附子多糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及附子多糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶SOD、CAT、GSH?Px活性的藥物中的應(yīng)用；所述應(yīng)用還可以為附子多糖在制備降低組織中MDA含量的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次將附子多糖單體應(yīng)用在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中，制備得到的藥物能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
附子多糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于藥物學(xué)和制劑學(xué)領(lǐng)域，具體涉及附子多糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是危害人類(lèi)健康的主要疾病。隨著生活水平的提高和生活方式的改變，由AS所致的心腦血管疾病已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一，在我國(guó)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨向年輕化。美國(guó)、歐洲及日本死于該病者占死亡總數(shù)的50%左右。近年來(lái)該病的發(fā)生率在我國(guó)亦有明顯增加的趨勢(shì)。據(jù)尸檢結(jié)果，在40?49歲的人群中冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈粥樣硬化病變的檢出率分別為58.36%和88.31%，并隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加。
[0003]因此對(duì)于A(yíng)S發(fā)病機(jī)制及防治的研究一直是心、腦血管疾病研究的熱點(diǎn)。以往雖然人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到脂質(zhì)在內(nèi)皮下的浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞的增殖是AS發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的基本特征，并因此先后提出脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、中層平滑肌細(xì)胞增生學(xué)說(shuō)、血栓源學(xué)說(shuō)以及血流動(dòng)力學(xué)學(xué)說(shuō)，但是它們都不能對(duì)AS的發(fā)生機(jī)制提供滿(mǎn)意的解釋。近年來(lái)，“氧化應(yīng)激損傷機(jī)制學(xué)說(shuō)”逐漸為人們所接受，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高一方面可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，這被認(rèn)為是AS形成的始動(dòng)因素，內(nèi)皮損傷不僅導(dǎo)致血細(xì)胞的粘附聚集，而且通過(guò)激活核因子icB(nuclear factor Kappa B，NF_kB)引發(fā)系列炎癥細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞的炎癥損傷;另一方面氧化應(yīng)激水平增高可以氧化修飾體內(nèi)的低密度脂蛋白(LDL)，形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，被吞噬細(xì)胞吞入導(dǎo)致大量泡沫細(xì)胞形成，泡沫細(xì)胞凋亡或壞死后將脂質(zhì)釋放出來(lái)，形成粥樣斑塊的主要成分。目前認(rèn)為，AS既是一種慢性免疫炎癥性疾病，又是一種脂質(zhì)沉積的纖維增生性疾病。
[0004]基于A(yíng)S的機(jī)理研究，已開(kāi)發(fā)出多種治療藥物，主要有:(I)調(diào)整血脂類(lèi)抗AS藥物，包括他汀類(lèi)、貝特類(lèi)、煙酸類(lèi)藥物，其中他汀類(lèi)藥物因?yàn)榱己玫慕抵约翱寡?、抗氧化、減少泡沫細(xì)胞形成等作用可以穩(wěn)定/逆轉(zhuǎn)斑塊，在臨床上得以廣泛應(yīng)用。(2)血管調(diào)節(jié)類(lèi)藥物，包括抗血小板類(lèi)藥物、擴(kuò)張血管運(yùn)動(dòng)類(lèi)藥物，此類(lèi)藥物對(duì)AS斑塊中的脂質(zhì)沒(méi)有治療意義。(3)抗氧化劑類(lèi)藥物，包括丙丁酚等，此類(lèi)藥物抑制LDL氧化和改善AS的狀況仍處于研究階段。(4)正在研究的新型抗AS的藥物雖然較多，但真正理想的藥物并不多，大多數(shù)藥物價(jià)格昂貴，而且都存在一些不良反應(yīng)。就拿目前應(yīng)用最廣泛、療效最確切的他汀類(lèi)藥物來(lái)說(shuō)，會(huì)引起肝臟轉(zhuǎn)氨酶增高，長(zhǎng)期服藥肝功能損害的可能性更大，最為嚴(yán)重的副作用還有橫紋肌溶解，嚴(yán)重者引起患者死亡。
[0005]近年來(lái)，隨著對(duì)AS研究的深入，中藥在預(yù)防和治療AS的作用也日益受到重視。目前認(rèn)為，中藥主要從改善脂質(zhì)代謝，抗脂質(zhì)過(guò)氧化，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能等方面對(duì)基體進(jìn)行調(diào)節(jié)從而發(fā)揮對(duì)AS的治療作用。中藥材中活性多糖成分是近年來(lái)藥物開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)，多糖類(lèi)化合物通常沒(méi)有細(xì)胞毒性，不影響正常細(xì)胞功能，具有高效低毒的特點(diǎn)，是開(kāi)發(fā)藥物的重要來(lái)源。鑒于目前西醫(yī)藥在A(yíng)S治療上的局限性，因此發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢(shì)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，研究中藥單體在防止AS的作用及其機(jī)理，將具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供附子多糖在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明首次將附子多糖單體應(yīng)用在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中，制備得到的藥物能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供所述附子多糖的提取方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
附子多糖在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶SOD活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
[0011]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶CAT活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
[0012]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶GSH-Px活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選地，所述應(yīng)用為附子多糖在制備降低組織中MDA含量從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
[0014]上述附子多糖的應(yīng)用，所述附子多糖的制備方法如下:
S1:將附子粉碎，用乙醇進(jìn)行脫脂處理，然后用水提取并過(guò)濾；
S2:將步驟SI過(guò)濾所得殘?jiān)盟岬脷堅(jiān)嵋?，將所述殘?jiān)嵋号c步驟SI所得水提液合并、減壓濃縮并過(guò)濾；
S3:將步驟S2所得濾液離心得沉淀物，對(duì)所述沉淀物進(jìn)行脫蛋白處理；
S4:將步驟S3脫蛋白后的提取物置于水中透析，然后醇析、洗滌、干燥，即得粗附子多糖。
[0015]優(yōu)選地，步驟SI中，所述乙醇的體積分?jǐn)?shù)為95%，所述水的溫度為90?100°C，所述提取時(shí)間為2小時(shí)。
[0016]優(yōu)選地，步驟S2中，合并提取液用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器減壓濃縮。
[0017]優(yōu)選地，步驟S3中，選用體積比為5:1的三氯甲烷與正丁醇混合液對(duì)所述沉淀物進(jìn)行脫蛋白處理。
[0018]優(yōu)選地，步驟S4中，將脫蛋白后的提取物置于雙蒸餾水中透析三天，再加入3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇析，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，然后再40°C進(jìn)行真空干燥，即得粗附子多糖。
[0019]—種用于預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，所述藥物中含有上述附子多糖。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明首次將附子多糖單體引入對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治研究中，先用最接近AS病理的自發(fā)性AS動(dòng)物模型，以AS氧化應(yīng)激損傷機(jī)制為切入點(diǎn)，研究附子多糖抗AS的有效性，研究具有較強(qiáng)的可行性，較高的可信性和較好的研究前景。本研究將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物平臺(tái)相結(jié)合，研究中藥單體-附子多糖的藥理學(xué)效應(yīng)，為重要單體防治AS的研究提供新的思路和有效手段。本發(fā)明將附子多糖應(yīng)用在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中，制備得到的藥物能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]圖1為動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠主動(dòng)脈根部進(jìn)行油紅O染色示意圖；
圖2為動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠胸腹主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色示意圖；
圖3為不同劑量的小鼠主動(dòng)脈根部進(jìn)行油紅O染色的示意圖；
圖4為不同劑量的小鼠胸腹主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法:以下各實(shí)施例中的apoE基因敲除小鼠購(gòu)自沒(méi)過(guò)Jackson實(shí)驗(yàn)室，所使用原料、助劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為可從常規(guī)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)等商業(yè)途徑得到的原料和助劑。
[0023]實(shí)施例1附子多糖的提取
取干燥的附子100克粉碎成細(xì)小顆粒，用95%的乙醇進(jìn)行脫脂處理，然后用I升90?100°(:的雙蒸餾水提取2小時(shí)并過(guò)濾。殘?jiān)^續(xù)用750ml水提取I小時(shí)。合并水提取液用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器減壓(50 °C )濃縮并過(guò)濾。在4°C的條件下將濾液與4倍體積的95%乙醇混合，離心5000轉(zhuǎn)20分鐘。把沉淀物再溶于300ml水中，用60ml體積比為5:1的三氯甲烷和正丁醇的混合液進(jìn)行脫蛋白處理三次。將脫蛋白后的提取物置于雙蒸餾水中透析三天，再加入3倍體積95%乙醇進(jìn)行醇析。用無(wú)水乙醇洗滌沉淀，然后再40°C進(jìn)行真空干燥，得到粗多糖備用。
[0024]實(shí)施例2動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立
選用apoE基因敲除小鼠，采用高脂動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，該高脂動(dòng)物飼料由普通小鼠飼料加入脂肪和膽固醇(含21%脂肪和0.15%膽固醇，w/w)制成，輻射消毒。小鼠在學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心喂養(yǎng)。
[0025]將apoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、辛伐他汀預(yù)防組、辛伐他汀預(yù)防高(200mg)、中(lOOmg)、低(50mg)劑量組和附子多糖預(yù)防組、附子多糖治療高(200mg)、中(10mg)、低(50mg)劑量組9組動(dòng)物。附子多糖及辛伐他汀各組，動(dòng)物均選擇灌胃給藥方式，對(duì)照組給以同等劑量的飲用水灌胃，每天I次，12周結(jié)束實(shí)驗(yàn)。附子多糖預(yù)防組、辛伐他汀預(yù)防組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前6周灌胃給藥;附子多糖治療組、辛伐他汀治療組自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至第7周給以同等劑量飲用水灌胃，從第7周開(kāi)始灌胃給藥。
[0026]圖1為ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部進(jìn)行油紅O染色，肉眼觀(guān)察可見(jiàn)ApoE-/-小鼠形成嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。
[0027]圖2為ApoE-/-小鼠的胸腹主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，肉眼觀(guān)察可見(jiàn)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓部有明顯的粥樣斑塊形成，呈片狀分部，染色較深，且在胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈部分也存在顆粒狀的粥樣斑塊，染色較淺。
[0028]實(shí)施例3附子多糖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用油紅O染色檢測(cè)粥樣斑塊面積:
將動(dòng)物麻醉后斷頭處死，顯微鏡下解剖出主動(dòng)脈，10%甲醛固定24小時(shí)后，用0.3%油紅O染色液染色，60%異丙醇脫去未染色的油紅O，蘇木素復(fù)染，1%HC1分色及返藍(lán)。
[0029]顯微鏡觀(guān)察主動(dòng)脈根部和主動(dòng)脈弓處紅色動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，應(yīng)用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)分析統(tǒng)計(jì)主動(dòng)脈粥樣斑塊面積占主動(dòng)脈內(nèi)膜總面積的百分比。
[0030]預(yù)實(shí)驗(yàn)選用apoE基因敲除小鼠，置于安靜清潔環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度控制在24±2，定時(shí)給予清潔飲水和專(zhuān)用飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后，無(wú)不良反應(yīng)，飲食、飲水正常，將小鼠分別稱(chēng)重后隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、附子多糖低劑量預(yù)防組、附子多糖高劑量預(yù)防組，每組6只?？瞻讓?duì)照組給予常規(guī)飲食，其它各族給予高脂飼料。
[0031]說(shuō)明書(shū)附圖3為各組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部進(jìn)行油紅O染色，圖3中左圖為對(duì)照組，中圖為附子多糖低劑量組，右圖為附子多糖高劑量組。由圖可知，肉眼觀(guān)察可見(jiàn)附子多糖低劑量組和高劑量組可減輕主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，以高劑量組更為明顯。
[0032]說(shuō)明書(shū)附圖4為各組ApoE-/-小鼠的胸腹主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，圖3中左圖為對(duì)照組，中圖為附子多糖低劑量組，右圖為附子多糖高劑量組。由圖可知，肉眼觀(guān)察可見(jiàn)附子多糖低劑量組和高劑量組能減輕ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈弓部粥樣斑塊形成及胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈部分粥樣斑塊形成，以高劑量組更為明顯。
[0033]實(shí)施例4附子多糖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化防治作用的機(jī)制研究
(I)附子多糖對(duì)小鼠氧化應(yīng)激損傷的影響
ELI SA檢測(cè)各組小鼠SOD、CAT、GSH-PX活力。
[0034](2 )附子多糖對(duì)小鼠腹腔游離巨噬細(xì)胞中ox-LDL的影響 DiL熒光標(biāo)記檢測(cè)ox-LDL:
將小鼠腹腔提取的巨噬細(xì)胞經(jīng)前處理后接種于激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)專(zhuān)用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2小時(shí)后，加入終濃度為lmg/ml的DiL-ox_LDL，37 °C孵育4小時(shí)。
[0035]用激光掃描共聚焦顯微鏡照相，激發(fā)波和發(fā)射波分別置于520nm和580nm。運(yùn)用IPP軟件測(cè)定細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度，反映巨噬細(xì)胞內(nèi)ox-LDL濃度。
[0036](3 )附子多糖對(duì)NF-κΒ通路的炎癥因子的影響
DNA結(jié)合活性檢測(cè)檢測(cè)各組NF-κΒ的活性，ELISA、RT-PCR、Western blot檢測(cè)TNF_a、IL_2、IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)。
[0037](4)附子多糖對(duì)小鼠血脂代謝的影響
ELI SA檢測(cè)各組小鼠血脂水平的差異，包括TC、TL、LDL、HDL;肝臟LDL-R的表達(dá)及定量研究等。
[0038]實(shí)施例5附子多糖安全性評(píng)價(jià)
小鼠急性毒性(LD50)試驗(yàn)。小鼠給藥前12小時(shí)內(nèi)禁食不禁水，隨機(jī)分為7組，每組10只小鼠。實(shí)驗(yàn)中以灌胃方式對(duì)小鼠進(jìn)行給藥，根據(jù)預(yù)防試驗(yàn)測(cè)得的LDlOO和LDO劑量，按照寇氏法將相鄰兩組劑量之比(T )設(shè)定為1.246，第7組為空白對(duì)照組，給以等體積溶媒溶液。給藥后24小時(shí)內(nèi)觀(guān)察小鼠攝食、行為、中毒癥狀，統(tǒng)計(jì)每組死亡動(dòng)物數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.附子多糖在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶SOD活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶CAT活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為附子多糖在制備提高組織抗氧化酶GSH-Px活性從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為附子多糖在制備降低組織中MDA含量從而預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1?5所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，所述附子多糖的制備方法如下: SI:將附子粉碎，用乙醇進(jìn)行脫脂處理，然后用水提取并過(guò)濾； S2:將步驟SI過(guò)濾所得殘?jiān)盟岬脷堅(jiān)嵋海瑢⑺鰵堅(jiān)嵋号c步驟SI所得水提液合并、減壓濃縮并過(guò)濾； S3:將步驟S2所得濾液離心得沉淀物，對(duì)所述沉淀物進(jìn)行脫蛋白處理； S4:將步驟S3脫蛋白后的提取物置于水中透析，然后醇析、洗滌、干燥，即得粗附子多糖。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，步驟SI中，所述乙醇的體積分?jǐn)?shù)為95%，所述水的溫度為90?1000C，所述提取時(shí)間為2小時(shí)。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，步驟S2中，合并提取液用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器減壓濃縮。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述附子多糖的應(yīng)用，其特征在于，步驟S3中，選用體積比為5:1的三氯甲烷與正丁醇混合液對(duì)所述沉淀物進(jìn)行脫蛋白處理。10.—種用于預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物，其特征在于，所述藥物中含有權(quán)利要求1?9所述附子多糖。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK106074593SQ201610526606
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】劉穎, 廖麗貞, 段新芬
【申請(qǐng)人】廣東藥科大學(xué)