一種經(jīng)血源干細胞制劑及其制備方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種經(jīng)血源干細胞制劑及其制備方法與應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢早衰是指女性在40周歲以前，除妊娠外，由某種原因?qū)е碌拈]經(jīng)，以血清雌激 素水平下降、促性腺激素水平升高為特征的疾病。據(jù)流行病學統(tǒng)計提示，女性40歲以前的發(fā) 病率為1 %，原發(fā)性必經(jīng)中卵巢早衰占 I〇 %~28 %，繼發(fā)性閉經(jīng)中卵巢早衰占4%~18 %，且 發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。卵巢早衰已成為當今婦女不孕癥的主要病因之一，嚴重影響患 者生活質(zhì)量、增加社會經(jīng)濟負擔。對于卵巢早衰的病因及發(fā)病機制較為復雜，尚不十分清 楚。卵巢早衰的治療主要采用激素治療，但是有臨床研究發(fā)現(xiàn)，以激素治療卵巢早衰會增加 乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及心血管疾患、中風的發(fā)病率。
[0003] 近年來間充質(zhì)干細胞移植治療成為臨床研究的熱點，為卵巢早衰的臨床治療提供 新的希望，并取得初步的療效。目前雖然已有用骨髓間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞治療 卵巢早衰的報道，并取得一定的療效，但是需要經(jīng)過骨穿刺才能獲取骨髓，對機體造成較大 的身體創(chuàng)傷，同時骨髓含有復雜的細胞成分，干細胞在其中的含量較低，需要較長時間的擴 增，并不是比較好的種子細胞;臍帶干細胞雖然免疫原性低，但是如果早期沒有儲存間充質(zhì) 干細胞，只能采用異體干細胞移植，存在一定的風險。
[0004] 近年來，日本科學家在女性經(jīng)血中發(fā)現(xiàn)了具有多向分化潛能的干細胞，該干細胞 可用于修復受損的心肌組織。2008年，美國科學家Patel等發(fā)現(xiàn)，從健康女性經(jīng)血中可分離 出來間充質(zhì)干細胞，這些細胞具有多向分化能力，并將該細胞命名為經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細 胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells ,MenSCs) aMenSCs屬于成體干細 胞的一種，具有來源豐富、有效成分含量豐富、收集過程無創(chuàng)、增殖和分化潛能巨大、無倫理 爭論及廢物回收利用等優(yōu)點。同時，研究表明，宮內(nèi)膜干細胞可以用于治療卵巢早衰、子宮 內(nèi)膜疾病、預防衰老等功能，有望成為較為理想的種子細胞。但目前并未見關(guān)于經(jīng)血源干細 胞制劑的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種經(jīng)血源干細胞制劑及其制備方 法與應用，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑干細胞存活率高，性質(zhì)穩(wěn)定，對卵巢早衰的治療 效果良好。
[0006] 本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑包括:經(jīng)血源干細胞、白蛋白和生理鹽水。
[0007] 生理鹽水是指生理學實驗或臨床上常用的滲透壓與動物或人體血漿的滲透壓相 等的氯化鈉溶液。本發(fā)明采用的生理鹽水是指質(zhì)量分數(shù)為0.9%的氯化鈉溶液，其與人體組 織的滲透壓一致，以其作為溶劑，不會對經(jīng)血源干細胞產(chǎn)生損傷。
[0008]白蛋白（又稱清蛋白，albumin，Alb)是血衆(zhòng)中含量最多的蛋白質(zhì)，占血衆(zhòng)總蛋白的 40%~60%。能夠維持血漿膠體滲透壓的恒定且承擔一定的運輸功能。以往的研究中表明， 白蛋白可能會誘導干細胞的分化。但本發(fā)明通過實驗證實，在經(jīng)血源干細胞制劑中添加白 蛋白可以為經(jīng)血源干細胞提供營養(yǎng)，提高經(jīng)血源干細胞在制劑中的存活率，且經(jīng)血源干細 胞制劑在低溫保藏一個月后仍未見分化的跡象。
[0009] 在一些實施例中，其中所述白蛋白的質(zhì)量分數(shù)為1%~5%。
[0010] 在一些實施例中，其中所述白蛋白的質(zhì)量分數(shù)為3%。
[0011] 在一些實施例中，其中所述白蛋白為人血清白蛋白。
[0012] 在一定范圍內(nèi)，白蛋白的添加量與經(jīng)血源干細胞的存活率成正相關(guān)。但過高的白 蛋白濃度會導致細胞因滲透壓失衡而失水變形，反而降低經(jīng)血源干細胞的存活率。實驗表 明，制劑中添加白蛋白的質(zhì)量分數(shù)為1 %~5%最有利于提尚細胞存活率。
[0013] 在本發(fā)明的實施例中，其中所述經(jīng)血源干細胞的密度為1〇4個/mL~IO5個/mL。
[0014] 在一些實施例中，其中所述經(jīng)血源干細胞的密度為IO4個/mL。
[0015] 在一些實施例中，其中所述經(jīng)血源干細胞的密度為IO5個/mL。
[0016] 制劑中，干細胞密度過大則存活率會因營養(yǎng)不足而大幅降低，而干細胞密度過小 也不利于存活率的保持，且過小的干細胞密度會導致用所需制劑量的增大。本發(fā)明通過實 驗證實，干細胞密度為IO 4個/mL~IO5個/mL時，干細胞存活率最高。
[0017] 在一些實施例中，所述經(jīng)血源干細胞的制備方法包括：
[0018] 步驟1:以PBS稀釋經(jīng)血后，分離單個核細胞，以PBS清洗后，接種至無血清培養(yǎng)基； [0019] 步驟2:37°C，體積分數(shù)為5%的⑶2，培養(yǎng)48h后，半量換液，72h后全量換液，之后每 3天全量換液1次，直至細胞生長至70 %~80 %匯合，傳代。
[0020] 在一些實施例中，無血清培養(yǎng)基為Lonza無血清培養(yǎng)基。
[0021] 經(jīng)血源干細胞分離自女性經(jīng)血，來源豐富，且屬于廢物利用，很好的解決了臍帶干 細胞或其他干細胞存在的倫理問題。經(jīng)血源干細胞的分離方法對其細胞活性的影響很大， 本申請采用的制備方法能夠最大限度的保護經(jīng)血源干細胞的活性。
[0022] 作為優(yōu)選，PBS稀釋經(jīng)血時，PBS與經(jīng)血的體積比為1:1。
[0023] 作為優(yōu)選，F(xiàn)icoll分離液與經(jīng)血的體積比為1:1。
[0024]作為優(yōu)選，單個核細胞的分離方式為離心分離，具體為，700g離心15min后，轉(zhuǎn)移上 清液，以PBS清洗2次后，再次離心取細胞沉淀，接種至無血清培養(yǎng)基。
[0025] 作為優(yōu)選，接種的密度為7 X IO5CelΙ/mL~8 X 105cel 1/mL。
[0026] 作為優(yōu)選，傳代具體為：以胰蛋白酶消化后，懸浮細胞接種于無血清培養(yǎng)基，繼續(xù) 培養(yǎng)。
[0027] 在一些實施例中，經(jīng)血源干細胞為為第3代~第5代的經(jīng)血源干細胞。
[0028] 第3代~第5代的經(jīng)血源干細胞能夠保持干細胞固有的分化潛能，不會出細胞凋亡 或衰退的現(xiàn)象，其狀態(tài)最佳，在適當?shù)臈l件下，可以迅速增長并分化。
[0029]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑的制備方法，包括:將白蛋白與生理鹽水混合后， 重懸經(jīng)血源干細胞，獲得經(jīng)血源干細胞制劑。
[0030]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑能夠很好的維持經(jīng)血源干細胞的活性和存活率， 在保存期間不會發(fā)生分化，因此，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑可以用于制備治療卵巢 早衰的藥物。
[0031]本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑在制備治療卵巢早衰的藥物中的應用。
[0032]在一些實施例中，經(jīng)血源干細胞制劑治療卵巢早衰的劑量為0.2mL/次~0.4mL/ 次。
[0033]在一些實施例中，經(jīng)血源干細胞制劑治療卵巢早衰的方法為注射，具體為0.2mL/ 次~0.4mL/次，注射的次數(shù)為2次，每日一次。
[0034] 本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑，包括:經(jīng)血源干細胞、白蛋白和生理鹽水。本發(fā) 明提供的經(jīng)血源干細胞制劑中，經(jīng)血源干細胞在白蛋白及生理鹽水的保護下，能夠維持良 好的存活率和活性，且不會啟動分化。實驗表明，本發(fā)明提供的經(jīng)血源干細胞制劑能夠?qū)⒔?jīng) 血源干細胞的存活率維持在99%以上，細胞大小均勻、形態(tài)均為梭型。(TC~4°C保存1個月 后，細胞仍保持著良好的形態(tài)，沒有出現(xiàn)體積變大等異?，F(xiàn)象，存活率仍保持在95%以上， 且經(jīng)表面抗原檢測，經(jīng)血源干細胞仍保持干細胞的特點，沒有發(fā)生分化，具有良好的活性。 以本申請?zhí)峁┑慕?jīng)血源干細胞制劑用于治療卵巢早衰能夠具有良好的治療效果，使用本發(fā) 明提供的經(jīng)血源干細胞制劑一周后，小鼠卵泡數(shù)量顯著(P〈〇.05)增加。
【附圖說明】
[0035]圖1示原代培養(yǎng)7天的經(jīng)血源干細胞，40 X ;
[0036] 圖2示原代培養(yǎng)7天的經(jīng)血源干細胞，100X。
【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明提供了一種經(jīng)血源干細胞制劑及其制備方法與應用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通 過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文的 方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。
[0038] 本發(fā)明采用的材料、儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
[0039] 下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：
[0040] 實施例1
[0041] 取經(jīng)檢驗合格的經(jīng)血，用相同體積的PBS溶液稀釋經(jīng)血形成經(jīng)血稀釋液;取隔層離 心管，加入經(jīng)血稀釋液一半體積的F i c 〇 11分離液，緩慢加入經(jīng)血稀釋液，之后7 0 0 g離心 15min;將上層溶液移至另一個新的離心管中，PBS清洗2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸離心后沉 淀，調(diào)整接種密度為7~8X 105/ml，接種至培養(yǎng)皿中，十字混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培