本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種體外誘導人胚胎干細胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的方法。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜變性疾病是全球首要的致盲原因。在該疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)的損傷和功能異常導致光感受器細胞變性，最終影響病人視力直至失明。由于RPE和光感受器細胞的不可再生，至今在臨床上人缺乏對這類疾病的有效治療措施。相較于其他治療方法，細胞治療對視網(wǎng)膜退行性疾病的治療有更大的前景。

由于胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)具有無限增殖和分化為各種細胞的能力，因此可以作為理想的移植細胞的來源。已有報道證實ESCs來源的RPE細胞應用于人類視網(wǎng)膜退行性疾病臨床研究的可行性與安全性。那么，一套穩(wěn)定有效的體外hESCs向RPE細胞分化的方法對視網(wǎng)膜退行性疾病的治療和制藥研究顯得尤為重要。

在過去的十幾年間，多種方法被報道可以控制胚胎干細胞向視網(wǎng)膜色素上皮細胞分化，并且在多種動物病變模型中發(fā)揮保護作用。但是這些報道的方法都各有其優(yōu)缺點，耗時長，方法繁瑣，批次間差異大和細胞得率低等問題依舊存在。

因此，需要一種誘導hESCs向RPE細胞分化的方法，不僅可以得到成熟的有功能的RPE細胞，而且能夠做到方法簡單，時間快捷，可重復性強和細胞得率高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種體外高效誘導人胚胎干細胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種體外高效誘導人胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium,RPE)的方法，包括以下步驟：

A、將人胚胎干細胞(hESCs)接種到飼養(yǎng)層細胞中，加入干細胞完全培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)4-5天并定期換液；

b、去除分化細胞后用酶處理人胚胎細胞成小團塊并接種于培養(yǎng)皿，加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細胞因子，懸浮培養(yǎng)3天形成類胚體；

c、按照一定的密度將類胚體接種到貼壁培養(yǎng)皿，加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細胞因子，貼壁培養(yǎng)并定期換液11天；

d、更換為視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)2周，然后用酶處理細胞并1：2傳代，接種到貼壁培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)4周，即可得到100％純化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞。

優(yōu)選地，步驟a中所述飼養(yǎng)層細胞為X射線處理小鼠胚胎成纖維細胞。步驟a中所述干細胞完全培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/ml。所述達到融合狀態(tài)為每天換液至細胞達到80％～90％的融合。

優(yōu)選地，步驟b中所述去除分化細胞是用玻璃針挑除分化的干細胞；所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述小團塊為20～50個細胞的細胞團塊；所述培養(yǎng)皿為不貼壁的細菌培養(yǎng)皿。步驟b中所述分化培養(yǎng)基成分為：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積混合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，N2體積含量為1％，B27體積含量為1％，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L。步驟b中所述特定的細胞因子為CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1與PJ34，各細胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/ml；IGF1：5ng/ml，PJ34：3μM。

優(yōu)選地，步驟c中所述一定的密度為10個類胚體/cm²；所述貼壁培養(yǎng)皿為300ug/ml matrigel包被的細胞培養(yǎng)皿。步驟c中所述特定的細胞因子為CKI-7、 SB431542、Noggin、IGF1與PJ34，各細胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/ml；IGF1：10ng/ml，PJ34：3μM。

優(yōu)選地，步驟d中所述視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述酶處理為0.25％胰酶處理10分鐘；所述貼壁培養(yǎng)基為300ug/ml matrigel包被的細胞培養(yǎng)皿；100％純化的視網(wǎng)膜色素上皮細胞為整皿的單層視網(wǎng)膜色素上皮樣細胞，該細胞呈鵝卵石樣形態(tài)，有色素積累。

優(yōu)選地，各步驟中所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進行。

目前文獻報道的體外誘導hESCs向RPE分化的方法不僅耗時長(8周到數(shù)月不等)，而且獲得的RPE細胞往往有其它分化細胞混合，需要人工挑取含有色素的RPE細胞進行RPE的純化。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明通過添加一定的小分子組合刺激，定向誘導人胚胎干細胞向RPE方向分化，本發(fā)明方法大大縮短了RPE細胞分化的時間，本發(fā)明分化時間為8周左右。而常規(guī)的自主分化的方法向多種方向分化，不僅分化時間長，目的細胞得率也低。

2、本發(fā)明方法提高了hESCs向RPE分化的純度，經(jīng)過6-8周的分化，經(jīng)過一次傳代可獲得將近100％的RPE細胞。在常規(guī)的自主分化方法中，只有少部分細胞分化為RPE細胞，因而需要人工挑選的方法將黑色的RPE細胞從混合的細胞分離并擴增。本發(fā)明定向的將全部細胞向RPE分化，最終得到100％的RPE細胞，不需要機械分離。

3、本發(fā)明方法簡單，可重復性強，細胞率高，本發(fā)明為人胚胎干細胞定向誘導分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞提供指導和新的途徑。

附圖說明

圖1為本發(fā)明hESCs及分化3天和7天細胞的示意圖；

圖2為本發(fā)明hESCs分化細胞經(jīng)一次傳代后所得純的RPE細胞圖；

圖3為本發(fā)明分化的RPE細胞及免疫熒光鑒定示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例

本實施例為體外高效誘導hESCs分化為RPE細胞的方法。

本實施例中，所述誘導分化包括如下步驟：

a.將hESCs接種到飼養(yǎng)層細胞中，加入干細胞完全培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)并定期換液至細胞達到融合；

本步驟中所述hESCs為細胞系H1，飼養(yǎng)層細胞為X射線處理小鼠胚胎成纖維細胞；所述干細胞完全培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細胞生長因子，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L，成纖維細胞生長因子濃度為4ng/ml，培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進行，所述hESCs培養(yǎng)4-5天后并每天換液的狀態(tài)如圖1A。

b.去除分化細胞后用酶處理hESCs成小團塊并接種于培養(yǎng)皿，加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細胞因子，懸浮培養(yǎng)3天形成類胚體；

本步驟中所述去除分化細胞是用玻璃針挑除分化的干細胞；所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機械吹打；所述小團塊為20～50個細胞的細胞團塊；所述培養(yǎng)皿為不貼壁的細菌培養(yǎng)皿；所述分化培養(yǎng)基成分為：Neurobasal medium和DMEM/F12等體積混合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，N2體積含量為1％，B27體積含量為1％，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；特定的細胞因子為CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1與PJ34，各細胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：1μg/ml；IGF1：5ng/ml，PJ34：3μM，培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進行，懸浮培養(yǎng)3天后形成類胚體，如圖1B。

c.按照一定的密度將類胚體接種到貼壁培養(yǎng)皿，加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細胞因子，放置培養(yǎng)并定期換液11天；

本步驟中所述一定的密度為10個類胚體/cm²；所述貼壁培養(yǎng)皿為100ug/ml matrigel包被的細胞培養(yǎng)皿；特定的細胞因子為CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1 與PJ34，各細胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為：CKI-7：5μM，SB431542：5μM，Noggin：10μg/ml；IGF1：10ng/ml，PJ34：3μM。類胚體接種4天后形成如圖1C所示的神經(jīng)花環(huán)樣結(jié)構(gòu)。

d.更換為視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)2周，然后用酶處理細胞并1：2傳代，接種到貼壁培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)4周，即可得到純化視網(wǎng)膜色素上皮細胞，如圖2；

本步驟中所述視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積含量為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述酶處理為0.25％胰酶處理10分鐘；所述貼壁培養(yǎng)基為100ug/ml Matrigel包被的細胞培養(yǎng)皿；所述100％純化視網(wǎng)膜色素上皮細胞為整皿的單層視網(wǎng)膜色素上皮樣細胞，該細胞呈鵝卵石樣形態(tài)，有色素積累，如圖3A。

進一步對人ESCs分化來源的RPE細胞進行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)人ESCs分化來源的RPE細胞表達RPE細胞的前體基因Pax6和MITF，也表達成熟的RPE細胞相關(guān)基因如Cralbp，Bestrophin和ZO-1，如圖3B-F。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制。盡管參照較佳實施案例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或這等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。