本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液及其應用。

背景技術：

視網膜變性疾病是全球首要的致盲原因。在該疾病中，視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)的損傷和功能異常導致光感受器細胞變性，最終影響病人視力直至失明。由于RPE和光感受器細胞的不可再生，至今在臨床上缺乏對這類疾病的有效治療措施。

恢復視網膜變性疾病病人視力的最根本和最理想的手段就是用正常的細胞替代視網膜中受損的細胞。目前，關于視網膜變性疾病的細胞治療，已取得了一些進展，比如人胚胎干細胞(human embryonic stem cell,hESC)來源的RPE細胞移植在治療RCS(Royal College of Surgeons)大鼠視網膜變性研究中獲得了成功。最近，有研究組首次將hESC來源的RPE細胞移植于兩名視網膜變性病人眼內。雖然術后4個月病人視力并沒有非常顯著的提高，與人類的要求還有很大差距，但移植后對宿主眼無副作用，此項研究首次證實了hESC來源的RPE細胞應用于人類視網膜變性疾病的臨床研究的可行性和安全性。該結論讓人欣喜，hESC來源的RPE細胞移植將會成為視網膜移植領域的熱點，將會逐步由實驗室走上臨床。應該看到這項技術還未能在人體開展全面研究，距離人類的要求還有很大差距，移植后達到較好的視力改善將是未來研究的重點，也是目前國際生物醫(yī)學研究領域的熱門課題和重要挑戰(zhàn)之一。

那么，臨床上用hESC來源的RPE細胞移植治療視網膜變性疾病，效果并不理想的原因可能是因為在視網膜變性疾病中，RPE細胞和感光細胞都發(fā)生了變性，RPE細胞的移植能替代患者病變的RPE細胞，但由于移植的RPE細胞在進入宿主后需要一定的時間去遷移、整合入宿主殘存的RPE細胞中，所以，外源的RPE細 胞發(fā)揮作用的時間要晚于移植時間，這樣對于移植時正在發(fā)生的感光細胞變性的保護作用不大。所以，單純移植RPE細胞可能不足以很好地治療視網膜變性。

因此，需要一種移植RPE細胞的方法，一方面能夠改善移植細胞的微環(huán)境，促進移植細胞的整合，遷移并替代損傷死亡的細胞；另一方面能夠抑制宿主細胞的死亡，為移植細胞發(fā)揮作用爭取時間；最終，能夠更好的抑制視網膜退行性病變，恢復病人的視覺功能。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液及其應用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液，其特征在于，所述的細胞懸液為單細胞懸液，其含有分子化合物PJ34以及視網膜色素上皮細胞，所述的分子化合物PJ34濃度為0.3μM，所述的視網膜色素上皮細胞的濃度為1～2×10⁵個細胞/5微升。

所述的細胞懸液的溶劑為磷酸鹽緩沖液。

所述的視網膜色素上皮細胞為來源于干細胞的視網膜色素上皮細胞。

所述的視網膜色素上皮細胞具體為ARPE19細胞。

所述的細胞懸液為視網膜退行性疾病移植用細胞懸液。

所述的細胞懸液用于制備治療視網膜退行性疾病的藥劑。

所述的視網膜退行性疾病主要指RPE損傷導致的視網膜變性。

本發(fā)明為考察含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液對視網膜退行性疾病的治療效果，將含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液進行視網膜下腔注射移植，通過形態(tài)學和功能學檢測含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液移植對模型大鼠視網膜病變進程的干預作用。具體方案如下：

a、用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE19細胞；

b、GFP標記ARPE19細胞；

c、向視網膜退行性病變模型大鼠眼內移植PJ34和標記的ARPE19細胞；

d、在不同時間點分別通過形態(tài)學和功能學檢測聯合治療對模型大鼠視網膜病變進程的干預作用。

優(yōu)選的，步驟a中所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進行；所述完全培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、血清、青霉素及鏈霉素，其中血清體積含量為10％，青霉素濃度為100U/ml，鏈霉素濃度為100ug/ml。

優(yōu)選的，步驟b中所述標記為用病毒lenti包裝的GFP感染ARPE19細胞。

優(yōu)選的，步驟c中所述視網膜退行性病變大鼠模型為出生21天的RCS大鼠，其RPE細胞Mertk基因突變導致視網膜退行性病變；所述移植為視網膜下腔注射的方法；所述PJ34和標記的ARPE19細胞為將PJ34(0.3mM)溶解在標記的ARPE19細胞的單細胞懸液中，細胞密度為1～2×10⁵個細胞/5微升，溶劑采用磷酸鹽緩沖液，移植時大鼠每只眼睛注射5微升細胞懸液。

優(yōu)選的，步驟d中所述不同時間點是指細胞治療后的每周進行檢測；所述形態(tài)學檢測為通過石蠟切片和冰凍切片以及免疫熒光染色和蘇木素伊紅染色檢測視網膜核層厚度和視網膜各細胞的變化；所述功能學檢測為視覺電生理檢測，測定大鼠的視覺功能。

與現有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明首次發(fā)現PJ34可抑制由RPE變性所引起的感光細胞的變性。PJ34作為PAR活性的特異性抑制劑，可以有效抑制感光細胞的PAR活性進而抑制其凋亡。

2、在移植RPE細胞治療視網膜變性的同時，利用PJ34抑制或延緩感光細胞變性，有效延緩了視網膜變性進程。由于RPE細胞中沒有Par活性，因此，本發(fā)明使用的PJ34對其沒有作用，不會產生負面影響。

3、本發(fā)明中分子化合物PJ34濃度為0.3μM，該濃度是通過濃度梯度實驗檢測得到的，為最少的試劑濃度發(fā)揮最大的保護作用，如果濃度降低，則其保護作用減弱；若上調，保護作用不會加大。

4、本發(fā)明為臨床利用細胞移植技術治療視網膜變性提供新的思路和理論依據，推動細胞移植治療視網膜變性疾病的轉化科學研究。

附圖說明

圖1為ARPE19細胞和GFP標記圖；

圖2為本發(fā)明RCS大鼠與正常SD大鼠在視覺功能及視網膜核層對比圖、視網膜下腔注射方法示意圖；

圖3為ARPE19和PJ34聯合應用對視網膜凋亡的作用；

圖4為本發(fā)明聯合治療分別在視覺功能與核層厚度對退行性病變的干預示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。

實施例

本實施例考察聯合應用PJ34和ARPE19對視網膜退行性疾病進行細胞治療的效果。

本實施例中，所述聯合應用為使用含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液，通過視網膜下腔注射的方法進行移植。其中所述細胞懸液為單細胞懸液，其含有分子化合物PJ34以及視網膜色素上皮細胞，所述分子化合物PJ34濃度為0.3μM，所述的視網膜色素上皮細胞的濃度為1～2×10⁵個細胞/5微升。

本實施例中，考察含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液對視網膜退行性疾病的治療效果的具體方案，包括如下步驟：

a.用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE19細胞，如圖1A；完全培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎培養(yǎng)基、血清、青霉素及鏈霉素，其中血清體積含量為10％，青霉素濃度為100U/ml，鏈霉素濃度為100ug/ml。

b.用病毒lenti包裝的綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)感染ARPE19細胞，得到GFP標記的ARPE19細胞，圖1B；

c.向視網膜退行性病變模型大鼠眼內移植含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液；

本步驟中所述視網膜退行性病變大鼠模型為出生21天的RCS大鼠，其RPE細胞Mertk基因突變導致視網膜退行性病變，和正常的SD大鼠相比，表現為視覺功能在出生3周后開始下降，如圖2A；通過免疫熒光染色鑒定，RCS大鼠Recoverin陽性的外核層細胞減少，核層厚度降低，如圖2B，圖2B中，ONL表示外核層(outer nuclear layer)、INL表示內核層(inner plexiform layer)，GCL表示神經節(jié)細胞層(ganglion cell layer)。所述移植采用的是視網膜下腔注射的方法，如圖2C；所述含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液為將PJ34(0.3μM)溶解在ARPE19細胞的單細胞懸液中，細胞密度為1～2×10⁵個細胞/5微升，每只眼睛注射2微升，此 為聯合移植組；再以單獨細胞溶劑PBS、僅含有ARPE19細胞的細胞懸液，以及PJ34作為對照組，分別通過視網膜下腔注射的方法移植的模型大鼠中。

d.移植兩周后，聯合移植組(即含PJ34和視網膜色素上皮細胞的細胞懸液移植)比ARPE19單獨移植組中感光細胞的凋亡明顯減少，見圖3；

e.在不同時間點分別通過形態(tài)學和功能學檢測聯合治療對模型大鼠視網膜病變進程的干預作用；

本步驟中所述不同時間點是指細胞治療后的1周直到第6周；分別在視覺功能與核層厚度兩方面進行檢測。在移植治療1周后，聯合移植組比單純ARPE19移植組的視網膜感光細胞存活及視功能方面有明顯改善，并且這種改善在治療6周后仍存在，同時核層厚度統(tǒng)計在聯合移植組與單獨移植相比有更好的保護，如圖4所示。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制。盡管參照較佳實施案例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或這等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的宗旨和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。