專利名稱：用于治療視網(wǎng)膜變性病的改良模式的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及用于視網(wǎng)膜變性和其它視覺障礙的改良的基于細胞療法及帕金森氏病治療和用于使哺乳動物胚胎干細胞和哺乳動物胚胎衍生細胞分化成視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和其它眼球組織包括但不限于視桿、視錐、兩極、角膜、神經(jīng)、虹膜上皮、和祖細胞的方法。
背景技術：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的許多部分都呈現(xiàn)出薄層狀的組織，而神經(jīng)病理學過程通常涉及這些復合細胞層中一層以上的組織。CNS疾病常常包括神經(jīng)細胞損失，而且由于缺乏內(nèi)源性的再生，CNS相關疾病后功能的有效恢復非常有限或者沒有。具體而言，常見的視網(wǎng)膜疾病中已知的年齡相關的黃斑變性(AMD)是由于光感受器與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)一起損失造成的，另外不定量的涉及內(nèi)核層(INL)的中間(“傳遞”)神經(jīng)元。因此，恢復中度至高度敏銳的視覺需要從功能上置換某些或所有的受損細胞層。
在解剖學上，色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，一種遺傳性的視網(wǎng)膜病變，是光感受器細胞核數(shù)目持續(xù)減少導致視力喪失。盡管大部分形式RP之間表型相似，但它們潛在的細胞機制是不同的，且是由于許多基因的各種突變造成的。大部分涉及的突變改變了光感受器細胞特異性基因的表達，其中大約10％是由于視紫紅質(zhì)基因的突變造成的。在該疾病的其它類型中，調(diào)控凋亡的基因被改變了(例如，Bax和Pax 2)。AMD是包含分子水平上病因可能有所不同的一系列病變在內(nèi)的一種臨床診斷。所有的AMD病例都具有在中央視網(wǎng)膜內(nèi)光感受器細胞丟失的特征。不過，這一共同的最終現(xiàn)象似乎是早期RPE、新血管形成和潛在脈絡膜水平異常的次級后果。后者可能涉及光感受器膜翻折困難，具體機理目前尚不清楚。
此外，視網(wǎng)膜色素上皮是眼睛內(nèi)最重要的細胞類型之一，因為它對于維持光感受器功能而言至關緊要。它具有幾種復雜的功能，包括對視桿和視錐的脫落外部片段的吞噬作用、維生素A的代謝、視網(wǎng)膜底空間內(nèi)代謝物交換中涉及的黏多糖合成、代謝物的轉運、血管發(fā)生的調(diào)控、光吸收、圖像分辨率的增強以及通過諸如蛋白酶和蛋白酶抑制劑等分泌蛋白進行的視網(wǎng)膜內(nèi)許多其它功能的調(diào)控。
在AMD的某些病例中顯現(xiàn)的另一特征是出現(xiàn)異常的血管，這導致了大家所知道的脈絡膜新血管形成(CNV)病。這種新血管(“濕的”)形式的AMD特別具有破壞性，而且似乎是由于對血管發(fā)生缺乏適當?shù)恼{(diào)控所造成的。RPE功能障礙造成的脈絡膜破裂使得新血管從脈絡膜循環(huán)進入視網(wǎng)膜底空間，在那它們可破壞外部區(qū)段組織并引起血管滲漏或出血導致額外的光感受器損失。
CNV可激光定向治療。因此，激光治療“濕”AMD在美國是普遍使用的。不過，這通常存在令人不快的副作用，因此患者不滿意治療效果。這是由于如果發(fā)生了激光燒傷，它們會涉及光感受器死亡和視野內(nèi)相應部分的絕對的、不能挽回的視覺缺失。此外，激光治療不能使?jié)撛诘囊谆疾◇w質(zhì)向CNV的發(fā)展。事實上，激光燒傷已被用作常規(guī)方法誘發(fā)猴子的CNV(Archer和Gardiner″1981)。在諸如英國等其它國家內(nèi)斑點激光治療CNV的使用要保守的多。對于更常見的“干”式AMD則沒有一般公認的療法，其中存在與斑點內(nèi)RPE萎縮的不規(guī)則碎片重疊的光感受器損失和被稱為玻璃疣的相關胞外物質(zhì)。
由于RPE在光感受器維護和血管發(fā)生的調(diào)控中起重要作用，各種體內(nèi)RPE功能障礙都與改變視力的疾病相關，諸如色素性視網(wǎng)膜炎、RPE脫離、發(fā)育不良(displasia)、萎縮、視網(wǎng)膜病變、黃斑變性或變性，包括年齡相關的黃斑變性，它們可導致光感受器損傷和失明。
特別是除了AMD之外，影響黃斑的多種其它變性疾病包括，但不局限于視錐變性、視錐-視桿變性、malattia leventinese、多因蜂窩狀萎縮(Doyne honeycomb dystrophy)、Sorsby′s變性、Stargardt病、pattern/butterfly變性、貝氏卵黃狀變性、北卡羅林納變性、中央網(wǎng)形脈絡膜變性、血管樣條紋癥和毒性黃斑變性。
一般可繼發(fā)地影響黃斑的視網(wǎng)膜病變包括視網(wǎng)膜脫離、病理性近視、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、CMV視網(wǎng)膜炎、閉塞性視網(wǎng)膜血管病、早熟的視網(wǎng)膜病變(ROP)、脈絡膜破裂、眼組織胞漿綜合癥(POHS)、弓形蟲病和Leber′s先天性黑朦。所有以上列舉的都不是窮舉的。
所有以上病征均涉及光感受器的損失，因此，可供選擇的治療方法是不多的且不夠的。
因為它的傷口修復能力，RPE已被廣泛試驗用于移植治療中。2002年，進入試驗的一年，患者顯示出30-50％的改善。在幾種動物模型和人中都顯示出(Gouras等，2002，Stanga等，2002，Binder等，2002，Schraermeyer等，2001，由Lund等綜述，2001)RPE移植具有良好的視覺恢復潛能。不過，即使在諸如眼部等免疫特許的位置，也存在移植物排斥反應的問題，阻礙了在異源移植時利用此方法。盡管新的光感受器(PRCs)已通過移植被從實驗上引入，但被移植的PRC在與宿主視網(wǎng)膜原存活神經(jīng)元之間的連接非常勉強。對胚胎組織來源的RPE細胞的依賴是另一問題，因為這些細胞已顯示出非常低的增殖潛能。Emory大學的研究者進行了一個試驗，即他們將來自人眼供體的RPE細胞進行體外培養(yǎng)并移植給6名晚期帕金森癥患者。盡管移植一年后發(fā)現(xiàn)癥狀減輕了30-50％，但因眼睛供體不足，仍未經(jīng)FDA核準，并會依然存在超過捐贈眼組織所能提供的需求。
迄今為止，利用異位RPE細胞的療法已顯現(xiàn)出類似成纖維細胞的作用，并且與許多破壞性視網(wǎng)膜并發(fā)癥相關，包括軸突損失(Villegas-Perez等，1998)和具視網(wǎng)膜脫離現(xiàn)象的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)(Cleary和Ryan，1979)。以松散的片狀形式運送的RPE趨向于卷起來。這導致光感受器不能有效覆蓋以及多層具有錯誤極性的RPE，可能造成囊腫形成或黃斑水腫。
有關運送神經(jīng)視網(wǎng)膜移植物至患者眼睛的視網(wǎng)膜下(黃斑下)空間的情況可參閱文獻Kaplan等(1997)，Humayun等(2000)和delCerro等(2000)。其中存在的一個嚴重問題是神經(jīng)視網(wǎng)膜移植物通常在功能上不能與宿主視網(wǎng)膜一體化。此外，缺乏完整的RPE單層意味著RPE功能障礙或脈絡膜的破壞未被矯正。二者都是視覺喪失的基本前提條件。
因此，在任一目前的治療方法中都不存在有效的重組RPE的方式，因此各種方法都仍有不足，尤其是在移植物和宿主視網(wǎng)膜之間存在的功能不聯(lián)貫的基本問題。
因此需要有改進的視網(wǎng)膜治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供用于由干細胞衍生眼球細胞的改良方法，所述細胞包括但不限于神經(jīng)細胞包括水平細胞和無長突細胞、視網(wǎng)膜細胞諸如視桿和視錐、角膜細胞、血管細胞、及RPE和RPE樣細胞，和提供用于治療視網(wǎng)膜變性的改良方法和療法。具體而言，這些方法牽涉由人胚胎干細胞衍生的RPE和RPE樣細胞的使用。
本發(fā)明的一個實施方案提供了使用衍生自哺乳動物胚胎干細胞的RPE細胞、RPE樣細胞、這些細胞的祖細胞或任何兩種或三種上述細胞的組合的視網(wǎng)膜變性療法生成細胞的改良方法，以治療多種狀況，包括但不限于色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性及相關狀況?？墒褂帽景l(fā)明生成的細胞類型包括但不限于RPE、RPE樣細胞、和RPE祖細胞。還可生成的細胞包括虹膜有色上皮(IPE)細胞。視覺相關的神經(jīng)細胞包括中間神經(jīng)元(例如，內(nèi)核層(INL)的“傳遞”神經(jīng)元)和無長突細胞(在垂直方向第二突觸水平上相互作用的中間神經(jīng)元，所述途徑由光感受器-兩極-神經(jīng)節(jié)細胞鏈組成，它們在內(nèi)網(wǎng)織層(IPL)內(nèi)突觸水平上活躍并用于將呈遞給神經(jīng)節(jié)細胞的視覺信息整合、調(diào)整并放入一暫時的區(qū)域內(nèi))也可利用本發(fā)明產(chǎn)生。此外，還可產(chǎn)生視網(wǎng)膜細胞、視桿、視錐和角膜細胞。在本發(fā)明的另一實施方案中，還可產(chǎn)生提供眼睛脈管系統(tǒng)的細胞。本發(fā)明的細胞可利用玻璃體切割術被移植入視網(wǎng)膜底空間。
非限制性的例子包括將這些細胞在懸浮液、基質(zhì)或基底中進行移植?？芍委煹纳匦我暰W(wǎng)膜炎的動物模型包括嚙齒動物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶狀樣小鼠、RCS大鼠、貓(阿比西尼亞貓)，以及狗(視錐病變″cd″狗、進行性視桿-視錐病變″prcd ″狗，早期視網(wǎng)膜病變″erd″狗、1型、2型和3型視桿-視錐發(fā)育異?！錼cd1，rcd2 & rcd3″狗、光感受器發(fā)育異常″pd″狗和Briard″RPE-65″(狗)。用行為試驗、熒光血管造影術、組織學或功能檢測進行評估，所述的功能檢測有諸如檢測細胞完成吞噬作用的能力(光感受器片段)、維生素A的代謝、緊密連接點傳導性等，或者用電子顯微鏡進行檢查。與只局限于使用眼睛供體組織可能治療的患者人數(shù)相比，此處所提出方法的眾多優(yōu)勢之一在于它的生產(chǎn)能力和能治療更多的患者。
本發(fā)明的另一實施方案提供了使hES細胞自發(fā)分化成具有無數(shù)RPE特征的細胞的方法。這些PRE制品能在培養(yǎng)中表現(xiàn)有所變化并在多次傳代中仍保持RPE的特征。本發(fā)明還提供了使已建立的RPE細胞系分化成預備的神經(jīng)元細胞系、角膜細胞、視網(wǎng)膜細胞的方法，非限制性的例子是通過使用bFGF或FGF。
本發(fā)明的另一實施方案是從現(xiàn)存的和新的ES細胞系中衍生出新的RPE細胞系和祖細胞的方法。當它們來自不同ES細胞系時，它們在特性上可能有所變化，諸如RPE樣細胞的生長速率、色素表達或培養(yǎng)中的去分化和再分化。它們在功能和核型穩(wěn)定性上可能有某些變化，因此希望能提供針對新RPE系列和新ES細胞系衍生物的方法，使得可以挑選具有預期特性的細胞系，能被無性繁殖選擇，以產(chǎn)生純的高質(zhì)量的RPE樣細胞群。
也可來源于現(xiàn)存的和新的ES細胞系的細胞包括虹膜有色上皮(IPE)細胞。在另一實施方案中，包括中間神經(jīng)元(例如，內(nèi)核層(I NL)的“傳遞”神經(jīng)元)和無長突細胞在內(nèi)的視覺相關神經(jīng)細胞也可利用本發(fā)明產(chǎn)生。此外，可產(chǎn)生視網(wǎng)膜細胞、視桿、視錐和角膜細胞。在本發(fā)明的另一實施方案中，還可產(chǎn)生提供眼睛脈管系統(tǒng)的細胞。
本發(fā)明的另一實施方案是產(chǎn)生具有增強的預防新血管形成能力的RPE細胞系衍生物或RPE細胞前體的方法。所述細胞可通過如下方式產(chǎn)生，即使來自患者的體細胞老化，從而使端粒酶縮短，其中細胞正常復制壽命的10％被跨越，然后使用所述體細胞作為核轉移供體細胞產(chǎn)生過表達諸如色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)等血管發(fā)生抑制劑的細胞?；蛘咚黾毎捎靡种菩卵苄纬傻耐庠椿蜻z傳修飾。
本發(fā)明的另一實施方案利用了在HLA區(qū)域具有純合性的ES或胚胎來源細胞庫，從而使所述細胞在其HLA抗原上的復雜性降低。
因此，本發(fā)明的另一實施方案包括ES來源RPE樣細胞的定性。盡管ES來源的有色上皮細胞在其形態(tài)學、行為和分子標記上都非常類似RPE，但它們的治療價值取決于它們發(fā)揮RPE作用且不致癌的能力。因此，用以下一種或多種技術對ES來源RPE細胞進行表征(i)評估它們的功能性，即光感受器片段的吞噬能力、維生素A的代謝、傷口愈合能力；(ii)通過動物模型(作為非限制性的例子，此處可用SCID小鼠)移植評估RPE樣ES細胞衍生物的多能性；(iii)RPE樣細胞的表型和核型；(iv)通過基因表達圖譜評估ES細胞來源RPE樣細胞和RPE組織；(v)在蛋白質(zhì)水平評估RPE分子標記物的表達，包括促貝斯特素(bestrophin)、CRALBP、RPE-65、PEDF。也可基于細胞中眼睛發(fā)育通常所需的轉錄激活劑的表達對其進行評估，包括rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six 3/optx、six6/optx2、mitf、pax6/mitf和pax6/pax2(Fischer和Reh，2001，Baumer等，2003)。
本發(fā)明的另一實施方案是用至少以下一種技術對ES來源RPE樣細胞進行定性的方法(i)評估ES來源RPE樣細胞的功能性；(ii)通過動物模型移植評估RPE樣ES細胞衍生物的多能性；(iii)RPE樣細胞的表型和核型；(iv)評估基因表達圖譜；(v)在蛋白質(zhì)水平評估RPE的分子標記物的表達；以及(vi)眼睛發(fā)育正常需要的轉錄激活劑的表達。在另一實施方案中，這些技術可被用于評估多重hES細胞來源的細胞類型。
本發(fā)明的另一實施方案是不產(chǎn)生ES細胞系，直接從人和非人動物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs)衍生RPE細胞和RPE前體細胞。
胚胎干細胞(ES)在未分化階段可體外不確定的維持并實質(zhì)上能分化成任一細胞類型。因此人的胚胎干細胞(hES)可用于研究人細胞的分化，并被考慮作為移植療法的可能來源。迄今為止，已有關于人和小鼠ES細胞分化成許多細胞類型的報道(由Smith綜述，2001)，所述細胞類型包括心肌細胞[Kehat等，2001，Mummery等，2003Carpenter等，2002]、神經(jīng)元和神經(jīng)前體(Reubinoff等，2000，Carpenter等，2001，Schuldiner等，2001)、脂肪細胞(Bost等，2002，Aubert等，1999)、肝細胞樣細胞(Rambhatla等，2003)、造血細胞(Chadwick等，2003)、卵母細胞(Hubner等，2003)、胸腺細胞樣細胞(Lin RY等，2003)、胰島細胞(Kahan，2003)和造骨細胞(Zur Nieden等，2003)。
本發(fā)明的另一實施方案是鑒定來源于胚胎、胚胎干細胞系或其它胚胎細胞并通過比較體內(nèi)來源細胞和所述細胞的信使RNA轉錄物發(fā)現(xiàn)它具有分化成有用的細胞類型的能力的細胞的方法，所述細胞諸如RPE細胞、造血細胞、肌肉細胞、肝細胞、胰腺β細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮、祖細胞或細胞療法或研究中有用的其它細胞。此方法方便了正常表型細胞的鑒定，并可優(yōu)化細胞用于細胞療法和研究中。
本發(fā)明為人ES細胞分化成神經(jīng)元系列中的特化細胞、視網(wǎng)膜色素屏障上皮(RPE)提供了準備條件。RPE是脈絡膜和神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜之間的一層濃密有色上皮單層。它是血流和視網(wǎng)膜之間屏障的一部分，它的功能包括對脫落視桿和視錐外部區(qū)段的吞噬作用、雜散光的吸收、維生素A的代謝、視黃醛衍生物的再生和組織修復。(Grierson等，1994，F(xiàn)isher和Reh，2001，Marmorstein等，1998)。通過其黑色細胞且鵝卵石狀的細胞形態(tài)很容易識別RPE。此外，有數(shù)種已知的RPE標記物，包括細胞視黃醛結合蛋白(CRALBP)，一種同樣發(fā)現(xiàn)于頂突處的胞質(zhì)細胞(Bunt-Milam和Saari，1983)；RPE 65，視黃醛衍生物代謝中涉及的胞質(zhì)蛋白(Ma等，2001，Redmond等，1998)；促貝斯特素，貝斯特卵黃狀黃斑變性基因的產(chǎn)物(VMD2，Marmorstein等，2000)和色素上皮衍生因子(PEDF)，具有制管張?zhí)匦缘?8kD分泌蛋白(Karakousis等，2001，Jablonski等，2000)。
RPE的不尋常特性是其表觀可塑性。RPE細胞在有絲分裂期通常是靜止的，但受損傷或光凝固后可開始分裂。RPE細胞鄰近受損平面并增殖形成新的單層(Zhao等，1997)。幾種試驗已表明RPE單層可產(chǎn)生成纖維細胞外觀的細胞，它稍后能恢復成其最初的RPE形態(tài)(Grierson等，1994，Kirchhof等，1988，Lee等，2001)。目前仍不清楚分裂的細胞和有色上皮層是否來自同一世系，因為分離出了兩種RPE細胞群上皮狀的和紡錘狀的(McKay和Burke，1994)。在體外，取決于生長因子的組合和基質(zhì)，RPE可作為上皮保持或快速去分化并變成增殖性的(Zhao1997，Opas和Dziak，1994)。有趣的是，在長期的靜止培養(yǎng)中可重新出現(xiàn)上皮的表型(Griersion等，1994)。
在哺乳動物發(fā)育中，RPE與神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜-眼泡神經(jīng)上皮具有相同的祖先。在某些情況下，有人提出RPE可反式分化成神經(jīng)元祖細胞(Opa s和Dziak，1994)、神經(jīng)元(Chen等，2003，Vinores等，1995)和晶狀體上皮(Eguchi，1986)?？纱碳PE變成神經(jīng)元的因子之一是bFGF(Opaz和Dziak，1994，與眼睛發(fā)育通常所需的轉錄激活劑表達相關的過程，包括rx/rax、chx10/vsx-2/alx、ots-1、otx-2、six3/optx，six6/optx2、mitf和pax6/pax2(Fischer和Reh，2001，Baumer等，2003)。最近，研究顯示小雞視網(wǎng)膜邊緣包含神經(jīng)干細胞(Fischer和Reh，2000)且在該區(qū)域內(nèi)表達pax6/mitf的有色細胞能響應FGF形成神經(jīng)細胞(Fisher和Reh，2001)。
本發(fā)明為從hES衍生小梁網(wǎng)細胞以及為遺傳修飾小梁網(wǎng)細胞用于青光眼治療提供了條件。
本發(fā)明還為從RPE祖細胞和RPE樣細胞衍生出小梁網(wǎng)細胞以及為遺傳修飾小梁網(wǎng)細胞用于青光眼治療提供了條件。
本發(fā)明包括不產(chǎn)生ES細胞系、直接從人和非人動物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs)產(chǎn)生RPE細胞和RPE前體細胞的方法，包括a)體外維持未分化狀態(tài)的ES細胞；b)使ES細胞分化成RPE和RPE前體細胞；并c)通過比較所述細胞和體內(nèi)來源細胞的信使RNA轉錄物鑒別RPE細胞。
本發(fā)明另外提供了RPE系或RPE細胞前體的衍生方法，所述RPE細胞具有增強的防止新血管形成的能力，所述方法包括a)使來自動物的體細胞老化，從而使端粒酶縮短，其中細胞正常復制壽命的10％被跨越；和b)使用所述體細胞作為核轉移供體細胞產(chǎn)生過表達血管發(fā)生抑制劑的細胞，其中的血管發(fā)生抑制劑可以是色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)。
本發(fā)明提供了用hES細胞來源RPE、RPE-樣和/或RPE祖細胞治療帕金森癥的方法。這些可通過立體定位性內(nèi)條紋植入或微載體遞送?；蛘?，它們可不使用微載體遞送。也可通過本領域技術人員已知的任何方法擴大培養(yǎng)細胞并用于治療帕金森癥。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將由以下詳述體現(xiàn)。
附圖描述

圖1A-F是顯示自然分化hES細胞內(nèi)有色區(qū)外觀(RPE細胞的特征)的一組照片。圖1A是在6孔板中黏附培養(yǎng)2.5個月后有色區(qū)的照片；圖1B是在EB中培養(yǎng)2.5個月后有色區(qū)的照片，放大倍數(shù)45x；圖1C是黏附培養(yǎng)的有色區(qū)的照片；圖1D是EB培養(yǎng)的有色區(qū)的照片；圖1E是有色區(qū)和其它培養(yǎng)物之間邊界的照片，x200；圖F與圖E相同，除了放大倍數(shù)是x400之外。A和B中的箭頭指向有色區(qū)。
圖2A-F是顯示培養(yǎng)過程中色素沉積和上皮形態(tài)喪失和恢復的一組照片。圖2A是顯示初級EB生長暈的照片，1周；圖2B是顯示用胰酶分離的原代培養(yǎng)細胞照片，1周；圖2C是顯示被增殖細胞環(huán)繞的上皮島的照片；圖2D是顯示培養(yǎng)1個月后色素沉積和上皮形態(tài)恢復的照片；圖2E是顯示傳3代后培養(yǎng)物的照片，放大倍數(shù)為x200；圖2F顯示的培養(yǎng)物與E相同，放大倍數(shù)為x400。Hoffinan顯微鏡。黑箭頭指向有色細胞，白箭頭顯示無色素的生長細胞。
圖3左組圖(A-D)和右邊組圖是一組照片和一張曲線圖-顯示了hES細胞來源有色上皮細胞中RPE的標志。圖3A和3B是顯示RPE標志促貝斯特素免疫定位的照片和相應的相位顯微鏡視野，放大倍數(shù)為x200；圖3C和3D是顯示CRALBP和相應相差顯微鏡視野的照片，放大倍數(shù)為x400。箭頭顯示的是促貝斯特素(A)和CRALBP(C)對有色細胞的共定位(C，D)；箭頭狀物指向無色區(qū)內(nèi)無這些蛋白質(zhì)(A，B)的著色(C，D)。圖3右組圖顯示用促貝斯特素(a)和CRALBP(b)抗體進行的細胞裂解物(系hES#36)蛋白質(zhì)印跡分析的照片和圖表；c，d-未分化的hES細胞，c--抗CRALBP抗體的對照，d-抗促貝斯特素抗體的對照。
圖4顯示的照片證明了標志物Pax6(圖4A)、Pax2(圖4E)和mitf(圖4B、圖4F)在長期靜止培養(yǎng)的RPE樣細胞中的表達。圖4C、圖4G-相差，圖4D、圖4H-Pax6/mitf/相差(圖4A、圖4B、圖4C)和Pax2/mitf/相差(圖4E、圖4F、圖4G)的合并圖像。
圖5A-B顯示了人胚胎來源細胞培養(yǎng)中RPE分化的照片繞過了ES細胞系衍生階段。
圖6顯示了RPE制品的轉錄比較，圖6A-F-基于本體論的注釋，此表代表了RPE相關基因針對hES細胞來源視網(wǎng)膜色素上皮(hES-RPE)、hES細胞來源反式分化細胞(hES-RPE-TD)、ARPE-19和D407和新鮮分離的人RPE(fe-RPE)的表達。圖6G-顯示已知的RPE特異性存在的更多資料，諸如黑色素的生物合成、視覺-視黃醇結合，只在胎兒RPE和ES-RPE中有，但在ARPE-19中沒有。
發(fā)明詳述本發(fā)明的多種實施方案詳述于此并可能通過所提供的實施例進行了進一步的說明。當應用于本說明書和以下全部權利要求中時，除非上下文明確指出，否則“一個”、“一種”和“這個”的意思包括多于一個的涵義。此外，當用于本說明書中時，除非上下文中明確指出，否則“在里面(in)”的意思包括“在里面(in)”和“在上面(on)”。
在本發(fā)明的上下文和使用各術語的特殊上下文中，用于此說明書的術語通常具有其在本領域內(nèi)的普通涵義。在下文或說明書的其它部分對某些用于描述本發(fā)明的術語進行了說明，以便為實踐者在描述本發(fā)明的組合物和方法以及如何制備和使用它們時提供附加的指引。為了方便，可能利用例如斜體字和/或引用語標志等使某些術語突出顯示。使用突出標示對某一術語的范圍和意思沒有影響，在同一上下文中，無論它是否被突出標示，某一術語的范圍和意思都是相同的?？梢岳斫鉃橥瑯拥氖虑榭梢砸砸环N以上的方式敘述。因此，對本文所論述的任一個或多個術語都可使用選擇性的語言和同義詞，無論該術語是否詳述或討論于此，對其都沒有任何特殊的意義。本文提供了某些術語的同義詞。描述一個或多個同義詞并不排斥使用其它的同義詞。在本說明書中任何部分所使用的實施例，包括本文所論述的任何術語的例子，都只具有說明的目的，決非限制了本發(fā)明的范圍和領域，不考慮任何具體的理論或功能設置，只要數(shù)據(jù)的加工、收集、轉換等是依照本發(fā)明進行的就應屬于本發(fā)明的范圍。
定義“胚胎”或“胚胎的”意指還未植入母體子宮膜的正在發(fā)育的細胞團?！芭咛ゼ毎狈蛛x自胚胎或包含于胚胎中的細胞。這也包括卵裂球，早到兩細胞階段獲得的卵裂球和聚集的卵裂球。
術語“胚胎干細胞”指胚胎來源細胞。更具體而言是指分離自胚泡或桑椹胚的內(nèi)細胞團且已作為細胞系連續(xù)傳代的細胞。
術語“人胚胎干細胞”(hES細胞)指人胚來源的細胞。更具體而言hES指分離自人胚泡或桑椹胚的內(nèi)細胞團并且已作為細胞系連續(xù)傳代的細胞，還可以包括卵裂球和聚集的卵裂球。
術語“人胚胎來源細胞”(hEDC)指桑椹胚來源細胞、胚泡來源細胞，包括內(nèi)細胞團、胚盾或上胚層的細胞，或者早期胚胎的其它全能或多能性干細胞，包括原始內(nèi)胚層、外胚層和中胚層以及它們的衍生物，還包括卵裂球和來自聚集的單個卵裂球的細胞塊或來自不同發(fā)育階段的胚胎，但不包括已作為細胞系傳代的人胚胎干細胞。
具有分化成人體幾乎任何組織的能力的胚胎干(ES)細胞為移植療法提供了能再生且具組織相容性的細胞的無限來源，因為免疫排斥的問題可通過核轉移和孤雌生殖技術克服。
Hirano等人(2003)最近的發(fā)現(xiàn)顯示小鼠ES細胞可在體外分化實驗中產(chǎn)生眼睛樣的結構。其中對有色上皮細胞進行了描述，類似視網(wǎng)膜色素上皮。
在Advanced Cell Technology上用靈長類和人ES細胞系進行的預備實驗顯示在專門的培養(yǎng)系統(tǒng)中這些細胞分化成可分離和傳代的RPE樣細胞。人和小鼠NT，Cyno parthenote ES細胞衍生物具有RPE的多種特性這些有色上皮細胞表達RPE的4種分子標志-促貝斯特素、CRALBP、PEDF和RPE65；象RPE一樣，它們在培養(yǎng)中增殖的同時也伴隨著去分化，即色素和上皮形態(tài)的丟失，在細胞形成單層并靜止后這兩種特征都恢復了。所述RPE樣細胞很容易傳代、凍結和融化，因此允許它們的擴充。
本發(fā)明的發(fā)明者進一步證明了人ES細胞在體外分化實驗中也產(chǎn)生多種眼睛(玻璃體)樣結構。
這些結構的組織學分析顯示細胞的模式與早期視網(wǎng)膜發(fā)育一致，包括類似于視桿和視錐的細胞聚集體。
RPE移植目前，對RPE同種異體移植物的長期緩慢的排斥反應阻礙了科學家確定該RPE移植的療效。有數(shù)種方法被考慮用于克服此障礙。最簡單的方法是采用全身性的免疫抑制，這伴隨著諸如癌癥和感染等嚴重的副作用。第二條途徑是移植患者自身的RPE，即自體移植物，但這種方法的缺點在于是用舊的、不健康的RPE去置換更不健康的RPE。還有第三條途徑是利用來自同一患者的虹膜上皮(IPE)，但該方法的缺點在于IPE可能完成不了RPE的所有視覺相關功能。最終需要發(fā)現(xiàn)一種能消除排斥反應且研究者因此能確定在AMD和ARMD中RPE移植的真正療效的方法。核轉移和孤雌生殖提高了被移植RPE細胞和祖細胞的組織相容性。色素性視網(wǎng)膜炎中的RPE缺陷色素性視網(wǎng)膜炎是一類遺傳病，其中視覺感受器由于異常的遺傳程序而逐漸被破壞。某些形式引起患者在相對年輕的時候就全部失明，而其它形式則顯示出對視覺有少許損傷的特征性“骨針”視網(wǎng)膜變化。在全世界范圍內(nèi)該疾病患者大約有一百五十萬人。在專門表達于RPE的基因中發(fā)現(xiàn)了引起常染色體隱性RP的兩個基因缺陷。一個是由維生素A代謝中所涉及的RPE蛋白質(zhì)(順式視黃醛結合蛋白)造成的，第二個涉及RPE獨特的另一種蛋白質(zhì)RPE 65。一旦排斥反應被克服，這兩種形式的RP都應能直接通過RPE移植進行治療。這種治療在幾年前是難以想象的，那時候RP是一種沒有希望治愈且了解甚少的失明癥。
有關RPE移植的新研究顯示有希望對視網(wǎng)膜病變進行治療，包括黃斑變性在內(nèi)。而且，許多晚期RP患者在進行胎兒視網(wǎng)膜細胞移植后重新獲得了一定程度的有效視力。例如，一名患者從幾乎看不見光改善到能數(shù)出放在離其臉部約6英尺距離處的手指。在第二個病例中，患者視力提高到能通過管狀視野看見字母。在這些研究中移植是通過注射進行的，在現(xiàn)存的神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜下引入了新的視網(wǎng)膜細胞。盡管確定存活的細胞與其它神經(jīng)元形成連接并在它們周圍開始發(fā)揮類似光感受器的功能，但是因為所移植的胎兒細胞是異源的(即，非遺傳匹配的)，所以不是所有的細胞都能存活的。前8名患者接受移植后大約一年，其中4名患者恢復了一定程度的視覺功能，而第五名患者表現(xiàn)出正在恢復的跡象。
三種新來源的人胚胎干細胞系在特性上與早先所述的相似(Thomson等1998，Reibunoff等，2000，Richards等，2000，Lanzendorf等，2001)它們在傳了45代或超過130×2個種群后仍保持未分化的表型并表達未分化hES細胞的已知標志Oct-4、堿性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在EB或長期黏附培養(yǎng)基中以及在畸胎瘤內(nèi)所有的hES細胞系都分化成三個胚芽層的衍生物。以以下標準判斷，其中一個hES細胞分化衍生物與視網(wǎng)膜色素上皮相似從形態(tài)學上看，它們具有典型的上皮鵝卵石單層外觀并且在其胞質(zhì)部分包含黑褐色的色素，這已知在人體內(nèi)只存在于黑素細胞、角質(zhì)形成細胞、視網(wǎng)膜和虹膜色素上皮(IPE)中。不過，黑素細胞是非上皮細胞，而角質(zhì)形成細胞不分泌而只是積聚黑色素。這些細胞中存在一批RPE特異蛋白質(zhì)—促貝斯特素、CRALBP、PEDF，表明它們可能與RPE而非IPE相似。另一相似處是被分離所色素細胞在培養(yǎng)中的行為，在正在增殖的細胞中觀察到很少或沒有色素，但在緊密堆積的上皮島中則保留了色素，或者在細胞靜止后新建立的鵝卵石單層中重新表達了色素。這樣的現(xiàn)象在有關RPE細胞培養(yǎng)的文獻中也有描述(Zhao等綜述，1997)，且原先已報道過(Vinores等，1995)神經(jīng)元標志物微管蛋白βIII在體外特異定位于正在分化的RPE細胞中，而不是具有典型RPE形態(tài)的細胞中，這反映了RPE的可塑性和其去分化成神經(jīng)系統(tǒng)細胞系的能力。本發(fā)明的發(fā)明者觀察到微管蛋白βIII以相同模式定位于原代和傳代培養(yǎng)的RPE和RPE樣細胞中，這反映了所述細胞在培養(yǎng)中的去分化作用或表明分開的細胞群最終分化成神經(jīng)元，在長期培養(yǎng)的hES細胞整個分化過程中，它們最初的定位鄰近有色細胞并可以與RPE樣細胞一起被共同分離。
在正在生長的眼泡內(nèi)，RPE和神經(jīng)視網(wǎng)膜共有同一種雙潛能神經(jīng)上皮祖細胞，且它們的命運據(jù)顯示是由Pax2、Pax6和Mitf決定的(Baumer等，2003)，后者是前兩者的靶目標。Pax6在早期用作原神經(jīng)基因的激活劑，而進一步發(fā)育后在RPE中有所下調(diào)，在成熟視網(wǎng)膜的無長突細胞和神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)保持一定的水平(Ashery-Padan和Gruss綜述，2001)。在金魚中，也發(fā)現(xiàn)了在有絲分裂期間活躍的再生神經(jīng)元的祖細胞(Hitchcock等，1996)。本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)許多RPE樣細胞以類似于微管蛋白βIII的模式表達mitf和Pax6，并且只發(fā)現(xiàn)于長期培養(yǎng)的有色上皮島周圍的非上皮形態(tài)的非有色細胞中或具“部分”RPE表型的細胞中(輕微著色和松散堆積)。在新傳代的增殖細胞中，幾乎每個細胞中都能發(fā)現(xiàn)所有這些標志物，顯示出或者RPE樣細胞在增殖開始時向祖細胞階段逆轉，或者視網(wǎng)膜祖細胞大量增殖。有趣的是，在同樣發(fā)現(xiàn)了上皮形態(tài)有色細胞島的畸胎瘤中，Pax6表達于鄰近有色區(qū)的無色細胞中(資料未顯示)。先前的多種研究已顯示了RPE在培養(yǎng)中的去分化及其它們的反分化成以下類型細胞神經(jīng)元表型細胞(Reh和Gretton，1987，Skaguchi等，1997，Vinores等，1995，Chen等，2003)、神經(jīng)元、無長突細胞和光感受器細胞(Zhao等，1995)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Skaguchi等，1997)、神經(jīng)視網(wǎng)膜(Galy等，2002)和神經(jīng)祖細胞(Opaz和Dziak，1993)。所述的祖細胞可輪流與RPE樣細胞共存于培養(yǎng)物中或作為RPE樣細胞去分化的結果出現(xiàn)。同時，神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞在體外可反分化成RPE(Opas等，2001)，因此選擇性的，微管蛋白βIII和Pax6陽性細胞可代表共分離的神經(jīng)細胞或神經(jīng)祖細胞反分化成RPE樣細胞的瞬時階段。
使用以下實施例所述方法可使hES細胞自發(fā)分化成RPE樣細胞，且本發(fā)明的發(fā)明者注意到有色上皮細胞確實出現(xiàn)于6-8周以上的培養(yǎng)物中，且它們的數(shù)量隨時間增加-在3-5個月內(nèi)幾乎每個EB都有一個大的有色區(qū)。除了所述的hES細胞系之外，還有6個更新的衍生hES細胞系轉變成PRE樣細胞，這表明由于ES細胞通常自發(fā)選擇神經(jīng)系統(tǒng)的方向，通過將默認設置為所述途徑的高級階段可產(chǎn)生RPE樣細胞。還可能在所述的長期培養(yǎng)中，正在分化的hES細胞形成了一個多層的外環(huán)境，被許可的/或有益的分化信號來自細胞外基質(zhì)和hES細胞分化衍生物所產(chǎn)生的生長因子。HES細胞分化成RPE樣細胞的模型可作為有效的工具用于研究所述的微環(huán)境如何協(xié)調(diào)RPE分化和反分化。
RPE在光感受器的維護中起重要的作用，而體內(nèi)的各種RPE障礙與許多視覺改變的疾病有關，諸如RPE脫離、營養(yǎng)不良、萎縮、視網(wǎng)膜病變、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑萎縮或變性，包括年齡相關的黃斑變性，它可導致光感受器受損和失明。由于它所具有的傷口愈合能力，RPE被廣泛研究應用于移植療法中。
研究表明在多種動物模型和人中(Gouras等，2002，Stanga等，2002，Binder等，2002，Schraermeyer等，2001，Lund等綜述，2001)，RPE移植具有良好的視覺修復潛能。最近另一有關RPE移植的預期生態(tài)位被提出并甚至達到了臨床試驗階段因為這些細胞分泌多巴胺，它們可用于治療帕金森癥(Subramanian，2001)。不過，即使在免疫特許的眼睛內(nèi)，如果使用異源移植物，也存在移植的排斥反應的問題，從而阻礙了此方法的進步。另一問題是對胎兒組織的依賴性問題，因為成年RPE的增殖潛能非常低。
作為免疫相容性組織的來源，hES細胞被期望用于移植療法中，因為免疫排斥的問題可用核轉移即使克服。人ES細胞新分化衍生物-視網(wǎng)膜色素上皮樣細胞以及所述分化體系的可靠性和簡單性可能為移植提供了有吸引力的RPE細胞潛在來源。
實施例實施例1在長期培養(yǎng)中自發(fā)分化成有色上皮細胞在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的條件下當hES細胞在MEF中培養(yǎng)過滿時，它們形成了厚的多層細胞。約6周后，在較大的細胞叢中出現(xiàn)了黑色的細胞島(圖1)。這些黑色細胞可以用裸眼很容易觀察到并且在圖1A所示的細胞板中看起來象“雀斑”。在較高的放大倍數(shù)上，這些細胞島看上去象典型的上皮細胞鵝卵石單層中緊密堆積的多邊形細胞，在胞質(zhì)中有褐色的色素(圖1C)。細胞內(nèi)的色素量有差異，島中心部位具有最多的色素，而靠近邊緣的最少(圖1E、F)。
在前6-8周，當hES細胞形成胚狀體(EB)時，有色上皮細胞出現(xiàn)于大約1-2％的EB中(圖1B)。隨時間推移，越來越多的EB發(fā)育成有色細胞，到3個月的時候幾乎每個EB都有有色上皮區(qū)(圖1D)。EB有色區(qū)內(nèi)的細胞形態(tài)類似于黏附培養(yǎng)的細胞(圖1D)。
實施例2有色上皮細胞的分離和培養(yǎng)本發(fā)明的發(fā)明者從黏附的hES細胞培養(yǎng)物和EB二者中分離有色上皮細胞。用酶(胰酶和/或膠原酶和/或ordispase)消化有色的多邊形細胞，用玻璃毛細管選擇性的從這些有色島中挑選細胞。盡管小心的只挑選有色細胞，但分離的細胞群總是包含某些非有色細胞。將細胞在明膠或層粘連蛋白上鋪1-2天后，這些細胞被認為是原代培養(yǎng)細胞(PO)。
原代培養(yǎng)物包含有色多邊形細胞島以及某些單個的有色細胞。培養(yǎng)3-4天后，看上去已失去了上皮細胞的形態(tài)(變得更平且細胞具有扁平狀偽足)的無色細胞出現(xiàn)在某些細胞島的外周(圖2)。所述外周細胞數(shù)目隨時間推移而增加，表明這些細胞正在增殖，2周后，新形成的單層細胞中大部分細胞不含或含很少的色素。繼續(xù)培養(yǎng)2-3周后，有色上皮細胞開始重新出現(xiàn)，與最初的培養(yǎng)物沒有明顯的區(qū)別(圖2)。
實施例3RPE標志物的檢測將這些分化的人細胞初步定性為RPE是基于它們與先前所描述的RPE培養(yǎng)物的相似性，主要是，它們的上皮形態(tài)和含有色素。人體中有三種有色上皮細胞視網(wǎng)膜和虹膜有色上皮和角質(zhì)形成細胞，但后者不分泌色素。上皮結構和鵝卵石的形態(tài)也不是其它有色細胞所共有的，例如黑素細胞。
還值得注意的是RPE細胞在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)為丟失而后重新獲得它們的色素和上皮形態(tài)(Zhao 1997，Opas和Dziak，1994)，而且有色細胞也有相似方式的表現(xiàn)，由此檢驗ES衍生細胞可能是RPE的假設，它們可以用針對已知RPE標志物促貝斯特素和CRALBP的抗體進行染色。圖4(左邊組圖)顯示了促貝斯特素(A)和CRALBP(C)的膜定位，在有色上皮島中都能找到。不是所有的細胞都被這些抗體染色，而且染色的強度與色素表達和群落“緊密度”相關-在細胞更大且更松散堆積的各有色島的邊界處兩種蛋白質(zhì)都顯示出較低的表達。
為了進一步表征可能的RPE細胞，用蛋白質(zhì)印跡法分析了促貝斯特素、CRALBP的表達。圖4(右側組圖)顯示了細胞裂解物中相應于促貝斯特素，68kD(a)、CRALBP，36kD(b)的條帶。所有這些蛋白質(zhì)均在兩種原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)并隨后被傳代。
用實時RT-PCR在RPE樣細胞中找到了另一已知的PRE標志物，RPE65(圖4，右側組圖，底部)，PEDF ELISA檢測顯示了PEDF存在于所有假定RPE培養(yǎng)物的細胞裂解物中，而蛋白質(zhì)印跡分析顯示了一條大約48kD的條帶(未顯示)。
RPE樣培養(yǎng)物中神經(jīng)元和視網(wǎng)膜祖細胞標志物的檢測圖4顯示了PAX-6、Pax2、mitf和微管蛋白βIII在新傳代和舊培養(yǎng)的hES細胞衍生RPE中的定位。在增殖培養(yǎng)物中(胰酶消化3天后，未顯示)，增殖細胞喪失了RPE樣形態(tài)，幾乎每個細胞都顯示出存在mitf、Pax6、微管蛋白βIII和nestin(未顯示)。Pax2只在一小類呈現(xiàn)mitf陰性的細胞中找到，而存在很大程度的Pax6/mitf、mitf/微管蛋白βIII和Pax6/微管蛋白βIII共定位。在舊的培養(yǎng)物靜止培養(yǎng)21天，有色上皮島復原后，PAX-6和mitf大部分發(fā)現(xiàn)于有色上皮島之間的非上皮形態(tài)的無色細胞中(圖4，A-C)，而微管蛋白βIII則具有相似模式的分布(未顯示)。不過，存在mitf陽性和Pax6陰性細胞群，定位接近有色島的外周(圖4，A-C)。Pax2只在很少的mitf陰性細胞中找到(圖4，E-H)。在“成熟”的有色上皮島細胞中曾發(fā)現(xiàn)檢測不到這些蛋白質(zhì)中任何一種的存在。不過，在只具有某些RPE特征的細胞內(nèi)的這些標記物通常是明顯的，即，或者看上去象上皮但無色素，或者在某些遠離有色上皮島的單個有色細胞中。
實施例4來自hES細胞系H9的RPE樣細胞和來自Cyno-1ES細胞的ACT J-1和來自現(xiàn)存hES細胞系H1和H7的RPE樣細胞衍生物的表征擴充培養(yǎng)RPE樣細胞系，并為了凍存和復蘇進行檢測，用以下方法和RPE細胞的分子標記物進行定性用蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光檢測促貝斯特素和CRALBP，用ELISA和蛋白質(zhì)印跡法檢測PEDF，以及用RT-PCR檢測REP65。將細胞注入SCID小鼠，以未分化的hES或Cyno-1細胞作為對照評估腫瘤發(fā)生率。在商用臨床實驗室中研究角化類型的RPE樣細胞。然后如本申請書中另外描述的進行RPE樣細胞功能特性的定性和它們移植潛能的研究，同時使用了本領域技術人員已知的那些技術。
用Affymetrix人類基因組芯片完成了基因表達圖譜的檢測。比較了來自ES細胞的RPE樣細胞和來自尸檢的視網(wǎng)膜樣品中基因的表達情況。用數(shù)種動物模型驗證移植RPE樣細胞的有效性，包括但不局限于，恒河猴、大鼠和免子。
實施例5保證RPE樣細胞的高產(chǎn)量的分化培養(yǎng)體系的優(yōu)化ES細胞培養(yǎng)于營養(yǎng)細胞層上或作為胚狀體(EB)在bFGF、胰島素、TGF-β、IBMX、bmp-2、bmp-4或它們的組合物存在的條件下培養(yǎng)，包括逐步添加營養(yǎng)成分。或者，將ES細胞培養(yǎng)于多種胞外基質(zhì)包被的平板上(層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、Matrigel等)，用來評估ECM在RPE形成中的作用。在不同的時間間隔利用實時RT-PCR檢測早期RPE祖細胞的分子標志物(Pax6、Pax2、mitf)和RPE細胞的分子標志物(CRALBP、促貝斯特素、PEDF、REP65)的表達，以證實和確定上文所提及試劑的成功組合和在RPE樣細胞或其祖細胞中產(chǎn)生富集的逐步過程。此方法還可用于產(chǎn)生RPE和其它眼睛組織共同的祖細胞，諸如光感受器和神經(jīng)視網(wǎng)膜，它們由于其分化潛能而被分離和進一步定性并用于移植試驗中。
實施例6來自現(xiàn)存的和新的ES細胞系的RPE和其它眼睛組織祖細胞的衍生物利用基因表達圖譜的數(shù)據(jù)，將RPE祖細胞標志物的表達與表面蛋白的表達聯(lián)系起來，以發(fā)現(xiàn)針對RPE祖細胞的表面標志物的獨特組合。如果發(fā)現(xiàn)了這樣的標志物，可用抗表面蛋白質(zhì)的抗體分離純的RPE祖細胞群，然后進行培養(yǎng)并進一步在培養(yǎng)中分化，或者用于移植試驗中使其在移植后再分化。
如果來自基因表達圖譜的資料不夠充分，為了分離RPE祖細胞，可以使用以下方法。在以Pax6啟動子作為對照的條件下用GFP轉染ES細胞和RPE樣細胞，挑選穩(wěn)定的轉染子。從被轉染的分化ES細胞或增殖(去分化)RPE細胞培養(yǎng)物中，通過FACS分離GFP/Pax6陽性細胞并用作抗原注射小鼠以產(chǎn)生針對Pax6陽性細胞表面分子的單克隆抗體。因為Pax6只存在于RPE祖細胞中，用幾種策略可完成篩選(通過FACS)a)抗正在增殖的RPE樣細胞，b)抗Pax2陽性RPE細胞，c)抗mitf陽性RPE細胞。對于b)和c)而言，將在相應啟動子控制下用GPP轉染RPE細胞；使用無這些抗原的RPE或ES細胞作為陰性對照。擴充培養(yǎng)經(jīng)上述所有三種策略選定的陽性克隆后，檢測抗體對篩選中所用的所有類型細胞的反應并進行進一步分析因為此方法可產(chǎn)生識別特異和非特異于RPE祖細胞細胞表面抗原的抗體，就可檢測來自正在分化的ES細胞群總體的細胞或用這些抗體選定的RPE細胞的RPE祖細胞分子標志物和它們產(chǎn)生RPE的能力。
利用優(yōu)化的確定的階梯式步驟產(chǎn)生RPE或其它眼組織早期祖細胞以及它們獨特表面標志物的抗體，可從已分化的ES細胞中分離所述祖細胞并進行體外培養(yǎng)。用目標2中所述策略研究它們分化成各種眼睛組織的能力。
已產(chǎn)生RPE樣細胞的三個ES細胞系(H9、ACT J-1、Cyno-1)、RPE-樣細胞將被用于繼續(xù)產(chǎn)生如目標1和目標2中所述的RPE樣細胞和它們的祖細胞，而HI和H7hES細胞系將被用于產(chǎn)生新的RPE樣細胞系。在擴充培養(yǎng)并對RPE的分子標志物進行定性后，將這些細胞系進行單一的克隆，對所產(chǎn)生的系列如目標1所述進行鑒定。符合RPE細胞標準的細胞系將用于移植試驗。新的人ES細胞系將來自未用過的IVF胚胎，來自捐贈者的卵母細胞，受刺激后不受精即發(fā)育(孤雌)，應用核轉移技術從所產(chǎn)生的獲自捐贈卵母細胞并正在發(fā)育的胚泡中產(chǎn)生新的人ES細胞系。RPE樣細胞和常見的眼睛祖細胞將用目標2中的方法獲自這些細胞系，依照目標1鑒定所產(chǎn)生的細胞系。[任選的]從無病毒體系中產(chǎn)生新的人ES細胞系、鑒定并提交臨床試驗。
實施例7在各種動物模型中RPE樣細胞和祖細胞對色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性的治療潛能在cynomologus猴(短尾猿)中檢測靈長類ES細胞。開始，進行玻璃體切除術并將細胞移植入動物的視網(wǎng)膜下空間處。第一步移植懸浮液形式的細胞，然后移植基底或基質(zhì)形式的細胞，以產(chǎn)生單層移植。這也可利用衍生自人ES細胞的細胞在免疫抑制的患色素性視網(wǎng)膜炎的兔子或多種其它動物模型中完成，包括嚙齒動物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶狀小鼠、RCS大鼠、貓(阿比西尼亞貓)和狗(視錐病變″cd″狗、進行性視桿-視錐病變″prcd″狗、早期視網(wǎng)膜病變″erd″狗、1、2和3型視桿-視錐發(fā)育異?！錼cd1、rcd2和rcd3″狗、光感受器發(fā)育異?！錺d″狗和Briard“RPE-65”狗)。用熒光血管造影術、組織學方法(是否存在光感受器恢復)和可能的ERG進行檢查。也可進行功能檢查，包括吞噬作用(光感受器片段)、維生素A代謝、緊密連接的傳導性和電子顯微鏡。
實施例8來自人的胚胎來源細胞的RPE細胞的直接分化在使用或不使用免疫外科手術去除滋養(yǎng)外胚層的條件下將人胚泡期胚胎放在小鼠或小雞的胚胎成纖維細胞上或者直接放在胞外基質(zhì)蛋白包被的組織培養(yǎng)器皿中。細胞直接分化，而不是培養(yǎng)和傳代產(chǎn)生人ES細胞系。
在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的條件下當hES細胞在MEF中培養(yǎng)過滿時，它們形成了厚的多層細胞。(或者如本領域技術人員所已知的可以用生長因子、培養(yǎng)基和FBS改變直接分化。)約6周后，在較大的細胞叢中出現(xiàn)了黑色的細胞島。這些黑色細胞可以用裸眼很容易觀察到并且在圖5B所示的細胞板中看起來象“雀斑”。在較高的放大倍數(shù)上，這些細胞島看上去象典型的上皮細胞鵝卵石單層中緊密堆積的多邊形細胞，在胞質(zhì)中有褐色的色素(圖5A)。細胞內(nèi)的色素量有差異，島中心部位具有最多的色素，而靠近邊緣的最少(圖5B)。
盡管通常不會，但當hES細胞直接分化時它們可能形成胚狀體(EB)。在前6-8周，有色上皮細胞出現(xiàn)于大約1-2％的這些分化細胞和/或EB中。隨時間推移，越來越多的EB發(fā)育成有色細胞，到3個月的時候幾乎每個EB都有有色上皮區(qū)。EB有色區(qū)內(nèi)的細胞形態(tài)非常類似于黏附培養(yǎng)的細胞。
材料和方法MEF培養(yǎng)基高葡萄糖DMEM，補充了2mM GlutaMAXI和500u/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素(均來自Invitrogen)和16％FCS(HyCLone)。HES細胞生長培養(yǎng)基基因敲除用高糖DMEM，補充了500u/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素、1％非基本氨基酸溶液、2mM GlutaMAXI、0.1mMβ-巰基乙醇、4ng/ml bFGF(Invitrogen)、1-ng/ml的人LIF(Chemicon，Temecula，CA)、8.4％的置換血清(SR，Invitrogen)和8.4％Plasmanate(Bayer)。衍生培養(yǎng)基包含與生長培養(yǎng)基同樣的組分，不同之處在于與生長培養(yǎng)基相比，它具有較低濃度的SR和Plasmanate(各4.2％)以及8.4％FCS和2倍濃度的人LIF和bFGF。EB培養(yǎng)基除了bFGF、LIF和Plasmanate之外與生長培養(yǎng)基相同；SR濃度是13％。RPE培養(yǎng)基50％EB培養(yǎng)基和50％MEF培養(yǎng)基。
HES細胞系用于這些試驗的細胞系hES 35、36、45是改進先前所報道方法的方法產(chǎn)生的(Thomson等，1998，Reubinoff等，2000，Lanzendorf等，2001)。經(jīng)兩個制度審查委員會的批準，人凍存的胚泡(系列hES35)或裂開的胚胎(系列hES36和hES45)由已完成生育力治療的夫婦捐贈用于研究。
用黏附的hES細胞或胚狀體(EBs)進行分化實驗。對于黏附分化而言，hES細胞可以在MEF中長滿，直至hES細胞失去它們的緊密邊緣，此時用EB培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基(通常是在傳代8-10天后)。
每1-2天換一次培養(yǎng)基。為了EB形成，將hES細胞用胰酶消化并在低黏附平板(Costar)上培養(yǎng)于EB培養(yǎng)基中。
免疫染色將細胞固定于2％多聚甲醛，用0.1％ NP-40使其可滲透以便胞內(nèi)抗原的定位，用PBS(Invitrogen)配制的10％山羊血清、10％的驢血清(Jackson Immunoresearch Laboratories，West Grove，PA)封閉至少1小時。在4℃與一抗保溫過夜，加入二抗(JacksonImmunoresearch Laboratories，West Grove，PA)一小時。在所有保溫操作之間用PBS配制的0.1％ Tween-20(Sigma)洗滌樣品3-5次，每次10-15分鐘。用帶DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Burlingame，CA)為樣品著色并在熒光顯微鏡下(Nikon)觀察。堿性磷酸酶的定位或是用Vector Red(Vector Laboratories，Burlingame，CA)定位于活細胞或是依照制造商的說明在免疫染色期間的第二次洗滌后進行定位。所用的抗體促貝斯特素(Novus Biologicals，Littleton，CO)、抗CRALBP抗體由Dr.Saari，University ofWashington惠贈。二抗來自Jackson Immunoresearch Laboratories，而鏈霉親和素-FITC購自Amersham。
RPE樣細胞的分離和傳代用PBS漂洗黏附培養(yǎng)的hES細胞或EB兩次并在0.25％胰酶/1mMEDTA(Invitrogen)中37℃保溫直至細胞單層松散。用玻璃毛細管將有色區(qū)的細胞刮下，轉移到MEF培養(yǎng)基中，200Xg離心，并放到明膠包裹平板內(nèi)的RPE培養(yǎng)基中。細胞附著后更換培養(yǎng)基(通常在1-2天內(nèi))，之后每5-7天換一次；每2-4周用0.05％胰酶/0.53mM EDTA(Invitrogen)將細胞傳代。
蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA用Laemmli緩沖液(Laemmli，1970)制備樣品，緩沖液中補充有5％的巰基乙醇和混合蛋白酶抑制劑(Roche)，煮沸5分鐘并用Mini-Protean裝置加到8-16％梯度凝膠(Bio-Rad，Hercules，CA)上；每塊膠在25-30mA進行電泳；以20伏電壓過夜將蛋白質(zhì)轉移到0.2的硝酸纖維素膜(Schleicher and Shull，Keene，NH)上。用Ponceau Red(Sigma)對印跡膜進行暫時染色使條帶可見，用Milli-Q水進行洗滌，并用溶于0.1％ TBST(Bio-Rad)的5％脫脂奶粉封閉1小時。加入抗促貝斯特素、CRALBP或PEDF(Chemicon)的一抗2小時，然后用TBST洗3次，每次15分鐘；加入過氧化物酶綴合的二抗1小時，并重復上述洗滌。用Super-Signal試劑(Pierce)通過ECL體系檢測印跡。依照制造商的說明用PEDF ELISA試劑盒(Chemicon)對細胞裂解物進行PEDF ELISA分析。
實時RT-PCR通過兩步法從分化的ES培養(yǎng)物中提純總RNA。用Trizol試劑(Invitrogon)分離天然RNA并進一步用Rnrazy小柱(Qiagen)進行純化。用商品化的用于RPE 65檢測的引物對(Assay on Demand &num；Hs00165642ml，Applied Biosystems)和Quantitect Probe RT-PCR試劑(Qiagen)，依照制造商的(Qiagen)說明通過實時PCR監(jiān)測RPE65轉錄物的水平。
未分化hES細胞系的衍生和表征這些試驗中用了兩個雌性、一個雄性hES細胞系。有關這些hES細胞系衍生的細節(jié)在別處也有報導。所有細胞系已傳代超過50次，在此期間它們保持未分化的集落形態(tài)、高堿性磷酸酶活性且表達Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA I-60和TRA I-81(數(shù)據(jù)未顯示)。其中兩個細胞系具有標準的核型(hES36，hES35)，而在hES45中即有標準的也有非整倍體的亞群。由于在體外以及在畸胎瘤中的自發(fā)分化，所有細胞系均表達三胚芽層的標志-肌肉肌動蛋白、α-胎蛋白和微管蛋白βIII。
實施例9利用轉錄基因組鑒定離體分化的正常分化細胞Transcriptomics-hES-細胞衍生物可能在未來的再生醫(yī)學中扮演著重要的角色。這些衍生物和其它干細胞衍生物的定性檢測仍然是一個挑戰(zhàn)，可以用功能性基因組的方式進行處理。我們比較了hES-RPE相對于體內(nèi)同等物-胎兒RPE細胞的轉錄圖譜，研究者已對它的移植價值進行了廣泛的研究。然后將兩個圖譜都與先前所報導的(Rogojina等，2003)有關人RPE細胞系轉錄物組的資料進行比較。
將我們數(shù)據(jù)組中的基因表達圖譜與兩種人RPE細胞系(未轉化的ARPE-19和已轉化的D407，Rogojina等，2003)進行比較以確定hES-RPE是否具有相似的普遍轉錄特征。為了說明表達于所有細胞中的共同的持家基因，我們使用了來自未分化hES細胞(H1系列，h1-hES，--sato等，2003)和支氣管上皮細胞(BE，Wright等，2004)、公認可利用的Affymetrix數(shù)據(jù)組作為對照，因為它們具有共同的上皮來源，從而可以排除共同的持家基因和上皮基因并確定RPE特異性基因。
在hES-RPE、hES-RPE-TD、ARPE-19、D407之間存在相似性和差異性。通過分析存在于hES-RPE/ARPE-19但不存在于BE(1026個基因)中的那些基因之間唯一的交叉點進一步證實了它們的相似性。為了說明背景，我們將這與存在于BE/hES-RPE但不存在于ARPE-19(186個基因)中的唯一交叉點進行了比較，這樣產(chǎn)生的hES-RPE和ARPE-19中的相似性比用BE進行比較所產(chǎn)生的要高5倍到6倍。D407/ARPE19看上去丟失了RPE特異性基因，諸如RPE65、促貝斯特素、CRALBP、PEDF，它是典型的長期傳代細胞(圖6)。進一步的資料庫顯示已知的RPE特異存在處，諸如黑色素生物合成、視覺、維生素A結合等，只存在于胎兒RPE和ES-RPE中，但不存在于ARPE19中。
將hES-RPE、ARPE-19和D407與它們的體內(nèi)同等物-新鮮分離的人胎兒RPE(feRPE)進行比較，結果與我們早先的資料一致，證明了hES-RPE與人feRPE之間的轉錄同一性顯著高于D407與fe RPE之間(2.3倍差異-849個基因/373個基因)和ARPE-19與feRPE之間(1.6倍差異-588個基因/364個基因)的同一性(圖5c/5d)。以上鑒定的只存在于hES-RPE中而不存在于ARPE-19或D407中的RPE特異性標志也存在于feRPE中，表明hES-RPE與其體內(nèi)同等物之間的相似程度比培養(yǎng)的RPE細胞系之間的相似程度要高。
hES-RPE中的784個基因在feRPE和ARPE-19數(shù)據(jù)組中沒有。由于保持“滋生”基因可能在移植入患者體內(nèi)時潛在的引起hES衍生物轉化成惡性的畸胎瘤，所以我們利用目前可利用的Affymetrix點陣數(shù)據(jù)組(Abeyta等2004 Sato 2003)建立了保守的潛在“滋生”基因數(shù)據(jù)。這產(chǎn)生了出現(xiàn)于所有12個數(shù)據(jù)組中的3806個基因的列表(包括共同的持家基因)。存在于hES-RPE數(shù)據(jù)組但不存在于feRPE-ARPE-19中的784個基因中只有36個是與3806個潛在滋生基因是相同的。這些基因中沒有一個是諸如Oct4、Sox2、TDGF1等已知的滋生性基因。
實施例10利用RPE細胞治療帕金森癥因為hRPE分泌L-DOPA，所以它們可作為備選細胞來源用于帕金森癥細胞療法中。研究顯示所述的附著于明膠包被微載體上的細胞可成功的被移植入一側患帕金森癥的猴子中并產(chǎn)生并顯著改善癥狀(每個靶目標移植1萬至5萬個細胞)，而在FDA核準的試驗中，開始在接受hRPE條紋內(nèi)移植的2000名患者中均未觀察到有不利的效果。使用hES細胞來源RPE的許多優(yōu)勢之一是它避開了捐贈的眼組織不足的問題。同時還促進了基因療法的應用。
其它實施方案從前文的敘述中，顯而易見可對本文所述的本發(fā)明進行變更和修飾以使其適應不同的用途和條件。
權利要求
1.用于治療或預防視網(wǎng)膜變性的方法，包括使用選自下組細胞中的至少一種RPE細胞、RPE樣細胞、由哺乳動物胚胎干細胞衍生的RPE或RPE樣祖細胞。
2.權利要求1的方法，其中視網(wǎng)膜變性狀況選自下組中的至少一種色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性。
3.權利要求1的方法，還包括通過玻璃體切割術將細胞移植到眼球的視網(wǎng)膜下空間中。
4.權利要求3的方法，其中細胞在懸浮液、基質(zhì)、或基底中進行移植。
5.權利要求2的方法，其中色素性視網(wǎng)膜炎與動物模型有關。
6.權利要求5的方法，其中動物模型選自下組rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、矮胖樣小鼠、RCS大鼠、阿比西尼亞貓、視錐變性“cd”犬、進行性視桿-視錐變性“prcd”犬、早期視網(wǎng)膜變性“erd”犬、視桿-視錐發(fā)育異常1、2和3“rcd1、rcd2和rcd3”犬、光受體發(fā)育異常“pd”犬、和Briard“RPE-65”犬。
7.權利要求6的方法，其中使用行為測試、熒光血管造影術、組織學、和功能測試諸如測量細胞進行吞噬(光受體片段)的能力、維生素A代謝、緊密接頭傳導性、或使用電子顯微鏡的評估其中一項或多項來評估動物模型的治療效果。
8.用于使hES細胞自發(fā)分化成RPE細胞、RPE樣細胞、或RPE祖細胞的方法，所述方法包括a)使hES細胞培養(yǎng)物在MEF上過度生長；b)使hES細胞培養(yǎng)物形成厚厚的多層細胞；c)培養(yǎng)hES細胞；d)由得到的細胞培養(yǎng)物分離并培養(yǎng)有色RPE細胞、REP樣細胞、和/或RPE祖細胞。
9.權利要求8的方法，其中分離并培養(yǎng)RPE樣細胞包括a)用酶消化培養(yǎng)的hES細胞或EB′s；b)選擇性分離有色細胞；c)將分離的細胞平板接種在明膠或層粘連蛋白上培養(yǎng)1-2天以形成原代培養(yǎng)物(P0)；d)將原代培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)至多達3周的一段時間；和e)分離RPE樣細胞。
10.權利要求9的方法，其中酶選自下組中的一種或多種胰蛋白酶、膠原酶、和分散酶。
11.權利要求8的方法，其中培養(yǎng)RPE細胞以建立新的RPE細胞系。
12.權利要求11的方法，其中RPE細胞系分化成交替譜系，包括在培養(yǎng)中用bFGF或FGF處理RPE細胞系。
13.權利要求11的方法，其中在RPE樣細胞衍生自不同ES細胞系時，新的RPE細胞系因至少一種選自下組的特征與早已建立的RPE細胞系不同生長速率、色素表達、在培養(yǎng)中去分化、和在培養(yǎng)中再分化。
14.用于使RPE系或RPE細胞前體衍生成具有增加的預防新血管生成能力的RPE細胞的方法，所述方法包括a)使來自動物的體細胞老化，使得端粒酶縮短，其中細胞已經(jīng)度過了至少10％的正常復制壽命；和b)使用體細胞作為核移植供體細胞以生成過度表達血管發(fā)生抑制物的細胞，其中血管發(fā)生抑制物可以是色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)。
15.權利要求14的方法，其中用抑制新血管生成的外源基因遺傳修飾體細胞。
16.權利要求8的方法，其中RPE樣細胞衍生自HLA區(qū)純合性ES或胚胎衍生細胞庫使得ES衍生細胞具有降低的HLA抗原復雜性。
17.權利要求8的方法，其中ES細胞衍生自人。
18.用于治療帕金森氏病的方法，包括移植RPE樣細胞或祖細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于視網(wǎng)膜變性的改良的基于細胞的療法和用于使人胚胎干細胞和人胚胎衍生細胞分化成視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞和其它視網(wǎng)膜祖細胞的方法。
文檔編號A61K35/12GK1968608SQ200580007359
公開日2007年5月23日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權日2004年1月23日
發(fā)明者I·V·克利曼斯卡亞 申請人:先進細胞技術公司