞組成的混合物。
[0014]所述干細(xì)胞和/或由所述干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的胰島樣細(xì)胞保存于可以保持細(xì)胞活性的溶劑與0.5%的肝素鈣組成的保存液中。
[0015]本發(fā)明提供的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑中的干細(xì)胞可以是在分離提取后進(jìn)一步經(jīng)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞。
[0016]所述的干細(xì)胞來(lái)源于人體的臍帶、臍帶血、月經(jīng)血、骨髓、牙齒、脂肪組織、胰腺、肝臟及其他可以提取干細(xì)胞的組織或器官等。
[0017]所述的干細(xì)胞呈纖維樣貼壁生長(zhǎng)，該細(xì)胞群表達(dá)⑶44、⑶90、⑶29、⑶73，不表達(dá)或低表達(dá) CD34、CD45、HLA-DR0
[0018]本發(fā)明干細(xì)胞制劑中的保存液由可以保持細(xì)胞活性的溶劑配制而成，所述溶劑包括但不限于生理鹽水或無(wú)菌PBS溶液。
[0019]所述制劑中含有I X ΙΟ5—5X107個(gè)/ml干細(xì)胞或胰島樣細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明還提供了一種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟:
[0021](I)干細(xì)胞的分離純化；
[0022](2)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，或干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞；
[0023](3)將步驟(2)獲得的細(xì)胞用保存液稀釋，制成干細(xì)胞制劑；
[0024](4)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量檢測(cè)。
[0025]所述的干細(xì)胞的分離純化包括以下步驟:將檢測(cè)合格的人體組織或器官經(jīng)過(guò)機(jī)械剪碎后，經(jīng)過(guò)膠原酶消化為單細(xì)胞懸液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基終止消化，再將所有液體移入離心管中1500rpm離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液接種在含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待成纖維狀細(xì)胞達(dá)到60-80%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化、傳代、再培養(yǎng)，以達(dá)到純化和擴(kuò)增干細(xì)胞的目的。
[0026]所述的干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞包括以下步驟:取人干細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，按I X IO6個(gè)細(xì)胞加入1-3ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含15%_20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4-6 μ g/L重組人堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5-1OmmoI/L尼克酰胺);置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2_3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間2_3周，以2周左右為宜。收獲胰島樣細(xì)胞備用。
[0027]所述的體外培養(yǎng)干細(xì)胞的裝置包括孔板、平板、T瓶、反應(yīng)器、細(xì)胞工廠等。
[0028]本發(fā)明的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑可通過(guò)靜脈、腹腔或原位注入患者體內(nèi)，以有效發(fā)揮治療糖尿病的作用。例如，對(duì)于人脂肪干細(xì)胞制劑/人脂肪干細(xì)胞衍生的胰島樣細(xì)胞制劑，可將質(zhì)量檢測(cè)合格的I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml (含0.5%肝素鈣的生理鹽水混懸液)，以0.5 X IO6-1X IO6個(gè)細(xì)胞/公斤體重靜脈注入。
[0029]本發(fā)明與現(xiàn) 有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0030]本發(fā)明打破了糖尿病的傳統(tǒng)治療方法，巧妙地運(yùn)用人來(lái)源干細(xì)胞及其衍生而來(lái)的胰島樣細(xì)胞，并將其與其他成分組合制備成干細(xì)胞制劑，其穩(wěn)定性高，療效好，用后無(wú)任何毒副作用，為臨床大規(guī)模使用奠定了基礎(chǔ)。
[0031]本發(fā)明提供的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑移植到人體后可分化成胰島素分泌細(xì)胞，能夠有效降低病人血糖濃度，避免胰島素注射引起的低血糖或胰島素抵抗，更重要的是能減少和改善糖尿病并發(fā)癥。并且能夠解決胰島移植治療糖尿病目前受到胰腺供體嚴(yán)重缺乏的限制，且能夠避免出現(xiàn)免疫排斥等問(wèn)題。
[0032]而且，本發(fā)明制劑中的干細(xì)胞由于來(lái)源廣泛，不受倫理限制、免疫原性低使其成為糖尿病治療的新的有效手段，應(yīng)用前景十分廣闊。
[0033]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0034]圖1顯示脂肪干細(xì)胞(ADSCs)分離過(guò)程中原代培養(yǎng)24小時(shí)的貼壁細(xì)胞。
[0035]圖2顯示原代培養(yǎng)5天時(shí)形成的脂肪干細(xì)胞集落。
[0036]圖3顯示培養(yǎng)3代細(xì)胞形態(tài)趨于一致的脂肪干細(xì)胞。
[0037]圖4顯示流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)至第5代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞表面抗原分子的測(cè)定結(jié)
果O
[0038]圖5顯示第5 代ADSCs誘導(dǎo)胰島分化12天后形成的類(lèi)似圓形或不規(guī)則形的細(xì)胞簇。
[0039]圖6顯示誘導(dǎo)15天的胰島樣細(xì)胞團(tuán)雙硫腙工作液染色后的結(jié)果。
[0040]圖7顯示干細(xì)胞制劑對(duì)糖尿病模型大鼠血糖水平的影響。
[0041]圖8顯示干細(xì)胞制劑對(duì)糖尿病模型大鼠體重的影響。
[0042]圖9顯示干細(xì)胞制劑移植后糖尿病模型大鼠組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043]為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑及其制備方法進(jìn)行說(shuō)明。
[0044]實(shí)施例1:人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備
[0045]將檢測(cè)合格的脂肪經(jīng)過(guò)機(jī)械剪碎后，經(jīng)過(guò)膠原酶消化為單細(xì)胞懸液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基終止消化，再將所有液體移入離心管中1500rpm離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液按3ml/每板接種在含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，待成纖維狀細(xì)胞達(dá)到60-80%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化、傳代、再培養(yǎng)，以達(dá)到純化和擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集第3-8代細(xì)胞嚴(yán)格按照低溫保存步驟凍存、復(fù)蘇備用。
[0046]實(shí)施例2:人脂肪干細(xì)胞衍生的胰島樣細(xì)胞制劑的制備
[0047]將檢測(cè)合格的脂肪經(jīng)過(guò)機(jī)械剪碎后，經(jīng)過(guò)膠原酶消化為單細(xì)胞懸液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基終止消化，再將所有液體移入離心管中1500rpm離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液按3ml/每板接種在含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，待成纖維狀細(xì)胞達(dá)到60-80%融合時(shí)，進(jìn)行消化、傳代、再培養(yǎng)，以達(dá)到純化和擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集第3-8代細(xì)胞嚴(yán)格按照低溫保存步驟凍存、復(fù)蘇備用。
[0048]取復(fù)蘇的人脂肪干細(xì)胞加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每IXlO6個(gè)細(xì)胞中加入l_3ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為a-MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含15%-20%Knock0ut?血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4_6ng/ml重組人堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5-lOmmol/L尼克酰胺。每2_3天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周左右，收獲胰島樣細(xì)胞。
[0049]實(shí)施例3:對(duì)N0D/SCID大鼠移植脂肪來(lái)源干細(xì)胞制劑的實(shí)驗(yàn)
[0050]I)脂肪來(lái)源干細(xì)胞制劑的制備
[0051]a.按照實(shí)施例1的方法制備脂肪來(lái)源人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑:
[0052]將檢測(cè)合格的脂肪經(jīng)過(guò)機(jī)械剪碎后，經(jīng)過(guò)膠原酶消化為單細(xì)胞懸液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基終止消化，再將所有液體移入離心管中1500rpm離心5min，棄去上清，加入培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為I X IO6個(gè)/ml，將細(xì)胞懸液按3ml/每板接種在含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，待成纖維狀細(xì)胞達(dá)到60-80%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化、傳代、再培養(yǎng)，以達(dá)到純化和擴(kuò)增培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集第3-8代細(xì)胞嚴(yán)格按照低溫保存步驟凍存、復(fù)蘇備用。
[0053]b.按照實(shí)施例2的方法制備人脂肪干細(xì)胞體外誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞團(tuán):
[0054]將分離提取的第3-8代脂肪干細(xì)胞置于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)三、四天，達(dá)70%-80%融合后，換用含15%-20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4-6ng/ml重組人堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5-10mmol/L尼克酰胺的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，每2-3天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)2周左右，收獲胰島樣細(xì)胞。
[0055]誘導(dǎo)分化的胰島樣細(xì)胞團(tuán)鑒定:使用雙硫腙染色法檢測(cè)胰島樣細(xì)胞團(tuán)。雙硫腙IOmg溶于Iml 二甲基亞砜中配成儲(chǔ)備液，一 20°C保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用磷酸鹽緩沖液1:100稀釋，0.22 μ m孔徑濾膜過(guò)濾，即為工作液。在倒置顯微鏡下隨機(jī)挑取誘導(dǎo)獲得的胰島樣細(xì)胞團(tuán)加入工作液37°C孵育15min后，磷酸鹽緩沖液洗3次，鏡檢。
[0056]2)大鼠糖尿病模型的建立:采用完全隨機(jī)法，將36只N0D/SCID大鼠分為鏈脲菌素注射組30只，正常對(duì)照組6只。用0.lmol/L檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液(pH 4.4)將鏈脲菌素配制成2%注射液?？崭?2h后鏈脲菌素注射組腹腔注射70mg/kg體重的鏈脲菌素，正常對(duì)照組腹腔注射70mg/kg體重的檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液(pH 4.4)。大鼠分別于注射前和注射后48h、第5天和第8天空腹斷尾采血，用血糖儀測(cè)定全血血糖濃度，選取連續(xù)2次血糖濃度高于16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。
[0057]3)大鼠糖尿病的干細(xì)胞制劑移植實(shí)驗(yàn)治療:采用完全隨機(jī)法將已成模的糖尿病大鼠分為3組:胰島樣細(xì)胞移植組9只，進(jìn)行腎被膜下胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植，每只大鼠植入胰島樣細(xì)胞團(tuán)數(shù)目3000±100個(gè)；干細(xì)胞移植組9只，腎被膜下移植未進(jìn)行誘導(dǎo)的脂肪干細(xì)胞細(xì)胞數(shù)約2X106個(gè)；糖尿病對(duì)照組6只，腎被膜下移植不含細(xì)胞的培養(yǎng)液。3組大鼠均于移植前及移植后48h測(cè)定空腹血糖濃度，之后每周定點(diǎn)測(cè)空腹血糖及稱體重I次。
[0058]4)實(shí)驗(yàn)效果主要觀察指標(biāo):①人脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化胰島樣細(xì)胞團(tuán)及其鑒定結(jié)果糖尿病大鼠移植效果的觀察糖尿病大鼠移植后的組織學(xué)檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。
[0059]試驗(yàn)結(jié)果為:
[0060]I)分離的脂肪干細(xì)胞接種24h后，幾乎所有細(xì)胞都貼附于培養(yǎng)瓶底，輕晃培養(yǎng)瓶可見(jiàn)大部分細(xì)胞隨培養(yǎng)液晃動(dòng)，全量換液時(shí)可見(jiàn)貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞有小的突起(可參見(jiàn)圖1)。3天后細(xì)胞開(kāi)始增殖，并出現(xiàn)多種形態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞逐漸形成分散的集落，多為成纖維細(xì)胞樣和寬大扁平的細(xì)胞(可見(jiàn)圖2)，7~8天時(shí)，集落內(nèi)細(xì)胞匯合，細(xì)胞分裂相減少，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，至14天左右，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%-90%融合，其形態(tài)呈比較均一的長(zhǎng)梭形，呈放射狀或旋渦狀排列(可參見(jiàn)圖3)。
[0061]2)流式細(xì)胞儀檢測(cè):取培養(yǎng)第5代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞的表面抗原特性。測(cè)定結(jié)果顯示(可參見(jiàn)圖4) =ADSCs均一的表達(dá)⑶44，⑶90陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為95.23%,93.00%;⑶34(造血干細(xì)胞的表面特異性標(biāo)記)、⑶45 (白細(xì)胞表面共同抗原)表達(dá)陰性，僅有微弱表達(dá)，細(xì)胞表達(dá)的百分率分別為7.30%,8.21%。結(jié)果表明分離培養(yǎng)得到的ADSCs是具有均一細(xì)胞表面特征的細(xì)胞群，這是一群區(qū)別于造血干細(xì)胞(hematopoietie stemcells, HSCs)并處于未分化狀態(tài)的干細(xì)胞。
[0062]3)脂肪干細(xì)胞進(jìn)體外誘導(dǎo)后，從第4天胰島樣細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始出現(xiàn)，此后胰島樣細(xì)胞團(tuán)逐漸增大、數(shù)量增多，光鏡下可看到細(xì)胞團(tuán)周邊突觸逐漸縮短，中心漸變圓，多數(shù)細(xì)胞已聚集成簇，結(jié)構(gòu)類(lèi)似胰島(可參見(jiàn)圖5)。經(jīng)過(guò)雙硫腙染色觀察，誘導(dǎo)15天的胰島樣細(xì)胞團(tuán)雙硫腙工作液染色15分鐘后，可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)多數(shù)細(xì)胞染成猩紅色。這表明誘導(dǎo)出來(lái)的細(xì)胞團(tuán)是分化成胰島樣細(xì)胞的脂肪干細(xì)胞(可參見(jiàn)圖6)。
[0063]4)糖尿病大鼠移植效果的觀察
[0064]①血糖濃度變化
[0065]將24只已成模的糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為3組:胰島樣細(xì)胞移植組；干細(xì)胞移植組和對(duì)照組(3組大鼠空腹血糖 濃度均在糖尿病血糖濃度范圍內(nèi))。胰島樣細(xì)胞移植組大鼠移植后2周內(nèi)，血糖濃度均有所降低，但仍高于正常血糖濃度范圍，移植后第3周血糖濃度迅速上升之后一直維持高血糖狀態(tài)。干細(xì)胞移植組大鼠移植后血糖一直處于較高水平，移植后第6周血糖開(kāi)始下降，之后維持于較低水平。與兩移植組大鼠相比，糖尿病對(duì)照組大鼠血糖濃度一直處于糖尿病血糖濃度范圍內(nèi)，無(wú)一只下降(可參見(jiàn)圖7 )。
[0066]②體重變化
[0067]隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，糖尿病對(duì)照組大鼠體重明顯降低，表現(xiàn)出糖尿病典型癥狀“消瘦”，而兩移植組大鼠體重雖然降低但降低的幅度小于糖尿病對(duì)照組大鼠，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(Ρ>0.05)(可參見(jiàn)圖8)。
[0068]③組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果
[0069]胰島素免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果表明，在未接受細(xì)胞移植的糖尿病大鼠的胰腺內(nèi)(圖9a)，未發(fā)現(xiàn)胰島素陽(yáng)性的細(xì)胞；在脂肪干細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植后的胰腺內(nèi)胰島素染色可顯示移植細(xì)胞。ADSCs分化的胰島樣細(xì)胞移植2周后(圖9b)，移植部位粘膜下層出現(xiàn)大量胰島素陽(yáng)性染色的移植細(xì)胞，有小部分遷移到粘膜層；移植后4周(圖9c)，在移植部位的粘膜下層可見(jiàn)散在的成簇的胰島素陽(yáng)性著色的移植細(xì)胞，細(xì)胞簇開(kāi)始逐漸，這些細(xì)胞簇在形態(tài)結(jié)構(gòu)上類(lèi)似胰島；移植后8周(圖9d)，仍可見(jiàn)成簇的胰島素陽(yáng)性的移植細(xì)胞。
[0070]上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明:體內(nèi)移植本發(fā)明的干細(xì)胞制劑后，干細(xì)胞可以快速到達(dá)損傷的胰腺組織參與組織修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中移植胰島樣細(xì)胞團(tuán)的大鼠在移植后2周內(nèi)血糖均有所下降，表明植入的細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮了作用，分泌胰島素使大鼠血糖下降；但血糖濃度仍高于正常水平，說(shuō)明進(jìn)入胰腺的誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞尚未完全成熟，分泌的胰島素量不足以維持正常水平。移植干細(xì)胞制劑的大鼠在移植后第6周血糖開(kāi)始下降，之后維持于較低水平，提示干細(xì)胞制劑中的脂肪干細(xì)胞或誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞在體內(nèi)經(jīng)歷了向胰島β細(xì)胞分化的過(guò)程，能夠分泌足量的胰島素保持體內(nèi)血糖穩(wěn)定。同時(shí)移植干細(xì)胞制劑的大鼠體重減少小于對(duì)照組糖尿病大鼠，表明本發(fā)明所制備的干細(xì)胞制劑在糖尿病治療中的主要生理指標(biāo)(血糖水平、體重變化)都有明顯治療效果，可以減輕糖尿病病癥(見(jiàn)表1、表2 )。
[0071]表1干細(xì)胞制劑移植治療糖尿病模型大鼠的血糖水平情況0- οι mol/L)
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑，包含: a.從人體血液或組織器官中分離提取的干細(xì)胞和/或由所述干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的胰島樣細(xì)胞，細(xì)胞含量為I X 105-5 X IO7個(gè)/ml ;及 b.含0.5%肝素鈣的細(xì)胞保存液。
2.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中所述人體血液或組織器官選自人體的臍帶、臍帶血、月經(jīng)血、骨髓、牙齒、脂肪組織、胰腺和肝臟。
3.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中所述干細(xì)胞是在分離提取后進(jìn)一步經(jīng)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中所述干細(xì)胞呈纖維樣貼壁生長(zhǎng)，該細(xì)胞群表達(dá) CD44、CD90、CD29、CD73，不表達(dá)或低表達(dá) CD34、CD45、HLA-DR0
5.如權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞保存液由生理鹽水或無(wú)菌PBS溶液配制而成。
6.一種如權(quán)利要求1所述用于治療糖尿病的干細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)干細(xì)胞的分離純化； (2)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，或干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞； (3)將步驟(2)獲得的細(xì)胞用保存液稀釋，制成干細(xì)胞制劑； (4)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述干細(xì)胞的分離純化和體外培養(yǎng)包括以下步驟:將檢測(cè)合格的人體血液或剪碎的組織器官用膠原酶消化為單細(xì)胞懸液，加入含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心分離除去上清，加培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液接種在含有胎牛血清的a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待成纖維狀細(xì)胞達(dá)到60-80%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化、傳代、再培養(yǎng)。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成胰島樣細(xì)胞包括以下步驟:取人干細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，按I X IO6個(gè)細(xì)胞加入l_3ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基:a -MEM培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含15%-20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4_6 μ g/L重組人堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、5-lOmmol/L尼克酰胺；置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每2_3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間2-3周。
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中所述干細(xì)胞制劑的質(zhì)量檢測(cè)包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒、內(nèi)毒素、熱源檢測(cè)及細(xì)胞活性檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103845362SQ201210517298
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】劉勇, 陳彥田, 齊瀚實(shí) 申請(qǐng)人:上海坤愛(ài)生物科技有限公司