一種用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC?RPE)的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液包含：體積分?jǐn)?shù)為96～97.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為1的非必需氨基酸(NEAA)、體積分?jǐn)?shù)為1的L?谷氨酰胺、體積分?jǐn)?shù)為0.5～2的N2添加劑、組分a和組分b。本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)液的制備方法，以及使用所述培養(yǎng)液培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC?RPE)的方法。與現(xiàn)有的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基配方簡單，成本較低，不涉及任何倫理問題，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。
【專利說明】
一種用于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的培養(yǎng) 基，所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞包括ARPE-19細(xì)胞系，原代分離的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，人胚 胎干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC-RPE)，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上 皮細(xì)胞(hiPSC-PRE)和多能干細(xì)胞來源的RPE。具體地，本發(fā)明涉及使用無動(dòng)物源性、化學(xué)成 分完全明確的培養(yǎng)基在維持RPE細(xì)胞的形態(tài)和功能，促進(jìn)細(xì)胞增殖方面，以及進(jìn)行規(guī)?；瘮U(kuò) 增和任何形式臨床使用中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 視網(wǎng)膜色素變性(RP)，年齡相關(guān)性黃斑病變(AMD)，先天性黃斑變性(SMD)等視網(wǎng) 膜相關(guān)疾病嚴(yán)重影響著人類的生活質(zhì)量，但是目前臨床上仍缺乏有效的治療方法。發(fā)生該 類疾病的主要原因是RPE對視細(xì)胞外節(jié)膜盤的吞噬、消化功能衰退，致使盤膜崩解物殘留、 形成一層障礙物，妨礙營養(yǎng)物質(zhì)從脈絡(luò)膜到視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移，從而引起視細(xì)胞的進(jìn)行性營養(yǎng)不 良及逐漸變性和凋亡，最終導(dǎo)致整個(gè)脈絡(luò)膜微循環(huán)異常，可能波及黃斑、視神經(jīng)等損傷，影 響患者視力，最終導(dǎo)致患者失明。
[0003] RPE細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜最外部靠近脈絡(luò)膜層的連續(xù)單層細(xì)胞，它們在維護(hù)視網(wǎng)膜 細(xì)胞生存環(huán)境和功能代謝上發(fā)揮著不可或缺的功能。2012年，美國0CAT公司（前用名： Advanced Cell Technology)首次在臨床試驗(yàn)中利用hESC-RPE治療AMD和SMD患者，并在后 續(xù)報(bào)道中證明了 hESC-RPE在移植中期是安全和有效的。
[0004] APRE-19細(xì)胞是一種因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致端粒酶激活，進(jìn)而永生化的RPE細(xì)胞系。在 很多研究中，實(shí)驗(yàn)者通常會(huì)選擇APRE-19作為RPE類細(xì)胞的陽性對照組，或者先利用APRE-19 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的摸索。
[0005] 近年來，隨著越來越多的干細(xì)胞類臨床試驗(yàn)的開展，為了推進(jìn)干細(xì)胞類產(chǎn)品的臨 床應(yīng)用，人們一直在不斷嘗試改進(jìn)細(xì)胞的培養(yǎng)體系。期望獲得無動(dòng)物源性、化學(xué)成分明確的 培養(yǎng)體系。起初，RPE類細(xì)胞(如ARPE-19，人胎兒RPE細(xì)胞)是以含有胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)。隨著替代胎牛血清的血清替代物(K0SR)的問世，原有的FBS成分逐漸被K0SR所替 代。但是，K0SR依然是取源于動(dòng)物，且化學(xué)成分至今尚未公開，為hESC-RPE的臨床應(yīng)用帶來 了安全隱患。
[0006] 綜上所述，RPE類細(xì)胞具有較大的臨床應(yīng)用潛能，如治療RP和AMD，而這些都需要大 量的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。因此，當(dāng)前亟需可用于培養(yǎng)RPE類細(xì)胞的無動(dòng)物源成分、化學(xué) 成分明確的培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述需求，本發(fā)明首次提出一種無動(dòng)物源性、化學(xué)成分明確的RPE類細(xì)胞培養(yǎng) 基。
[0008] 本發(fā)明的目的就是提供一種用于培養(yǎng)RPE類細(xì)胞的培養(yǎng)基，并且該培養(yǎng)基無動(dòng)物 源性，化學(xué)成分明確，從而為RPE類細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定良好的基礎(chǔ)。
[0009] 本發(fā)明提供了 一種用于培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC-RPE)的培養(yǎng)液，其特征在 于，所述培養(yǎng)液包含：體積分?jǐn)?shù)為96~97.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為1的非必需氨基酸 (NEAA)、體積分?jǐn)?shù)為1的L-谷氨酰胺、體積分?jǐn)?shù)為0.5~2的N2添加劑、組分a和組分b;
[0010] 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自 MEM、a-MEM、1640、DMEM、F10、F12、D/F12、NeurobasGP knokcout DMEM中的一種;優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓為280~300Pa;
[0011] 所述組分a由在培養(yǎng)液中的濃度為1 -100mg/L的L-肉毒堿、1 -100mg/L的乙醇胺、 10-20011^凡的腐胺、0.01-0.111^八的亞硒酸鈉、1-511^凡亞麻酸、1-511^凡的亞油酸、5-1011^/ L的轉(zhuǎn)鐵蛋白組成；
[0012] 所述組分b由在培養(yǎng)液中的終濃度為10-500mg/L的維生素 C酸或10-500mg/L的維 生素 C酸磷酸鎂鹽、0.5-50mg/L的還原型谷胱甘肽組成。
[0013] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液還包含組分c，所述組分c選自表皮 生長因子EGF、胰島素、Rock通路選擇性抑制劑中的一種或多種；其中，所述表皮生長因子 EGF在培養(yǎng)液中的終濃度為10~20yg/L、胰島素在培養(yǎng)液中的終濃度為1~100mg/L、R〇ck通 路選擇性抑制劑在培養(yǎng)液中的終濃度為1~1 〇〇μΜ，優(yōu)選為5~1 ΟμΜ;所述Rock通路選擇性抑 制劑為HA100或Y27632。
[0014] 其中，各生長因子添加體積為微量體積，不影響總培養(yǎng)液體積。
[0015]在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液中N2添加劑由溶于去離子水或Mili Q水的1~1 〇mg/ml的動(dòng)物源胰島素或人重組胰島素、1~200mg/ml的人轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.1~lmg/ ml的亞硒酸鈉、1~20mg/ml的腐胺和0.1~10mg/ml的孕酮組成。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含1000U/mL的青霉素和100- 500mg/L鏈霉素。
[0017] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
[0018] 1)將組分a的成份溶于滅菌去離子水中配制成儲(chǔ)液a，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a為50X儲(chǔ) 液;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a使用0.22μπι的濾器過濾；
[0019] 2)將在培養(yǎng)液中的終濃度為10-500mg/L的維生素 C酸或維生素 C酸/維生素 C酸磷 酸鎂鹽與在培養(yǎng)液中的終濃度為〇.5-50mg/L的還原型谷胱甘肽混合后溶于滅菌去離子水 中配制成儲(chǔ)液b，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液b為1000 X儲(chǔ)液;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液b使用0.22μπι的濾器 過濾；
[0020] 3)提供適當(dāng)?shù)娜萜?，根?jù)培養(yǎng)基的終體積，按照體積比向所述容器中加入所述終 體積的1 %的非必需氨基酸、1 %的L-谷氨酸、0.5~2 %的Ν2添加劑，最后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基至 體積達(dá)到所述終體積;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a使用0.22μπι的濾器過濾；
[0021] 4)根據(jù)步驟3)所述的終體積，向所述容器中加入適量的儲(chǔ)液a和儲(chǔ)液b，即得所述 培養(yǎng)液。
[0022] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括加入1000U/mL的青霉素和100- 500mg/L的鏈霉素。
[0023] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法為：
[0024] (1)按照在培養(yǎng)液中的終濃度為2mg/L的L-肉毒堿、lmg/L的乙醇胺、16mg/L的腐 胺、0.016mg/L的亞硒酸鈉、lmg/L的亞油酸、lmg/L的亞麻酸、5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例制備 50 X的儲(chǔ)液a;優(yōu)選地，使用0.22μηι的濾器過濾；
[0025] (2)按照10-500mg/L的維生素 C酸或10-500mg/L的維生素 C酸/維生素 C酸磷酸鎂 鹽、lmg/L還原型谷胱甘肽的比例制備1000 X的儲(chǔ)液b;
[0026] (3)根據(jù)配制的培養(yǎng)基的終體積，按體積分?jǐn)?shù)加入所述終體積1 %的非必需氨基 酸、1 %的L-谷氨酸、0.5 % -2 %的N2添加劑、加入knockout DMEM至所述終體積；
[0027] (4)加入相應(yīng)量的儲(chǔ)液a;
[0028] (5)加入相應(yīng)量的儲(chǔ)液b，既得培養(yǎng)基；
[0029] 優(yōu)選地，以5M氯化鈉將所述培養(yǎng)基的滲透壓調(diào)制至280~300Pa;優(yōu)選地，所述表皮 生長因子EGF在使用前配制成適宜的濃度直接加入到所述培養(yǎng)液中。
[0030] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述培養(yǎng)液還進(jìn)一步添加胰島素時(shí)是通過包 括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：
[0031] 在所述培養(yǎng)基中加入適量的胰島素，充分溶解至溶液清澈，所述胰島素在培養(yǎng)液 中的濃度為1~l〇〇mg/L。
[0032] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述培養(yǎng)液還包含ROCK通路的選擇性抑制劑 HA100或Y27632時(shí)是通過包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：
[0033] 將所述HA100或Y27632溶于微量的DMS0中，然后溶于滅菌去離子水中，攪拌，并以 0.22μπι濾器過濾，配制為儲(chǔ)液c，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液c為1000 X儲(chǔ)液;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a、儲(chǔ) 液b和儲(chǔ)液c置于-20°C~_80°C的環(huán)境中存儲(chǔ);更優(yōu)選地，存儲(chǔ)時(shí)分裝至小容量容器中。
[0034]使用時(shí)，直接將適宜濃度的生長因子添加在培養(yǎng)液中使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，不易以培養(yǎng) 液的形式儲(chǔ)存。
[0035]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC-RPE)的培養(yǎng)方法，其特征在 于，所述培養(yǎng)方法使用如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞；
[0036]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法包括步驟：
[0037] a)將hESC-RPE細(xì)胞以單細(xì)胞懸液的形式接種到所述培養(yǎng)液中得到細(xì)胞懸液;優(yōu)選 地，所述細(xì)胞懸液的密度為0.5~IX 105個(gè)細(xì)胞/cm2;
[0038] b)每隔一天換一次培養(yǎng)基，使細(xì)胞長到100%的飽和度后使用tryple? select酶 消化10min后傳代;優(yōu)選地，傳代時(shí)培養(yǎng)液中添加 ROCK抑制劑Y27632;
[0039]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液的使用量為每4.5cm2加入lmL培養(yǎng)基；
[0040] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中ROCK抑制劑Y27632的濃度為1 ΟμΜ。
[0041]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0042]與現(xiàn)有的培養(yǎng)基相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基配方簡單，成本較低，不涉及任何倫理問 題，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常的形態(tài)與功能，而且該培養(yǎng)基臨床應(yīng)用的 前景也非常好，所以不論是從基礎(chǔ)研究還是市場推廣，本發(fā)明都具有更廣泛的前景。
[0043]本發(fā)明的主要前景和意義包括：
[0044] 1)使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，不論 從生長效率、細(xì)胞的形態(tài)與功能、還是批次與批次之間的穩(wěn)定性，都有顯著的提高。
[0045] 2)化學(xué)成分明確培養(yǎng)基培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以為藥物篩選以及視網(wǎng)膜 色素上皮細(xì)胞臨床試驗(yàn)藥物都提供了很好的條件。
[0046] 3)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的臨床應(yīng)用首先必須確保是臨床級(jí)別的種子干細(xì)胞。這 樣才能將多能性干細(xì)胞相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)用于臨床，以往的培養(yǎng)基中的動(dòng)物源性成分都會(huì)限制其 應(yīng)用。本發(fā)明在化學(xué)成分完全明確的條件下可以很好的促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞生長并且 所培養(yǎng)的細(xì)胞具有正常的功能與形態(tài)，所以可以更快的促進(jìn)將來的臨床轉(zhuǎn)化。
[0047]本發(fā)明涉及一種適于培養(yǎng)多類型視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基。 本發(fā)明培養(yǎng)基適合將來的臨床應(yīng)用。本發(fā)明中培養(yǎng)基配方的各組分明確，成本低廉，非常有 利于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞大規(guī)模的制備并應(yīng)用于臨床。
【附圖說明】
[0048]圖1為以北京干細(xì)胞庫建立的臨床級(jí)人胚胎干細(xì)胞系（Q-CTS-hESC-2)在無滋養(yǎng) 層，無動(dòng)物源，化學(xué)成分明確的ES-vitronectin人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后，使用自發(fā)分 化的方法獲得的hESC-RPE。
[0049] 圖2為經(jīng)過本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)過4代后的hESC-RPE的情況。
[0050] 圖3為免疫熒光檢測用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)過后的hESC-RPE的標(biāo)志性蛋白表達(dá)情 況。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說明和闡釋 本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明。
[0052] 主要材料和試劑
[0053]低溫保存箱購自中國，海爾；制冰機(jī)購自中國，唯利安;液氮罐購自中國，東亞；四 度離心機(jī)購自美國，Beckman;生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱和Nanodrop購自美國，Thermo; 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、純水儀購自美國，Millipore;電子天平購自德國，賽多利斯;移液槍、多聚酶鏈 式反應(yīng)(PCR)儀購自德國，Eppendorf;激光共聚焦顯微鏡購自德國，Carl Zeiss;實(shí)時(shí)熒光 定量PCR儀購自美國，Talent;滅菌鍋購自日本，Sanyo;正置顯微鏡購自日本，Olympus;
[0054] 電泳儀套裝，GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)購自美國，BI0-RAD;圓形玻片(Coverslip) 購自美國Bel lco Glass。除非特別指明，本文中的試劑來源如下：商品化N2添加劑，Life technology公司；KnockOut? DMEM培養(yǎng)基，Invitrogen公司；KnockOut?血清（K0SR)， Invitrogen公司；0.05%及0.25%胰蛋白酶，Invitrogen公司；100X鏈霉素-青霉素（SP)， Invitrogen公司；二甲基亞諷（DMS0)，Invitrogen公司；100 X 非必需氨基酸（Nonessential amino acids，NEAA)，Invitrogen公司；100 X 谷氨酉先胺，Invitrogen公司；N_2supplement， Invitrogen公司；B_27Supplements，Invitrogen公司；β-mercaptoethanol (β-疏基乙酉享， 100Μ)，Invitrogen 公司；100Χ 鏈霉素 / 青霉素 （Streptomy cin/Penicillin，SP)， Invitrogen公司；TrypLE?，Invitrogen公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix- Plus-，Real_Time試劑盒，日本Τ0Υ0Β0公司；TRIzol，Invitrogen公司；RNA Reverse試劑盒， Invitrogen公司；Triton X-100,北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛（PFA)，Sigma; Hoechst 33342，Invitrogen。
[0055] 除非特別指明，本文中所用到的細(xì)胞，購自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所。
[0056] 除非特別指明，以下實(shí)施例中所用的試劑均為分析純級(jí)試劑，且可從正規(guī)渠道商 購獲得。
[0057]實(shí)施例1培養(yǎng)基的制備
[0058 ] 1)按照2mg/L的L-肉毒堿、lmg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、0 · 016mg/L的亞硒酸鈉、 lmg/1的亞油酸、lmg/L的亞麻酸、5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例溶于滅菌的去離子水中，制備50 X的儲(chǔ)液(表1)，使用0.22μπι的濾器過濾分裝，-20 °C保存。
[0059] 2)計(jì)算最終的培養(yǎng)基配制體積，按該體積加入1 %的非必需氨基酸，1 %的L-谷氨 酸，0.5 % -2 %的N2添加劑，加入K0DMEM至所需配制總體積；
[0060] 3)按所需配制體積加入相應(yīng)量的1)中所述50 X的儲(chǔ)液；
[0061 ] 4)按照50-200mg/L的維生素 C酸或50-200mg/L的維生素 C酸/維生素 C酸磷酸鎂鹽、 lmg/L的還原型谷胱甘肽、4ng/mL的胰島素濃度分別制備1000 X的儲(chǔ)液(表2);
[0062] 5)將步驟3)制備的儲(chǔ)液和步驟4)制備的儲(chǔ)液按照所需的量加入到步驟2)制備的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，然后與1 %的商品化的青鏈霉素混合均勻，加熱到37°C使用。
[0063] 表1 50 X儲(chǔ)液的組成和比例 「00641
[0065] 除非特別說明，表1中各組分的濃度單位為mg/L
[0066] 表2 1000 X儲(chǔ)液的組成和比例
[0067]
[0068] 除非特別說明，表2中各組分的濃度單位為mg/L
[0069] 實(shí)施例2使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞來源視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞
[0070] 具體實(shí)施步驟：
[0071] 1)利用傳統(tǒng)的自分化方法獲得hESC-RPE細(xì)胞，在純化至第二代的hESC-RPE細(xì)胞用 Tryple?酶消化10分鐘左右，使細(xì)胞脫離或即將脫離皿底，收集酶液，并用磷酸緩沖液(PBS) 清洗一次，1200rpm，離心3分鐘。棄上清液，用本發(fā)明所述培養(yǎng)基重懸，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。以 0.5-1 X 105cellS/cm2的密度接種。以12孔板為例，一個(gè)12孔板中1個(gè)孔常規(guī)培養(yǎng)基添加量為 lmL，也就是說12孔板中一個(gè)孔可以接種0.5-1 X 105ce 11 s/cm2的hESC-RPE細(xì)胞。
[0072] 2)將步驟1)中接種好的細(xì)胞使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔一天更換一次培養(yǎng) 基，當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代。
[0073]實(shí)施例3使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞
[0074]具體實(shí)施步驟：
[0075] 1)利用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)APRE-19細(xì)胞，約15天后細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，用Tryple? 酶消化5分鐘左右，使細(xì)胞脫離或即將脫離皿底，收集酶液，并用PBS清洗一次，1200rpm，離 心3分鐘。棄上清液，用本發(fā)明所述培養(yǎng)基重懸，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。以6孔板為例，一個(gè)6孔板中1 個(gè)孔常規(guī)培養(yǎng)基添加量為2mL。
[0076] 2)將步驟1)中接種好的細(xì)胞使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔一天更換一次培養(yǎng) 基，當(dāng)細(xì)胞長滿時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行傳代。
[0077]圖1為以北京干細(xì)胞庫建立的臨床級(jí)人胚胎干細(xì)胞系（Q-CTS-hESC-2)在無滋養(yǎng) 層，無動(dòng)物源，化學(xué)成分明確的ES-vitronectin人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)后，使用自發(fā)分 化的方法獲得的hESC-RPE:其中，
[0078] A為利用Q-CTS-hESC-2自分化獲得hESC-RPE的流程圖。約3-4個(gè)月可獲得較純的 RPE細(xì)胞；
[0079] B為利用免疫熒光染色技術(shù)對分化獲得的hESC-PRE進(jìn)行標(biāo)志性蛋白鑒定，包括： S0X2，0TX2，BEST1，MITF，Z0-1，鑒定結(jié)果為全部陽性，Bars = 200μπι;
[0080] C為利用qPCR技術(shù)對分化獲得的hESC-RPE標(biāo)志性基因表達(dá)檢測，包括RPE65，MITF， PAX6，TRY0SINASE，CREEBP，0CT4，0_ACTIN，GAPDH，其中APRE-19為人RPE細(xì)胞系，在此做陽性 對照，而hESCs做隱形對照。結(jié)果顯示分化獲得的hESC-RPE具有特異性基因的高表達(dá)；
[0081 ] D為利用透射電子顯微鏡鑒定分化獲得的hESC-RPE細(xì)胞結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示分化獲得 的細(xì)胞具有hESC-RPE典型特征:黑色素顆粒和頂端微絨毛結(jié)構(gòu)，Bars = 200ym。
[0082]圖2為經(jīng)過本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)過7代后的hESC-RPE的情況:其中，
[0083] A為光學(xué)顯微鏡觀察，在本發(fā)明所述培養(yǎng)基中添加 Y27632后細(xì)胞具有更好的標(biāo)志 性"鸛卵石"形態(tài)，而未添加 Y27632的細(xì)胞出現(xiàn)"纖維狀"形態(tài)；
[0084] B為用MTT進(jìn)行細(xì)胞活性分析，發(fā)現(xiàn)體檢Y27632后，細(xì)胞增殖效果更佳；
[0085] C為qRT-RCR鑒定經(jīng)過不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的hESC-RTO的標(biāo)志性基因表達(dá)情況。其 中，用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的相比與常規(guī)含有20 %K0SR培養(yǎng)基培養(yǎng)的hESC-RPE具有更高的 標(biāo)志性基因表達(dá)量。除此之外，在專利所述培養(yǎng)基中添加 Y27632后，基因表達(dá)上調(diào)效果更為 顯著。
[0086]圖3為免疫熒光檢測用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)過后的hESC-RPE的標(biāo)志性蛋白表達(dá)情 況:其中，
[0087] A為神經(jīng)外胚層標(biāo)志性蛋白0TX2;
[0088] B為眼區(qū)標(biāo)志性蛋白MITF;
[0089] C，D為RPE 標(biāo)志性蛋白 BEST1 和RPE65;
[0090] E 為緊密連接蛋白 Z0-l;Bars = 200ym。
[0091] 以上標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況證明了經(jīng)過專利所述培養(yǎng)液培養(yǎng)過的細(xì)胞依然具有正 常RPE所具體的形態(tài)蛋白表達(dá)特征。
[0092] 盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的 條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利 要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC-RPE)的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液 包含:體積分?jǐn)?shù)為96~97.5的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)為1的非必需氨基酸(NEAA)、體積分?jǐn)?shù) 為1的L-谷氨酰胺、體積分?jǐn)?shù)為0.5~2的N2添加劑、組分a和組分b; 其中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自 MEM、a-MEM、1640、DMEM、F10、F12、D/F12、NeurobasGP knokcout DMEM中的一種;優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的滲透壓為280~300Pa; 所述組分a由在培養(yǎng)液中的濃度為l-100mg/L的L-肉毒堿、l-100mg/L的乙醇胺、10-200mg/L的腐胺、0.01-0 · lmg/L的亞硒酸鈉、l_5mg/L亞麻酸、l_5mg/L的亞油酸、5-10mg/L的 轉(zhuǎn)鐵蛋白組成； 所述組分b由在培養(yǎng)液中的終濃度為10-500mg/L的維生素 C酸或10-500mg/L的維生素 C 酸磷酸鎂鹽、〇. 5-50mg/L的還原型谷胱甘肽組成。2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液還包含組分c，所述組分c選自 表皮生長因子EGF、胰島素、Rock通路選擇性抑制劑中的一種或多種;其中，所述表皮生長因 子EGF在培養(yǎng)液中的終濃度為10~20yg/L、胰島素在培養(yǎng)液中的終濃度為1~100mg/L、Rock 通路選擇性抑制劑在培養(yǎng)液中的終濃度為1~1〇〇μΜ，優(yōu)選為5~1 ΟμΜ;所述Rock通路選擇性 抑制劑為HA100或Y27632。3. 如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中N2添加劑由溶于去離子 水或Mi 1 i Q水的1~10mg/ml的動(dòng)物源胰島素或人重組胰島素、1~200mg/ml的人轉(zhuǎn)鐵蛋白、 0.1~lmg/ml的亞硒酸鈉、1~20mg/ml的腐胺和0.1~10mg/ml的孕酮組成。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基還包含1000U/mL 的青霉素和100_500mg/L的鏈霉素。5. 如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 將組分a的成份溶于滅菌去離子水中配制成儲(chǔ)液a，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a為50X儲(chǔ)液； 更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a使用0.22μπι的濾器過濾； 2) 將在培養(yǎng)液中的終濃度為10_500mg/L的維生素 C酸或維生素 C酸/維生素 C酸磷酸鎂 鹽與在培養(yǎng)液中的終濃度為〇 . 5-50mg/L的還原型谷胱甘肽混合后溶于滅菌去離子水中配 制成儲(chǔ)液b，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液b為1000 X儲(chǔ)液;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液b使用0.22μηι的濾器過 濾； 3) 提供適當(dāng)?shù)娜萜?，根?jù)培養(yǎng)基的終體積，按照體積比向所述容器中加入所述終體積 的1 %的非必需氨基酸、1 %的L-谷氨酸、0.5~2%的Ν2添加劑，最后加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基至體積 達(dá)到所述終體積;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a使用0.22μπι的濾器過濾； 4) 根據(jù)步驟3)所述的終體積，向所述容器中加入適量的儲(chǔ)液a和儲(chǔ)液b，即得所述培養(yǎng) 液。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括加入終濃度為1000U/mL的青 霉素和100-500mg/L的鏈霉素。7. 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法為： (1) 按照在培養(yǎng)液中的終濃度為2mg/L的L-肉毒堿、lmg/L的乙醇胺、16mg/L的腐胺、 0.016mg/L的亞硒酸鈉、lmg/L的亞油酸、lmg/L的亞麻酸、5mg/L的轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例制備50X 的儲(chǔ)液a;優(yōu)選地，使用0.22μηι的濾器過濾； (2) 按照10-500mg/L的維生素 C酸或10-500mg/L的維生素 C酸/維生素 C酸磷酸鎂鹽、 lmg/L還原型谷胱甘肽的比例制備1000 X的儲(chǔ)液b; (3) 根據(jù)配制的培養(yǎng)基的終體積，按體積分?jǐn)?shù)加入所述終體積1%的非必需氨基酸、1% 的L-谷氨酸、0.5 % -2 %的N2添加劑、加入KODMEM至所述終體積； (4) 加入相應(yīng)量的儲(chǔ)液a; (5) 加入相應(yīng)量的儲(chǔ)液b，既得培養(yǎng)基； 優(yōu)選地，以5M氯化鈉將所述培養(yǎng)基的滲透壓調(diào)制至280~300Pa;優(yōu)選地，所述表皮生長 因子EGF在使用前配制成適宜的濃度直接加入到所述培養(yǎng)液中。8. 如權(quán)利要求5~7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述培養(yǎng)液還進(jìn)一步添加胰 島素時(shí)是通過包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的： 在所述培養(yǎng)基中加入胰島素，充分溶解至溶液清澈，所述胰島素在培養(yǎng)液中的濃度為1 ~100mg/L。9. 如權(quán)利要求5~8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述培養(yǎng)液還包含ROCK通路 的選擇性抑制劑HA100或Y27632時(shí)是通過包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的： 將所述HA100或Y27632溶于微量的DMS0中，然后溶于滅菌去離子水中，攪拌，并以0.22μ m濾器過濾，配制為儲(chǔ)液c，優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液c為1000Χ儲(chǔ)液;更優(yōu)選地，所述儲(chǔ)液a、儲(chǔ)液b和 儲(chǔ)液c置于_20°C~_80°C的環(huán)境中存儲(chǔ);更優(yōu)選地，存儲(chǔ)時(shí)分裝至小容量容器中。10. -種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(hESC-RPE)的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法使用 如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)方法包括步驟： a) 將視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞以單細(xì)胞懸液的形式(hESC-RPE)接種到所述培養(yǎng)液中得到 細(xì)胞懸液;優(yōu)選地，所述細(xì)胞懸液的密度為〇. 5~1 X 105個(gè)細(xì)胞/cm2; b) 每隔一天換一次培養(yǎng)基，使細(xì)胞長到100%的飽和度后使用1：巧口161￥8616〇1：酶消化 lOmin后傳代;優(yōu)選地，傳代時(shí)培養(yǎng)液中添加 ROCK抑制劑Y27632; 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液的使用量為每4.5cm2加入lmL培養(yǎng)基； 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中ROCK抑制劑Y27632的濃度為10μΜ。
【文檔編號(hào)】C12N5/079GK105838676SQ201610298171
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】周琪, 祝賀, 譚元卿, 郝捷, 王磊, 王柳
【申請人】中國科學(xué)院動(dòng)物研究所