專利名稱：用于治療視網(wǎng)膜變性病的改良模式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及用于視網(wǎng)膜變性和其它視覺障礙的改良的基于細(xì)胞療法及帕金森氏病治療和用于使哺乳動物胚胎干細(xì)胞和哺乳動物胚胎衍生細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和其它眼球組織包括但不限于視桿、視錐、兩極、角膜、神經(jīng)、虹膜上皮、和祖細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ的許多部分都呈現(xiàn)出薄層狀的組織，而神經(jīng)病理學(xué)過程通常涉及這些復(fù)合細(xì)胞層中一層以上的組織。CNS疾病常常包括神經(jīng)細(xì)胞損失，而且由于缺乏內(nèi)源性的再生，CNS相關(guān)疾病后功能的有效恢復(fù)非常有限或者沒有。具體而言，常見的視網(wǎng)膜疾病中已知的年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)是由于光感受器與視網(wǎng)膜色素上皮(RPE) —起損失造成的，另外不定量的涉及內(nèi)核層(INL)的中間(“傳遞”)神經(jīng)元。因此，恢復(fù)中度至高度敏銳的視覺需要從功能上置換某些或所有的受損細(xì)胞層。在解剖學(xué)上，色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，一種遺傳性的視網(wǎng)膜病變，是光感受器細(xì)胞核數(shù)目持續(xù)減少導(dǎo)致視力喪失。盡管大部分形式RP之間表型相似，但它們潛在的細(xì)胞機制是不同的，且是由于許多基因的各種突變造成的。大部分涉及的突變改變了光感受器細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，其中大約10%是由于視紫紅質(zhì)基因的突變造成的。在該疾病的其它類型中，調(diào)控凋亡的基因被改變了(例如，Bax和1^x2)。AMD是包含分子水平上病因可能有所不同的一系列病變在內(nèi)的一種臨床診斷。所有的AMD病例都具有在中央視網(wǎng)膜內(nèi)光感受器細(xì)胞丟失的特征。不過，這一共同的最終現(xiàn)象似乎是早期RPE、新血管形成和潛在脈絡(luò)膜水平異常的次級后果。后者可能涉及光感受器膜翻折困難，具體機理目前尚不清楚。此外，視網(wǎng)膜色素上皮是眼睛內(nèi)最重要的細(xì)胞類型之一，因為它對于維持光感受器功能而言至關(guān)緊要。它具有幾種復(fù)雜的功能，包括對視桿和視錐的脫落外部片段的吞噬作用、維生素A的代謝、視網(wǎng)膜底空間內(nèi)代謝物交換中涉及的黏多糖合成、代謝物的轉(zhuǎn)運、 血管發(fā)生的調(diào)控、光吸收、圖像分辨率的增強以及通過諸如蛋白酶和蛋白酶抑制劑等分泌蛋白進(jìn)行的視網(wǎng)膜內(nèi)許多其它功能的調(diào)控。在AMD的某些病例中顯現(xiàn)的另一特征是出現(xiàn)異常的血管，這導(dǎo)致了大家所知道的脈絡(luò)膜新血管形成(CNV)病。這種新血管(“濕的”)形式的AMD特別具有破壞性，而且似乎是由于對血管發(fā)生缺乏適當(dāng)?shù)恼{(diào)控所造成的。RPE功能障礙造成的脈絡(luò)膜破裂使得新血管從脈絡(luò)膜循環(huán)進(jìn)入視網(wǎng)膜底空間，在那它們可破壞外部區(qū)段組織并引起血管滲漏或出血導(dǎo)致額外的光感受器損失。CNV可激光定向治療。因此，激光治療“濕”AMD在美國是普遍使用的。不過，這通常存在令人不快的副作用，因此患者不滿意治療效果。這是由于如果發(fā)生了激光燒傷，它們會涉及光感受器死亡和視野內(nèi)相應(yīng)部分的絕對的、不能挽回的視覺缺失。此外，激光治療不能使?jié)撛诘囊谆疾◇w質(zhì)向CNV的發(fā)展。事實上，激光燒傷已被用作常規(guī)方法誘發(fā)猴子的 CNV(Archer和Gardiner" 1981)。在諸如英國等其它國家內(nèi)斑點激光治療CNV的使用要保守的多。對于更常見的“干”式AMD則沒有一般公認(rèn)的療法，其中存在與斑點內(nèi)RPE萎縮的不規(guī)則碎片重疊的光感受器損失和被稱為玻璃疣的相關(guān)胞外物質(zhì)。由于RPE在光感受器維護(hù)和血管發(fā)生的調(diào)控中起重要作用，各種體內(nèi)RPE功能障礙都與改變視力的疾病相關(guān)，諸如色素性視網(wǎng)膜炎、RPE脫離、發(fā)育不良(displasia)、萎縮、視網(wǎng)膜病變、黃斑變性或變性，包括年齡相關(guān)的黃斑變性，它們可導(dǎo)致光感受器損傷和失明。特別是除了 AMD之外，影響黃斑的多種其它變性疾病包括，但不局限于視錐變性、視錐-視桿變性、malattia leventinese、多因蜂窩狀萎縮(Doyne honeycomb dystrophy)、Sorsby' s 變性、Stargardt 病、pattern/butterfly 變性、貝氏卵黃狀變性、 北卡羅林納變性、中央網(wǎng)形脈絡(luò)膜變性、血管樣條紋癥和毒性黃斑變性。一般可繼發(fā)地影響黃斑的視網(wǎng)膜病變包括視網(wǎng)膜脫離、病理性近視、色素性視網(wǎng)膜炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、CMV視網(wǎng)膜炎、閉塞性視網(wǎng)膜血管病、早熟的視網(wǎng)膜病變 (ROP)、脈絡(luò)膜破裂、眼組織胞漿綜合癥(POHS)、弓形蟲病和Leber' s先天性黑朦。所有以上列舉的都不是窮舉的。所有以上病征均涉及光感受器的損失，因此，可供選擇的治療方法是不多的且不夠的。因為它的傷口修復(fù)能力，RPE已被廣泛試驗用于移植治療中。2002年，進(jìn)入試驗的一年，患者顯示出30-50%的改善。在幾種動物模型和人中都顯示出(Gouras等，2002， Stanga 等，2002, Binder 等，2002, Schraermeyer 等，2001，由 Lund 等綜述，2001) RPE 移植具有良好的視覺恢復(fù)潛能。不過，即使在諸如眼部等免疫特許的位置，也存在移植物排斥反應(yīng)的問題，阻礙了在異源移植時利用此方法。盡管新的光感受器(PRCs)已通過移植被從實驗上引入，但被移植的PRC在與宿主視網(wǎng)膜原存活神經(jīng)元之間的連接非常勉強。對胚胎組織來源的RPE細(xì)胞的依賴是另一問題，因為這些細(xì)胞已顯示出非常低的增殖潛能。Emory大學(xué)的研究者進(jìn)行了一個試驗，即他們將來自人眼供體的RPE細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并移植給6名晚期帕金森癥患者。盡管移植一年后發(fā)現(xiàn)癥狀減輕了 30-50%，但因眼睛供體不足，仍未經(jīng) FDA核準(zhǔn)，并會依然存在超過捐贈眼組織所能提供的需求。迄今為止，利用異位RPE細(xì)胞的療法已顯現(xiàn)出類似成纖維細(xì)胞的作用，并且與許多破壞性視網(wǎng)膜并發(fā)癥相關(guān)，包括軸突損失(Villegas-Perez等，1998)和具視網(wǎng)膜脫離現(xiàn)象的增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR) (Cleary和Ryan，1979)。以松散的片狀形式運送的RPE 趨向于卷起來。這導(dǎo)致光感受器不能有效覆蓋以及多層具有錯誤極性的RPE，可能造成囊腫形成或黃斑水腫。有關(guān)運送神經(jīng)視網(wǎng)膜移植物至患者眼睛的視網(wǎng)膜下(黃斑下)空間的情況可參閱文獻(xiàn)=Kaplan 等(1997)，Humayun 等(2000)和 del Cerro 等(2000)。其中存在的一個嚴(yán)重問題是神經(jīng)視網(wǎng)膜移植物通常在功能上不能與宿主視網(wǎng)膜一體化。此外，缺乏完整的RPE 單層意味著RPE功能障礙或脈絡(luò)膜的破壞未被矯正。二者都是視覺喪失的基本前提條件。因此，在任一目前的治療方法中都不存在有效的重組RPE的方式，因此各種方法都仍有不足，尤其是在移植物和宿主視網(wǎng)膜之間存在的功能不聯(lián)貫的基本問題。因此需要有改進(jìn)的視網(wǎng)膜治療方法。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供用于由干細(xì)胞衍生眼球細(xì)胞的改良方法，所述細(xì)胞包括但不限于神經(jīng)細(xì)胞包括水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞諸如視桿和視錐、角膜細(xì)胞、血管細(xì)胞、及RPE和RPE樣細(xì)胞，和提供用于治療視網(wǎng)膜變性的改良方法和療法。具體而言，這些方法牽涉由人胚胎干細(xì)胞衍生的RPE和RPE樣細(xì)胞的使用。本發(fā)明的一個實施方案提供了使用衍生自哺乳動物胚胎干細(xì)胞的RPE細(xì)胞、RPE 樣細(xì)胞、這些細(xì)胞的祖細(xì)胞或任何兩種或三種上述細(xì)胞的組合的視網(wǎng)膜變性療法生成細(xì)胞的改良方法，以治療多種狀況，包括但不限于色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性及相關(guān)狀況?？墒褂帽景l(fā)明生成的細(xì)胞類型包括但不限于RPE、RPE樣細(xì)胞、和RPE祖細(xì)胞。還可生成的細(xì)胞包括虹膜有色上皮(IPE)細(xì)胞。視覺相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞包括中間神經(jīng)元(例如，內(nèi)核層(INL) 的“傳遞”神經(jīng)元)和無長突細(xì)胞(在垂直方向第二突觸水平上相互作用的中間神經(jīng)元，所述途徑由光感受器-兩極-神經(jīng)節(jié)細(xì)胞鏈組成，它們在內(nèi)網(wǎng)織層(IPL)內(nèi)突觸水平上活躍并用于將呈遞給神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的視覺信息整合、調(diào)整并放入一暫時的區(qū)域內(nèi))也可利用本發(fā)明產(chǎn)生。此外，還可產(chǎn)生視網(wǎng)膜細(xì)胞、視桿、視錐和角膜細(xì)胞。在本發(fā)明的另一實施方案中， 還可產(chǎn)生提供眼睛脈管系統(tǒng)的細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可利用玻璃體切割術(shù)被移植入視網(wǎng)膜底空間。非限制性的例子包括將這些細(xì)胞在懸浮液、基質(zhì)或基底中進(jìn)行移植?？芍委煹纳匦我暰W(wǎng)膜炎的動物模型包括嚙齒動物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶狀樣小鼠、RCS大鼠、 貓(阿比西尼亞貓)，以及狗(視錐病變"cd〃狗、進(jìn)行性視桿-視錐病變"prcd"狗，早期視網(wǎng)膜病變〃 erd"狗、1型、2型和3型視桿-視錐發(fā)育異常"rcdl，rcd2 &rcd3〃狗、 光感受器發(fā)育異常"pd〃狗和Briard" RPE-65"(狗)。用行為試驗、熒光血管造影術(shù)、 組織學(xué)或功能檢測進(jìn)行評估，所述的功能檢測有諸如檢測細(xì)胞完成吞噬作用的能力(光感受器片段)、維生素A的代謝、緊密連接點傳導(dǎo)性等，或者用電子顯微鏡進(jìn)行檢查。與只局限于使用眼睛供體組織可能治療的患者人數(shù)相比，此處所提出方法的眾多優(yōu)勢之一在于它的生產(chǎn)能力和能治療更多的患者。本發(fā)明的另一實施方案提供了使hES細(xì)胞自發(fā)分化成具有無數(shù)RPE特征的細(xì)胞的方法。這些PRE制品能在培養(yǎng)中表現(xiàn)有所變化并在多次傳代中仍保持RPE的特征。本發(fā)明還提供了使已建立的RPE細(xì)胞系分化成預(yù)備的神經(jīng)元細(xì)胞系、角膜細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，非限制性的例子是通過使用bFGF或FGF。本發(fā)明的另一實施方案是從現(xiàn)存的和新的ES細(xì)胞系中衍生出新的RPE細(xì)胞系和祖細(xì)胞的方法。當(dāng)它們來自不同ES細(xì)胞系時，它們在特性上可能有所變化，諸如RPE樣細(xì)胞的生長速率、色素表達(dá)或培養(yǎng)中的去分化和再分化。它們在功能和核型穩(wěn)定性上可能有某些變化，因此希望能提供針對新RPE系列和新ES細(xì)胞系衍生物的方法，使得可以挑選具有預(yù)期特性的細(xì)胞系，能被無性繁殖選擇，以產(chǎn)生純的高質(zhì)量的RPE樣細(xì)胞群。也可來源于現(xiàn)存的和新的ES細(xì)胞系的細(xì)胞包括虹膜有色上皮(IPE)細(xì)胞。在另一實施方案中，包括中間神經(jīng)元(例如，內(nèi)核層(INL)的“傳遞”神經(jīng)元)和無長突細(xì)胞在內(nèi)的視覺相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞也可利用本發(fā)明產(chǎn)生。此外，可產(chǎn)生視網(wǎng)膜細(xì)胞、視桿、視錐和角膜細(xì)胞。在本發(fā)明的另一實施方案中，還可產(chǎn)生提供眼睛脈管系統(tǒng)的細(xì)胞。本發(fā)明的另一實施方案是產(chǎn)生具有增強的預(yù)防新血管形成能力的RPE細(xì)胞系衍生物或RPE細(xì)胞前體的方法。所述細(xì)胞可通過如下方式產(chǎn)生，即使來自患者的體細(xì)胞老化， 從而使端粒酶縮短，其中細(xì)胞正常復(fù)制壽命的10%被跨越，然后使用所述體細(xì)胞作為核轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞產(chǎn)生過表達(dá)諸如色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)等血管發(fā)生抑制劑的細(xì)胞。 或者所述細(xì)胞可用抑制新血管形成的外源基因遺傳修飾。本發(fā)明的另一實施方案利用了在HLA區(qū)域具有純合性的ES或胚胎來源細(xì)胞庫，從而使所述細(xì)胞在其HLA抗原上的復(fù)雜性降低。因此，本發(fā)明的另一實施方案包括ES來源RPE樣細(xì)胞的定性。盡管ES來源的有色上皮細(xì)胞在其形態(tài)學(xué)、行為和分子標(biāo)記上都非常類似RPE，但它們的治療價值取決于它們發(fā)揮RPE作用且不致癌的能力。因此，用以下一種或多種技術(shù)對ES來源RPE細(xì)胞進(jìn)行表征(i)評估它們的功能性，即光感受器片段的吞噬能力、維生素A的代謝、傷口愈合能力； ( )通過動物模型(作為非限制性的例子，此處可用SCID小鼠)移植評估RPE樣ES細(xì)胞衍生物的多能性；(iii)RPE樣細(xì)胞的表型和核型；(iv)通過基因表達(dá)圖譜評估ES細(xì)胞來源RPE樣細(xì)胞和RPE組織；(ν)在蛋白質(zhì)水平評估RPE分子標(biāo)記物的表達(dá)，包括促貝斯特素 (bestrophin)、CRALBP、RPE-65、PEDF。也可基于細(xì)胞中眼睛發(fā)育通常所需的轉(zhuǎn)錄激活劑的表達(dá)對其進(jìn)行評估，包括 rx/rax、chxl0/vsx-2/alx、ots-l、otx_2、six3/optx、six6/optx2、 mitf、pax6/mitf 禾口 pax6/pax2 (Fischer 禾口 Reh，2001，Baumer 等，2003)。本發(fā)明的另一實施方案是用至少以下一種技術(shù)對ES來源RPE樣細(xì)胞進(jìn)行定性的方法(i)評估ES來源RPE樣細(xì)胞的功能性；(ii)通過動物模型移植評估RPE樣ES細(xì)胞衍生物的多能性；(iii)RPE樣細(xì)胞的表型和核型；(iv)評估基因表達(dá)圖譜；(ν)在蛋白質(zhì)水平評估RPE的分子標(biāo)記物的表達(dá)；以及(vi)眼睛發(fā)育正常需要的轉(zhuǎn)錄激活劑的表達(dá)。在另一實施方案中，這些技術(shù)可被用于評估多重hES細(xì)胞來源的細(xì)胞類型。本發(fā)明的另一實施方案是不產(chǎn)生ES細(xì)胞系，直接從人和非人動物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs)衍生RPE細(xì)胞和RPE前體細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(EQ在未分化階段可體外不確定的維持并實質(zhì)上能分化成任一細(xì)胞類型。因此人的胚胎干細(xì)胞(hEQ可用于研究人細(xì)胞的分化，并被考慮作為移植療法的可能來源。迄今為止，已有關(guān)于人和小鼠ES細(xì)胞分化成許多細(xì)胞類型的報道(由Smith綜述，2001)，所述細(xì)胞類型包括心肌細(xì)胞[Kehat等，2001，Mummery等，2003 Carpenter等， 2002]、神經(jīng)元和神經(jīng)前體(Reubinoff 等，2000, Carpenter 等，2001，Schuldiner 等，2001)、 脂肪細(xì)胞(Bost等，2002，Aubert等，1999)、肝細(xì)胞樣細(xì)胞(Rambhatla等，2003)、造血細(xì)胞 (Chadwick等，2003)、卵母細(xì)胞(Hubner等，200 、胸腺細(xì)胞樣細(xì)胞(Lin RY等，2003)、胰島細(xì)胞(Kahan，2003)和造骨細(xì)胞(Zur Nieden 等，2003)。本發(fā)明的另一實施方案是鑒定來源于胚胎、胚胎干細(xì)胞系或其它胚胎細(xì)胞并通過比較體內(nèi)來源細(xì)胞和所述細(xì)胞的信使RNA轉(zhuǎn)錄物發(fā)現(xiàn)它具有分化成有用的細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞的方法，所述細(xì)胞諸如RPE細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮、祖細(xì)胞或細(xì)胞療法或研究中有用的其它細(xì)胞。此方法方便了正常表型細(xì)胞的鑒定，并可優(yōu)化細(xì)胞用于細(xì)胞療法和研究中。本發(fā)明為人ES細(xì)胞分化成神經(jīng)元系列中的特化細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素屏障上皮(RPE) 提供了準(zhǔn)備條件。RPE是脈絡(luò)膜和神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜之間的一層濃密有色上皮單層。它是血流和視網(wǎng)膜之間屏障的一部分，它的功能包括對脫落視桿和視錐外部區(qū)段的吞噬作用、雜散光的吸收、維生素A的代謝、視黃醛衍生物的再生和組織修復(fù)。(Grierson等，1994, Fisher 和Reh，2001，Marmorstein等，1998)。通過其黑色細(xì)胞且鵝卵石狀的細(xì)胞形態(tài)很容易識別 RPE0此外，有數(shù)種已知的RPE標(biāo)記物，包括細(xì)胞視黃醛結(jié)合蛋白(CRALBP)，一種同樣發(fā)現(xiàn)于頂突處的胞質(zhì)細(xì)胞(Bunt-Milam和&iari，1983) ；RPE65，視黃醛衍生物代謝中涉及的胞質(zhì)蛋白(Ma等，2001，Redmond等，1998)；促貝斯特素，貝斯特卵黃狀黃斑變性基因的產(chǎn)物 (VMD2, Marmorstein等，2000)和色素上皮衍生因子(PEDF)，具有制管張?zhí)匦缘?8kD分泌蛋白(Karakousis 等，2001，Jablonski 等，2000)。RPE的不尋常特性是其表觀可塑性。RPE細(xì)胞在有絲分裂期通常是靜止的，但受損傷或光凝固后可開始分裂。RPE細(xì)胞鄰近受損平面并增殖形成新的單層Ghao等，1997)。 幾種試驗已表明RPE單層可產(chǎn)生成纖維細(xì)胞外觀的細(xì)胞，它稍后能恢復(fù)成其最初的RPE形態(tài)(Grierson等，1994，Kirchhof等，1988，Lee等，2001)。目前仍不清楚分裂的細(xì)胞和有色上皮層是否來自同一世系，因為分離出了兩種RPE細(xì)胞群上皮狀的和紡錘狀的(McKay和 Burke, 1994) 0在體外，取決于生長因子的組合和基質(zhì)，RPE可作為上皮保持或快速去分化并變成增殖性的(Zhao 1997，Opas和Dziak，1994)。有趣的是，在長期的靜止培養(yǎng)中可重新出現(xiàn)上皮的表型(Griersion等，1994)。在哺乳動物發(fā)育中，RPE與神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜-眼泡神經(jīng)上皮具有相同的祖先。在某些情況下，有人提出RPE可反式分化成神經(jīng)元祖細(xì)胞(Opas和Dziak，1994)、神經(jīng)元 (Chen等，2003，Vinores等，1995)和晶狀體上皮(Eguchi，1986)?？纱碳PE變成神經(jīng)元的因子之一是bFGF(0paz和Dziak，1994，與眼睛發(fā)育通常所需的轉(zhuǎn)錄激活劑表達(dá)相關(guān)的過禾呈，包括 rx/rax、chxlO/vsx~2/alx> ots_l、otx_2、six3/optx, six6/optx2> mitf 禾口 pax6/ pax2 (Fischer和Reh，2001, Baumer等，200 。最近，研究顯示小雞視網(wǎng)膜邊緣包含神經(jīng)干細(xì)胞(Fischer和Reh，2000)且在該區(qū)域內(nèi)表達(dá)pax6/mitf的有色細(xì)胞能響應(yīng)FGF形成神經(jīng)細(xì)胞(Fisher 和 Reh, 2001)。本發(fā)明為從hES衍生小梁網(wǎng)細(xì)胞以及為遺傳修飾小梁網(wǎng)細(xì)胞用于青光眼治療提供了條件。本發(fā)明還為從RPE祖細(xì)胞和RPE樣細(xì)胞衍生出小梁網(wǎng)細(xì)胞以及為遺傳修飾小梁網(wǎng)細(xì)胞用于青光眼治療提供了條件。本發(fā)明包括不產(chǎn)生ES細(xì)胞系、直接從人和非人動物桑椹胚或胚泡期胚胎(EDCs) 產(chǎn)生RPE細(xì)胞和RPE前體細(xì)胞的方法，包括a)體外維持未分化狀態(tài)的ES細(xì)胞；b)使ES細(xì)胞分化成RPE和RPE前體細(xì)胞；并c)通過比較所述細(xì)胞和體內(nèi)來源細(xì)胞的信使RNA轉(zhuǎn)錄物鑒別RPE細(xì)胞。本發(fā)明另外提供了 RPE系或RPE細(xì)胞前體的衍生方法，所述RPE細(xì)胞具有增強的防止新血管形成的能力，所述方法包括a)使來自動物的體細(xì)胞老化，從而使端粒酶縮短，其中細(xì)胞正常復(fù)制壽命的10%被跨越；和b)使用所述體細(xì)胞作為核轉(zhuǎn)移供體細(xì)胞產(chǎn)生過表達(dá)血管發(fā)生抑制劑的細(xì)胞，其中的血管發(fā)生抑制劑可以是色素上皮衍生因子(PEDF/ EPC-1)。 本發(fā)明提供了用hES細(xì)胞來源RPE、RPE-樣和/或RPE祖細(xì)胞治療帕金森癥的方法。這些可通過立體定位性內(nèi)條紋植入或微載體遞送?；蛘?，它們可不使用微載體遞送。也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法擴大培養(yǎng)細(xì)胞并用于治療帕金森癥。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將由以下詳述體現(xiàn)。附圖描述圖IA-F是顯示自然分化hES細(xì)胞內(nèi)有色區(qū)外觀(RPE細(xì)胞的特征)的一組照片。 圖IA是在6孔板中黏附培養(yǎng)2. 5個月后有色區(qū)的照片；圖IB是在EB中培養(yǎng)2. 5個月后有色區(qū)的照片，放大倍數(shù)45x ；圖IC是黏附培養(yǎng)的有色區(qū)的照片；圖ID是EB培養(yǎng)的有色區(qū)的照片；圖IE是有色區(qū)和其它培養(yǎng)物之間邊界的照片，x200 ；圖F與圖E相同，除了放大倍數(shù)是x400之外。A和B中的箭頭指向有色區(qū)。圖2A-F是顯示培養(yǎng)過程中色素沉積和上皮形態(tài)喪失和恢復(fù)的一組照片。圖2A是顯示初級EB生長暈的照片，1周；圖2B是顯示用胰酶分離的原代培養(yǎng)細(xì)胞照片，1周；圖2C 是顯示被增殖細(xì)胞環(huán)繞的上皮島的照片；圖2D是顯示培養(yǎng)1個月后色素沉積和上皮形態(tài)恢復(fù)的照片；圖2E是顯示傳3代后培養(yǎng)物的照片，放大倍數(shù)為x200 ；圖2F顯示的培養(yǎng)物與E 相同，放大倍數(shù)為x400。Hoffinan顯微鏡。黑箭頭指向有色細(xì)胞，白箭頭顯示無色素的生長細(xì)胞。圖3左組圖(A-D)和右邊組圖是一組照片和一張曲線圖-顯示了 hES細(xì)胞來源有色上皮細(xì)胞中RPE的標(biāo)志。圖3A和;3B是顯示RPE標(biāo)志促貝斯特素免疫定位的照片和相應(yīng)的相位顯微鏡視野，放大倍數(shù)為x200 ；圖3C和3D是顯示CRALBP和相應(yīng)相差顯微鏡視野的照片，放大倍數(shù)為x400。箭頭顯示的是促貝斯特素(A)和CRALBP(C)對有色細(xì)胞的共定位 (C，D)；箭頭狀物指向無色區(qū)內(nèi)無這些蛋白質(zhì)(A，B)的著色(C，D)。圖3右組圖顯示用促貝斯特素(a)和CRALBP (b)抗體進(jìn)行的細(xì)胞裂解物(系hES#36)蛋白質(zhì)印跡分析的照片和圖表；c，d-未分化的hES細(xì)胞，C-抗CRALBP抗體的對照，d_抗促貝斯特素抗體的對照。圖 4顯示的照片證明了標(biāo)志物1^x6 (圖4A)、Pax2 (圖4E)和mitf (圖4B、圖4F)在長期靜止培養(yǎng)的RPE樣細(xì)胞中的表達(dá)。圖4C、圖4G-相差，圖4D、圖4H-Pax6/mitf/相差(圖4A、圖 4B、圖4C)和Pax2/mitf/相差(圖4E、圖4F、圖4G)的合并圖像。圖5A-B顯示了人胚胎來源細(xì)胞培養(yǎng)中RPE分化的照片繞過了 ES細(xì)胞系衍生階段。圖6顯示了 RPE制品的轉(zhuǎn)錄比較，圖6A-F-基于本體論的注釋，此表代表了 RPE 相關(guān)基因針對hES細(xì)胞來源視網(wǎng)膜色素上皮(hES-RPE)、hES細(xì)胞來源反式分化細(xì)胞 (hES-RPE-TD) ,ARPE-19和D407和新鮮分離的人RPE (fe-RPE)的表達(dá)。圖6G-顯示已知的 RPE特異性存在的更多資料，諸如黑色素的生物合成、視覺-視黃醇結(jié)合，只在胎兒RPE和 ES-RPE中有，但在ARPE-19中沒有。發(fā)明詳述本發(fā)明的多種實施方案詳述于此并可能通過所提供的實施例進(jìn)行了進(jìn)一步的說明。當(dāng)應(yīng)用于本說明書和以下全部權(quán)利要求中時，除非上下文明確指出，否則“一個”、“一種”和“這個”的意思包括多于一個的涵義。此外，當(dāng)用于本說明書中時，除非上下文中明確指出，否則“在里面(in)”的意思包括“在里面(in)”和“在上面(on)”。在本發(fā)明的上下文和使用各術(shù)語的特殊上下文中，用于此說明書的術(shù)語通常具有其在本領(lǐng)域內(nèi)的普通涵義。在下文或說明書的其它部分對某些用于描述本發(fā)明的術(shù)語進(jìn)行了說明，以便為實踐者在描述本發(fā)明的組合物和方法以及如何制備和使用它們時提供附加的指引。為了方便，可能利用例如斜體字和/或引用語標(biāo)志等使某些術(shù)語突出顯示。使用突出標(biāo)示對某一術(shù)語的范圍和意思沒有影響，在同一上下文中，無論它是否被突出標(biāo)示，某一術(shù)語的范圍和意思都是相同的?？梢岳斫鉃橥瑯拥氖虑榭梢砸砸环N以上的方式敘述。因此，對本文所論述的任一個或多個術(shù)語都可使用選擇性的語言和同義詞，無論該術(shù)語是否詳述或討論于此，對其都沒有任何特殊的意義。本文提供了某些術(shù)語的同義詞。描述一個或多個同義詞并不排斥使用其它的同義詞。在本說明書中任何部分所使用的實施例，包括本文所論述的任何術(shù)語的例子，都只具有說明的目的，決非限制了本發(fā)明的范圍和領(lǐng)域，不考慮任何具體的理論或功能設(shè)置，只要數(shù)據(jù)的加工、收集、轉(zhuǎn)換等是依照本發(fā)明進(jìn)行的就應(yīng)屬于本發(fā)明的范圍。定義“胚胎”或“胚胎的”意指還未植入母體子宮膜的正在發(fā)育的細(xì)胞團(tuán)?！芭咛ゼ?xì)胞” 分離自胚胎或包含于胚胎中的細(xì)胞。這也包括卵裂球，早到兩細(xì)胞階段獲得的卵裂球和聚集的卵裂球。術(shù)語“胚胎干細(xì)胞”指胚胎來源細(xì)胞。更具體而言是指分離自胚泡或桑椹胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)且已作為細(xì)胞系連續(xù)傳代的細(xì)胞。術(shù)語“人胚胎干細(xì)胞”(hES細(xì)胞)指人胚來源的細(xì)胞。更具體而言hES指分離自人胚泡或桑椹胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)并且已作為細(xì)胞系連續(xù)傳代的細(xì)胞，還可以包括卵裂球和聚集的卵裂球。術(shù)語“人胚胎來源細(xì)胞”(hEDC)指桑椹胚來源細(xì)胞、胚泡來源細(xì)胞，包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、 胚盾或上胚層的細(xì)胞，或者早期胚胎的其它全能或多能性干細(xì)胞，包括原始內(nèi)胚層、外胚層和中胚層以及它們的衍生物，還包括卵裂球和來自聚集的單個卵裂球的細(xì)胞塊或來自不同發(fā)育階段的胚胎，但不包括已作為細(xì)胞系傳代的人胚胎干細(xì)胞。具有分化成人體幾乎任何組織的能力的胚胎干(EQ細(xì)胞為移植療法提供了能再生且具組織相容性的細(xì)胞的無限來源，因為免疫排斥的問題可通過核轉(zhuǎn)移和孤雌生殖技術(shù)克服。Hirano等人Q003)最近的發(fā)現(xiàn)顯示小鼠ES細(xì)胞可在體外分化實驗中產(chǎn)生眼睛樣的結(jié)構(gòu)。其中對有色上皮細(xì)胞進(jìn)行了描述，類似視網(wǎng)膜色素上皮。在Advanced Cell Technology上用靈長類和人ES細(xì)胞系進(jìn)行的預(yù)備實驗顯示在專門的培養(yǎng)系統(tǒng)中這些細(xì)胞分化成可分離和傳代的RPE樣細(xì)胞。人和小鼠NT，Cyno parthenote ES細(xì)胞衍生物具有RPE的多種特性這些有色上皮細(xì)胞表達(dá)RPE的4種分子標(biāo)志-促貝斯特素、CRALBP, PEDF和RPE65 ；象RPE —樣，它們在培養(yǎng)中增殖的同時也伴隨著去分化，即色素和上皮形態(tài)的丟失，在細(xì)胞形成單層并靜止后這兩種特征都恢復(fù)了。所述 RPE樣細(xì)胞很容易傳代、凍結(jié)和融化，因此允許它們的擴充。本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)一步證明了人ES細(xì)胞在體外分化實驗中也產(chǎn)生多種眼睛(玻璃體)樣結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)的組織學(xué)分析顯示細(xì)胞的模式與早期視網(wǎng)膜發(fā)育一致，包括類似于視桿和視錐的細(xì)胞聚集體。RPE 移植目前，對RPE同種異體移植物的長期緩慢的排斥反應(yīng)阻礙了科學(xué)家確定該RPE移植的療效。有數(shù)種方法被考慮用于克服此障礙。最簡單的方法是采用全身性的免疫抑制， 這伴隨著諸如癌癥和感染等嚴(yán)重的副作用。第二條途徑是移植患者自身的RPE，即自體移植物，但這種方法的缺點在于是用舊的、不健康的RPE去置換更不健康的RPE。還有第三條途徑是利用來自同一患者的虹膜上皮(IPE)，但該方法的缺點在于IPE可能完成不了 RPE的所有視覺相關(guān)功能。最終需要發(fā)現(xiàn)一種能消除排斥反應(yīng)且研究者因此能確定在AMD和ARMD 中RPE移植的真正療效的方法。核轉(zhuǎn)移和孤雌生殖提高了被移植RPE細(xì)胞和祖細(xì)胞的組織相容性。色素性視網(wǎng)膜炎中的RPE缺陷色素性視網(wǎng)膜炎是一類遺傳病，其中視覺感受器由于異常的遺傳程序而逐漸被破壞。某些形式引起患者在相對年輕的時候就全部失明，而其它形式則顯示出對視覺有少許損傷的特征性“骨針”視網(wǎng)膜變化。在全世界范圍內(nèi)該疾病患者大約有一百五十萬人。在專門表達(dá)于RPE的基因中發(fā)現(xiàn)了引起常染色體隱性RP的兩個基因缺陷。一個是由維生素 A代謝中所涉及的RPE蛋白質(zhì)(順式視黃醛結(jié)合蛋白)造成的，第二個涉及RPE獨特的另一種蛋白質(zhì)RPE65。一旦排斥反應(yīng)被克服，這兩種形式的RP都應(yīng)能直接通過RPE移植進(jìn)行治療。這種治療在幾年前是難以想象的，那時候RP是一種沒有希望治愈且了解甚少的失明癥。有關(guān)RPE移植的新研究顯示有希望對視網(wǎng)膜病變進(jìn)行治療，包括黃斑變性在內(nèi)。 而且，許多晚期RP患者在進(jìn)行胎兒視網(wǎng)膜細(xì)胞移植后重新獲得了一定程度的有效視力。例如，一名患者從幾乎看不見光改善到能數(shù)出放在離其臉部約6英尺距離處的手指。在第二個病例中，患者視力提高到能通過管狀視野看見字母。在這些研究中移植是通過注射進(jìn)行的，在現(xiàn)存的神經(jīng)中樞視網(wǎng)膜下引入了新的視網(wǎng)膜細(xì)胞。盡管確定存活的細(xì)胞與其它神經(jīng)元形成連接并在它們周圍開始發(fā)揮類似光感受器的功能，但是因為所移植的胎兒細(xì)胞是異源的(即，非遺傳匹配的)，所以不是所有的細(xì)胞都能存活的。前8名患者接受移植后大約一年，其中4名患者恢復(fù)了一定程度的視覺功能，而第五名患者表現(xiàn)出正在恢復(fù)的跡象。三種新來源的人胚胎干細(xì)胞系在特性上與早先所述的相似(Thomson等1998， Reibunoff 等，2000，Richards 等，2000，Lanzendorf 等，2001)它們在傳了 45 代或超過 130x2個種群后仍保持未分化的表型并表達(dá)未分化hES細(xì)胞的已知標(biāo)志Oct-4、堿性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在EB或長期黏附培養(yǎng)基中以及在畸胎瘤內(nèi)所有的hES細(xì)胞系都分化成三個胚芽層的衍生物。以以下標(biāo)準(zhǔn)判斷，其中一個hES細(xì)胞分化衍生物與視網(wǎng)膜色素上皮相似從形態(tài)學(xué)上看，它們具有典型的上皮鵝卵石單層外觀并且在其胞質(zhì)部分包含黑褐色的色素，這已知在人體內(nèi)只存在于黑素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、視網(wǎng)膜和虹膜色素上皮(IPE)中。不過，黑素細(xì)胞是非上皮細(xì)胞，而角質(zhì)形成細(xì)胞不分泌而只是積聚黑色素。這些細(xì)胞中存在一批RPE特異蛋白質(zhì)一促貝斯特素、CRALBP、PEDF，表明它們可能與RPE而非IPE相似。另一相似處是被分離所色素細(xì)胞在培養(yǎng)中的行為，在正在增殖的細(xì)胞中觀察到很少或沒有色素，但在緊密堆積的上皮島中則保留了色素，或者在細(xì)胞靜止后新建立的鵝卵石單層中重新表達(dá)了色素。這樣的現(xiàn)象在有關(guān)RPE細(xì)胞培養(yǎng)的文獻(xiàn)中也有描述(aiao等綜述，1997)，且原先已報道過(Vinores等，19%)神經(jīng)元標(biāo)志物微管蛋白 β III在體外特異定位于正在分化的RPE細(xì)胞中，而不是具有典型RPE形態(tài)的細(xì)胞中，這反映了 RPE的可塑性和其去分化成神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞系的能力。本發(fā)明的發(fā)明者觀察到微管蛋白 β III以相同模式定位于原代和傳代培養(yǎng)的RPE和RPE樣細(xì)胞中，這反映了所述細(xì)胞在培養(yǎng)中的去分化作用或表明分開的細(xì)胞群最終分化成神經(jīng)元，在長期培養(yǎng)的hES細(xì)胞整個分化過程中，它們最初的定位鄰近有色細(xì)胞并可以與RPE樣細(xì)胞一起被共同分離。在正在生長的眼泡內(nèi)，RPE和神經(jīng)視網(wǎng)膜共有同一種雙潛能神經(jīng)上皮祖細(xì)胞，且它們的命運據(jù)顯示是由Pax2、1^x6和Mitf決定的(Baumer等，2003)，后者是前兩者的靶目標(biāo)。1^x6在早期用作原神經(jīng)基因的激活劑，而進(jìn)一步發(fā)育后在RPE中有所下調(diào)，在成熟視網(wǎng)膜的無長突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)保持一定的水平(Ashery-Padan和Gruss綜述，2001)。在金魚中，也發(fā)現(xiàn)了在有絲分裂期間活躍的再生神經(jīng)元的祖細(xì)胞(Hitchcock等，1996)。本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)許多RPE樣細(xì)胞以類似于微管蛋白β III的模式表達(dá)mitf和1^x6，并且只發(fā)現(xiàn)于長期培養(yǎng)的有色上皮島周圍的非上皮形態(tài)的非有色細(xì)胞中或具“部分” RPE表型的細(xì)胞中(輕微著色和松散堆積)。在新傳代的增殖細(xì)胞中，幾乎每個細(xì)胞中都能發(fā)現(xiàn)所有這些標(biāo)志物，顯示出或者RPE樣細(xì)胞在增殖開始時向祖細(xì)胞階段逆轉(zhuǎn)，或者視網(wǎng)膜祖細(xì)胞大量增殖。有趣的是，在同樣發(fā)現(xiàn)了上皮形態(tài)有色細(xì)胞島的畸胎瘤中，1^x6表達(dá)于鄰近有色區(qū)的無色細(xì)胞中(資料未顯示)。先前的多種研究已顯示了 RPE在培養(yǎng)中的去分化及其它們的反分化成以下類型細(xì)胞神經(jīng)元表型細(xì)胞(Reh和Gretton，1987，Skaguchi等，1997， Vinores等，1995，Chen等，200 、神經(jīng)元、無長突細(xì)胞和光感受器細(xì)胞(Zhao等，1995)、 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(Skaguchi等，1997)、神經(jīng)視網(wǎng)膜(felly等，2002)和神經(jīng)祖細(xì)胞(Opaz和 Dziak, 1993)。所述的祖細(xì)胞可輪流與RPE樣細(xì)胞共存于培養(yǎng)物中或作為RPE樣細(xì)胞去分化的結(jié)果出現(xiàn)。同時，神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞在體外可反分化成RPE (Opas等，2001)，因此選擇性的，微管蛋白β III和1^x6陽性細(xì)胞可代表共分離的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞反分化成RPE 樣細(xì)胞的瞬時階段。使用以下實施例所述方法可使hES細(xì)胞自發(fā)分化成RPE樣細(xì)胞，且本發(fā)明的發(fā)明者注意到有色上皮細(xì)胞確實出現(xiàn)于6-8周以上的培養(yǎng)物中，且它們的數(shù)量隨時間增加-在 3-5個月內(nèi)幾乎每個EB都有一個大的有色區(qū)。除了所述的hES細(xì)胞系之外，還有6個更新的衍生hES細(xì)胞系轉(zhuǎn)變成PRE樣細(xì)胞，這表明由于ES細(xì)胞通常自發(fā)選擇神經(jīng)系統(tǒng)的方向， 通過將默認(rèn)設(shè)置為所述途徑的高級階段可產(chǎn)生RPE樣細(xì)胞。還可能在所述的長期培養(yǎng)中， 正在分化的hES細(xì)胞形成了一個多層的外環(huán)境，被許可的/或有益的分化信號來自細(xì)胞外基質(zhì)和hES細(xì)胞分化衍生物所產(chǎn)生的生長因子。HES細(xì)胞分化成RPE樣細(xì)胞的模型可作為有效的工具用于研究所述的微環(huán)境如何協(xié)調(diào)RPE分化和反分化。RPE在光感受器的維護(hù)中起重要的作用，而體內(nèi)的各種RPE障礙與許多視覺改變的疾病有關(guān)，諸如RPE脫離、營養(yǎng)不良、萎縮、視網(wǎng)膜病變、色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑萎縮或變性，包括年齡相關(guān)的黃斑變性，它可導(dǎo)致光感受器受損和失明。由于它所具有的傷口愈合能力，RPE被廣泛研究應(yīng)用于移植療法中。研究表明在多種動物模型和人中(Gouras等，2002，Stanga等，2002，Binder等， 2002，khraermeyer等，2001，Lund等綜述，2001)，RPE移植具有良好的視覺修復(fù)潛能。最近另一有關(guān)RPE移植的預(yù)期生態(tài)位被提出并甚至達(dá)到了臨床試驗階段因為這些細(xì)胞分泌多巴胺，它們可用于治療帕金森癥(SubramaniandOOl)。不過，即使在免疫特許的眼睛內(nèi)， 如果使用異源移植物，也存在移植的排斥反應(yīng)的問題，從而阻礙了此方法的進(jìn)步。另一問題是對胎兒組織的依賴性問題，因為成年RPE的增殖潛能非常低。作為免疫相容性組織的來源，hES細(xì)胞被期望用于移植療法中，因為免疫排斥的問題可用核轉(zhuǎn)移即使克服。人ES細(xì)胞新分化衍生物-視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞以及所述分化體系的可靠性和簡單性可能為移植提供了有吸引力的RPE細(xì)胞潛在來源。
實施例實施例1在長期培養(yǎng)中自發(fā)分化成有色上皮細(xì)胞在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的條件下當(dāng)hES細(xì)胞在MEF中培養(yǎng)過滿時，它們形成了厚的多層細(xì)胞。約6周后，在較大的細(xì)胞叢中出現(xiàn)了黑色的細(xì)胞島(

圖1)。這些黑色細(xì)胞可以用裸眼很容易觀察到并且在圖IA所示的細(xì)胞板中看起來象“雀斑”。在較高的放大倍數(shù)上，這些細(xì)胞島看上去象典型的上皮細(xì)胞鵝卵石單層中緊密堆積的多邊形細(xì)胞，在胞質(zhì)中有褐色的色素(圖1C)。細(xì)胞內(nèi)的色素量有差異，島中心部位具有最多的色素，而靠近邊緣的最少(圖1E、F)。在前6-8周，當(dāng)hES細(xì)胞形成胚狀體(EB)時，有色上皮細(xì)胞出現(xiàn)于大約的 EB中(圖1B)。隨時間推移，越來越多的EB發(fā)育成有色細(xì)胞，到3個月的時候幾乎每個EB 都有有色上皮區(qū)(圖ID)。EB有色區(qū)內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)類似于黏附培養(yǎng)的細(xì)胞(圖1D)。實施例2有色上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)本發(fā)明的發(fā)明者從黏附的hES細(xì)胞培養(yǎng)物和EB 二者中分離有色上皮細(xì)胞。用酶 (胰酶和/或膠原酶和/或ordispase)消化有色的多邊形細(xì)胞，用玻璃毛細(xì)管選擇性的從這些有色島中挑選細(xì)胞。盡管小心的只挑選有色細(xì)胞，但分離的細(xì)胞群總是包含某些非有色細(xì)胞。將細(xì)胞在明膠或?qū)诱尺B蛋白上鋪1-2天后，這些細(xì)胞被認(rèn)為是原代培養(yǎng)細(xì)胞(PO)。原代培養(yǎng)物包含有色多邊形細(xì)胞島以及某些單個的有色細(xì)胞。培養(yǎng)3-4天后，看上去已失去了上皮細(xì)胞的形態(tài)(變得更平且細(xì)胞具有扁平狀偽足)的無色細(xì)胞出現(xiàn)在某些細(xì)胞島的外周(圖2)。所述外周細(xì)胞數(shù)目隨時間推移而增加，表明這些細(xì)胞正在增殖，2周后，新形成的單層細(xì)胞中大部分細(xì)胞不含或含很少的色素。繼續(xù)培養(yǎng)2-3周后，有色上皮細(xì)胞開始重新出現(xiàn)，與最初的培養(yǎng)物沒有明顯的區(qū)別(圖2)。實施例3RPE標(biāo)志物的檢測將這些分化的人細(xì)胞初步定性為RPE是基于它們與先前所描述的RPE培養(yǎng)物的相似性，主要是，它們的上皮形態(tài)和含有色素。人體中有三種有色上皮細(xì)胞視網(wǎng)膜和虹膜有色上皮和角質(zhì)形成細(xì)胞，但后者不分泌色素。上皮結(jié)構(gòu)和鵝卵石的形態(tài)也不是其它有色細(xì)胞所共有的，例如黑素細(xì)胞。還值得注意的是RPE細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表現(xiàn)為丟失而后重新獲得它們的色素和上皮形態(tài)(Zhao 1997，Opas和Dziak，1994)，而且有色細(xì)胞也有相似方式的表現(xiàn)，由此檢驗
13ES衍生細(xì)胞可能是RPE的假設(shè)，它們可以用針對已知RPE標(biāo)志物促貝斯特素和CRALBP的抗體進(jìn)行染色。圖4(左邊組圖)顯示了促貝斯特素(A)和CRALBP(C)的膜定位，在有色上皮島中都能找到。不是所有的細(xì)胞都被這些抗體染色，而且染色的強度與色素表達(dá)和群落“緊密度”相關(guān)-在細(xì)胞更大且更松散堆積的各有色島的邊界處兩種蛋白質(zhì)都顯示出較低的表達(dá)。為了進(jìn)一步表征可能的RPE細(xì)胞，用蛋白質(zhì)印跡法分析了促貝斯特素、CRALBP的表達(dá)。圖4(右側(cè)組圖)顯示了細(xì)胞裂解物中相應(yīng)于促貝斯特素，68kD(a)、CRALBP，36kD(b) 的條帶。所有這些蛋白質(zhì)均在兩種原代培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)并隨后被傳代。用實時RT-PCR在RPE樣細(xì)胞中找到了另一已知的PRE標(biāo)志物，RPE65(圖4，右側(cè)組圖，底部)，PEDF ELISA檢測顯示了 PEDF存在于所有假定RPE培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物中，而蛋白質(zhì)印跡分析顯示了一條大約48kD的條帶(未顯示)。RPE樣培養(yǎng)物中神經(jīng)元和視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)志物的檢測圖4顯示了 PAX-6、Pax2、mitf和微管蛋白β III在新傳代和舊培養(yǎng)的hES細(xì)胞衍生RPE中的定位。在增殖培養(yǎng)物中(胰酶消化3天后，未顯示)，增殖細(xì)胞喪失了 RPE樣形態(tài)，幾乎每個細(xì)胞都顯示出存在mitf、Pax6、微管蛋白β III和nestin (未顯示)。Pax2 只在一小類呈現(xiàn)mitf陰性的細(xì)胞中找到，而存在很大程度的I^X6/mitf、mitf/微管蛋白 β III和1^x6/微管蛋白β III共定位。在舊的培養(yǎng)物靜止培養(yǎng)21天，有色上皮島復(fù)原后， ΡΑΧ-6和mitf大部分發(fā)現(xiàn)于有色上皮島之間的非上皮形態(tài)的無色細(xì)胞中(圖4，A-C)，而微管蛋白β III則具有相似模式的分布(未顯示)。不過，存在mitf陽性和1^x6陰性細(xì)胞群，定位接近有色島的外周(圖4，A-C)。1^x2只在很少的mitf陰性細(xì)胞中找到(圖4， E-H)。在“成熟”的有色上皮島細(xì)胞中曾發(fā)現(xiàn)檢測不到這些蛋白質(zhì)中任何一種的存在。不過，在只具有某些RPE特征的細(xì)胞內(nèi)的這些標(biāo)記物通常是明顯的，S卩，或者看上去象上皮但無色素，或者在某些遠(yuǎn)離有色上皮島的單個有色細(xì)胞中。實施例4來自hES細(xì)胞系H9的RPE樣細(xì)胞和來自Cyno-1 ES細(xì)胞的ACT J-I和來自現(xiàn)存 hES細(xì)胞系Hl和H7的RPE樣細(xì)胞衍生物的表征擴充培養(yǎng)RPE樣細(xì)胞系，并為了凍存和復(fù)蘇進(jìn)行檢測，用以下方法和RPE細(xì)胞的分子標(biāo)記物進(jìn)行定性用蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光檢測促貝斯特素和CRALBP，用ELISA和蛋白質(zhì)印跡法檢測PEDF，以及用RT-PCR檢測REP65。將細(xì)胞注入SCID小鼠，以未分化的hES 或Cyno-I細(xì)胞作為對照評估腫瘤發(fā)生率。在商用臨床實驗室中研究角化類型的RPE樣細(xì)胞。然后如本申請書中另外描述的進(jìn)行RPE樣細(xì)胞功能特性的定性和它們移植潛能的研究，同時使用了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些技術(shù)。用Affymetrix人類基因組芯片完成了基因表達(dá)圖譜的檢測。比較了來自ES細(xì)胞的RPE樣細(xì)胞和來自尸檢的視網(wǎng)膜樣品中基因的表達(dá)情況。用數(shù)種動物模型驗證移植RPE 樣細(xì)胞的有效性，包括但不局限于，恒河猴、大鼠和兔子。實施例5保證RPE樣細(xì)胞的高產(chǎn)量的分化培養(yǎng)體系的優(yōu)化ES細(xì)胞培養(yǎng)于營養(yǎng)細(xì)胞層上或作為胚狀體(EB)在bFGF、胰島素、TGF-β、ΙΒΜΧ、 bmp-2、bmp-4或它們的組合物存在的條件下培養(yǎng)，包括逐步添加營養(yǎng)成分?；蛘?，將ES細(xì)胞培養(yǎng)于多種胞外基質(zhì)包被的平板上(層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白I、膠原蛋白IV、 Matrigel等)，用來評估ECM在RPE形成中的作用。在不同的時間間隔利用實時RT-PCR檢測早期RPE祖細(xì)胞的分子標(biāo)志物(Ρ&χ6、Ι^χ2、πιΗ ·)和RPE細(xì)胞的分子標(biāo)志物(CRALBP、促貝斯特素、PEDF、REP6Q的表達(dá)，以證實和確定上文所提及試劑的成功組合和在RPE樣細(xì)胞或其祖細(xì)胞中產(chǎn)生富集的逐步過程。此方法還可用于產(chǎn)生RPE和其它眼睛組織共同的祖細(xì)胞，諸如光感受器和神經(jīng)視網(wǎng)膜，它們由于其分化潛能而被分離和進(jìn)一步定性并用于移植試驗中。實施例6來自現(xiàn)存的和新的ES細(xì)胞系的RPE和其它眼睛組織祖細(xì)胞的衍生物利用基因表達(dá)圖譜的數(shù)據(jù)，將RPE祖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)與表面蛋白的表達(dá)聯(lián)系起來，以發(fā)現(xiàn)針對RPE祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物的獨特組合。如果發(fā)現(xiàn)了這樣的標(biāo)志物，可用抗表面蛋白質(zhì)的抗體分離純的RPE祖細(xì)胞群，然后進(jìn)行培養(yǎng)并進(jìn)一步在培養(yǎng)中分化，或者用于移植試驗中使其在移植后再分化。如果來自基因表達(dá)圖譜的資料不夠充分，為了分離RPE祖細(xì)胞，可以使用以下方法。在以1^x6啟動子作為對照的條件下用GFP轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞和RPE樣細(xì)胞，挑選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。從被轉(zhuǎn)染的分化ES細(xì)胞或增殖(去分化)RPE細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過FACS分離GFP/ Pax6陽性細(xì)胞并用作抗原注射小鼠以產(chǎn)生針對1^x6陽性細(xì)胞表面分子的單克隆抗體。因為1^x6只存在于RPE祖細(xì)胞中，用幾種策略可完成篩選(通過FACS) :a)抗正在增殖的RPE 樣細(xì)胞，b)抗1^x2陽性RPE細(xì)胞，c)抗mitf陽性RPE細(xì)胞。對于b)和c)而言，將在相應(yīng)啟動子控制下用GFP轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞；使用無這些抗原的RPE或ES細(xì)胞作為陰性對照。擴充培養(yǎng)經(jīng)上述所有三種策略選定的陽性克隆后，檢測抗體對篩選中所用的所有類型細(xì)胞的反應(yīng)并進(jìn)行進(jìn)一步分析因為此方法可產(chǎn)生識別特異和非特異于RPE祖細(xì)胞細(xì)胞表面抗原的抗體，就可檢測來自正在分化的ES細(xì)胞群總體的細(xì)胞或用這些抗體選定的RPE細(xì)胞的RPE 祖細(xì)胞分子標(biāo)志物和它們產(chǎn)生RPE的能力。利用優(yōu)化的確定的階梯式步驟產(chǎn)生RPE或其它眼組織早期祖細(xì)胞以及它們獨特表面標(biāo)志物的抗體，可從已分化的ES細(xì)胞中分離所述祖細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)。用目標(biāo)2中所述策略研究它們分化成各種眼睛組織的能力。已產(chǎn)生RPE樣細(xì)胞的三個ES細(xì)胞系(H9、ACT J-I、Cyno-1)、RPE-樣細(xì)胞將被用于繼續(xù)產(chǎn)生如目標(biāo)1和目標(biāo)2中所述的RPE樣細(xì)胞和它們的祖細(xì)胞，而HI和H7 hES細(xì)胞系將被用于產(chǎn)生新的RPE樣細(xì)胞系。在擴充培養(yǎng)并對RPE的分子標(biāo)志物進(jìn)行定性后，將這些細(xì)胞系進(jìn)行單一的克隆，對所產(chǎn)生的系列如目標(biāo)1所述進(jìn)行鑒定。符合RPE細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞系將用于移植試驗。新的人ES細(xì)胞系將來自未用過的IVF胚胎，來自捐贈者的卵母細(xì)胞，受刺激后不受精即發(fā)育(孤雌)，應(yīng)用核轉(zhuǎn)移技術(shù)從所產(chǎn)生的獲自捐贈卵母細(xì)胞并正在發(fā)育的胚泡中產(chǎn)生新的人ES細(xì)胞系。RPE樣細(xì)胞和常見的眼睛祖細(xì)胞將用目標(biāo)2中的方法獲自這些細(xì)胞系，依照目標(biāo)1鑒定所產(chǎn)生的細(xì)胞系。[任選的]從無病毒體系中產(chǎn)生新的人 ES細(xì)胞系、鑒定并提交臨床試驗。實施例7在各種動物模型中RPE樣細(xì)胞和祖細(xì)胞對色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性的治療潛能
在cynomologus猴(短尾猿)中檢測靈長類ES細(xì)胞。開始，進(jìn)行玻璃體切除術(shù)并將細(xì)胞移植入動物的視網(wǎng)膜下空間處。第一步移植懸浮液形式的細(xì)胞，然后移植基底或基質(zhì)形式的細(xì)胞，以產(chǎn)生單層移植。這也可利用衍生自人ES細(xì)胞的細(xì)胞在免疫抑制的患色素性視網(wǎng)膜炎的兔子或多種其它動物模型中完成，包括嚙齒動物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、 桶狀小鼠、RCS大鼠、貓(阿比西尼亞貓)和狗(視錐病變"cd〃狗、進(jìn)行性視桿-視錐病變〃 prcd"狗、早期視網(wǎng)膜病變〃 erd"狗、1、2和3型視桿-視錐發(fā)育異?！?rcdl、rcd2 和rcd3〃狗、光感受器發(fā)育異?！?pd〃狗和Briard“RPE-65”狗)。用熒光血管造影術(shù)、組織學(xué)方法(是否存在光感受器恢復(fù))和可能的ERG進(jìn)行檢查。也可進(jìn)行功能檢查，包括吞噬作用(光感受器片段)、維生素A代謝、緊密連接的傳導(dǎo)性和電子顯微鏡。實施例8來自人的胚胎來源細(xì)胞的RPE細(xì)胞的直接分化在使用或不使用免疫外科手術(shù)去除滋養(yǎng)外胚層的條件下將人胚泡期胚胎放在小鼠或小雞的胚胎成纖維細(xì)胞上或者直接放在胞外基質(zhì)蛋白包被的組織培養(yǎng)器皿中。細(xì)胞直接分化，而不是培養(yǎng)和傳代產(chǎn)生人ES細(xì)胞系。在缺乏LIF、FGF和Plasmanate的條件下當(dāng)hES細(xì)胞在MEF中培養(yǎng)過滿時，它們形成了厚的多層細(xì)胞。(或者如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的可以用生長因子、培養(yǎng)基和FBS改變直接分化。)約6周后，在較大的細(xì)胞叢中出現(xiàn)了黑色的細(xì)胞島。這些黑色細(xì)胞可以用裸眼很容易觀察到并且在圖5B所示的細(xì)胞板中看起來象“雀斑”。在較高的放大倍數(shù)上，這些細(xì)胞島看上去象典型的上皮細(xì)胞鵝卵石單層中緊密堆積的多邊形細(xì)胞，在胞質(zhì)中有褐色的色素(圖5A)。細(xì)胞內(nèi)的色素量有差異，島中心部位具有最多的色素，而靠近邊緣的最少(圖 5B)。盡管通常不會，但當(dāng)hES細(xì)胞直接分化時它們可能形成胚狀體(EB)。在前6-8周， 有色上皮細(xì)胞出現(xiàn)于大約1-2%的這些分化細(xì)胞和/或EB中。隨時間推移，越來越多的EB 發(fā)育成有色細(xì)胞，到3個月的時候幾乎每個EB都有有色上皮區(qū)。EB有色區(qū)內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)非常類似于黏附培養(yǎng)的細(xì)胞。材料和方法MEF 培養(yǎng)基高葡萄糖 DMEM，補充了 2mM GlutaMAXI 和 500u/ml 青霉素、500ug/ml 鏈霉素(均來自Invitrogen)和16% FCS(HyCLone)。HES細(xì)胞生長培養(yǎng)基基因敲除用高糖DMEM，補充了 500u/ml青霉素、500ug/ml鏈霉素、1 %非基本氨基酸溶液、2mM GlutaMAXI, 0. ImM β- 乙酉享、4ng/ml bFGF (Invitrogen) U-ng/ml ^A LIF (Chemicon, Temecula, CA)、8. 4% 的置換血清(SR，Invitrogen)和 8. 4 % Plasmanate (Bayer)。衍生培養(yǎng)基包含與生長培養(yǎng)基同樣的組分，不同之處在于與生長培養(yǎng)基相比，它具有較低濃度的SR和 Plasmanate (各4. 2% )以及8. 4% FCS和2倍濃度的人LIF和bFGF。EB培養(yǎng)基除了 bFGF、 LIF和Plasmanate之外與生長培養(yǎng)基相同；SR濃度是13%。RPE培養(yǎng)基50% EB培養(yǎng)基和 50% MEF培養(yǎng)基。HES細(xì)胞系用于這些試驗的細(xì)胞系hES 35、36、45是改進(jìn)先前所報道方法的方法產(chǎn)生的 (Thomson 等，1998，Reubinoff 等，2000，Lanzendorf 等，2001)。經(jīng)兩個制度審查委員會的批準(zhǔn)，人凍存的胚泡(系列hES35)或裂開的胚胎(系列hES36和hES45)由已完成生育力
16治療的夫婦捐贈用于研究。用黏附的hES細(xì)胞或胚狀體(EBs)進(jìn)行分化實驗。對于黏附分化而言，hES細(xì)胞可以在MEF中長滿，直至hES細(xì)胞失去它們的緊密邊緣，此時用EB培養(yǎng)基置換原培養(yǎng)基(通常是在傳代8-10天后)。每1-2天換一次培養(yǎng)基。為了 EB形成，將hES細(xì)胞用胰酶消化并在低黏附平板 (Costar)上培養(yǎng)于EB培養(yǎng)基中。免疫染代將細(xì)胞固定于2%多聚甲醛，用0. NP-40使其可滲透以便胞內(nèi)抗原的定位， 用 PBS(Invitrogen)配制的 10% 山羊血清、10% 的驢血清(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)封閉至少1小時。在4°C與一抗保溫過夜，加入二抗 (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) 一小時。在所有保溫操作之間用PBS配制的0. 1 % Tween-20 (Sigma)洗滌樣品3-5次，每次10-15分鐘。用帶DAPI 的 Vectashield(Vector Laboratories, Burlingame, CA)為樣品著色并在熒光顯微鏡下 (Nikon) ML。石JM1生MSIBI白勺t^lgiffi Vector Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA)定位于活細(xì)胞或是依照制造商的說明在免疫染色期間的第二次洗滌后進(jìn)行定位。所用的抗體促貝斯特素(Novus Biologicals, Littleton, CO)、抗 CRALBP 抗體由 Dr. Saari, University of Washington 惠贈。二抗來自 Jackson Immunoresearch Laboratories,而鏈霉親和素-FITC購自Amersham。RPE樣細(xì)胞的分離和傳代用PBS漂洗黏附培養(yǎng)的hES細(xì)胞或EB兩次并在0. 25 %胰酶/ImM EDTA(Invitrogen)中37°C保溫直至細(xì)胞單層松散。用玻璃毛細(xì)管將有色區(qū)的細(xì)胞刮下， 轉(zhuǎn)移到MEF培養(yǎng)基中，200xg離心，并放到明膠包裹平板內(nèi)的RPE培養(yǎng)基中。細(xì)胞附著后更換培養(yǎng)基(通常在1-2天內(nèi))，之后每5-7天換一次；每2-4周用0. 05%胰酶/0. 53mM EDTA(Invitrogen)將細(xì)胞傳代。蛋白質(zhì)印跡分析和ELISA用Laemmli緩沖液(Laemmli，1970)制備樣品，緩沖液中補充有5%的巰基乙醇和混合蛋白酶抑制劑(Roche)，煮沸5分鐘并用Mini-Protean裝置加到8-16%梯度凝膠 (Bio-Rad, Hercules, CA)上；每塊膠在25_30mA進(jìn)行電泳；以20伏電壓過夜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 0. 2 的硝酸纖維素膜 Gchleicher and Shul 1，Keene，NH)上。用 Ponceau Red(Sigma)對印跡膜進(jìn)行暫時染色使條帶可見，用Mi 11 i-Q水進(jìn)行洗滌，并用溶于0. 1 % TBST (Bio-Rad) 的5%脫脂奶粉封閉1小時。加入抗促貝斯特素、CRALBP或PEDF(Chemicon)的一抗2小時，然后用TBST洗3次，每次15分鐘；加入過氧化物酶綴合的二抗1小時，并重復(fù)上述洗滌。用Super-Signal試劑(Pierce)通過ECL體系檢測印跡。依照制造商的說明用PEDF ELISA試劑盒(Chemicon)對細(xì)胞裂解物進(jìn)行PEDF ELISA分析。實時RT-PCR通過兩步法從分化的ES培養(yǎng)物中提純總RNA。用Trizol試劑(Invitrogen)分離天然RNA并進(jìn)一步用foieazy小柱^jiagen)進(jìn)行純化。用商品化的用于RPE65檢測的引物對(Assay on Demand &num ；Hs00165642ml, Applied Biosystems)禾口 Quantitect Probe RT-PCR試劑(Qiagen)，依照制造商的^jiagen)說明通過實時PCR監(jiān)測RPE65轉(zhuǎn)錄物的水平。未分化hES細(xì)胞系的衍牛和表征這些試驗中用了兩個雌性、一個雄性hES細(xì)胞系。有關(guān)這些hES細(xì)胞系衍生的細(xì)節(jié)在別處也有報導(dǎo)。所有細(xì)胞系已傳代超過50次，在此期間它們保持未分化的集落形態(tài)、高堿性磷酸酶活性且表達(dá)0ct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60和TRA 1-81 (數(shù)據(jù)未顯示)。其中兩個細(xì)胞系具有標(biāo)準(zhǔn)的核型(hES36，hES35)，而在hES45中即有標(biāo)準(zhǔn)的也有非整倍體的亞群。由于在體外以及在畸胎瘤中的自發(fā)分化，所有細(xì)胞系均表達(dá)三胚芽層的標(biāo)志-肌肉肌動蛋白、α-胎蛋白和微管蛋白β III。實施例9利用轉(zhuǎn)錄基因組鑒定離體分化的正常分化細(xì)胞Transcriptomics-hES-細(xì)胞衍生物可能在未來的再生醫(yī)學(xué)中扮演著重要的角色。 這些衍生物和其它干細(xì)胞衍生物的定性檢測仍然是一個挑戰(zhàn)，可以用功能性基因組的方式進(jìn)行處理。我們比較了 hES-RPE相對于體內(nèi)同等物-胎兒RPE細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜，研究者已對它的移植價值進(jìn)行了廣泛的研究。然后將兩個圖譜都與先前所報導(dǎo)的(Rogojina等，2003) 有關(guān)人RPE細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄物組的資料進(jìn)行比較。將我們數(shù)據(jù)組中的基因表達(dá)圖譜與兩種人RPE細(xì)胞系(未轉(zhuǎn)化的ARPE-19和已轉(zhuǎn)化的D407，Rogojina等，200 進(jìn)行比較以確定hES-RPE是否具有相似的普遍轉(zhuǎn)錄特征。為了說明表達(dá)于所有細(xì)胞中的共同的持家基因，我們使用了來自未分化hES細(xì)胞(Hl 系列，hi-hES, —sato等，2003)和支氣管上皮細(xì)胞(BE, Wright等，2004)、公認(rèn)可利用的 Affymetrix數(shù)據(jù)組作為對照，因為它們具有共同的上皮來源，從而可以排除共同的持家基因和上皮基因并確定RPE特異性基因。在hES-RPE、hES_RPE_TD、ARPE-19, D407之間存在相似性和差異性。通過分析存在于hES-RPE/ARPE-19但不存在于BE(10 個基因)中的那些基因之間唯一的交叉點進(jìn)一步證實了它們的相似性。為了說明背景，我們將這與存在于BE/hES-RPE但不存在于 ARPE-19(186個基因)中的唯一交叉點進(jìn)行了比較，這樣產(chǎn)生的hES-RPE和ARPE-19中的相似性比用BE進(jìn)行比較所產(chǎn)生的要高5倍到6倍。D407/ARPE19看上去丟失了 RPE特異性基因，諸如RPE65、促貝斯特素、CRALBP、PEDF，它是典型的長期傳代細(xì)胞(圖6)。進(jìn)一步的資料庫顯示已知的RPE特異存在處，諸如黑色素生物合成、視覺、維生素A結(jié)合等，只存在于胎兒RPE和ES-RPE中，但不存在于ARPE19中。將hES-RPE、ARPE-19和D407與它們的體內(nèi)同等物-新鮮分離的人胎兒 RPE (feRPE)進(jìn)行比較，結(jié)果與我們早先的資料一致，證明了 hES-RPE與人feRPE之間的轉(zhuǎn)錄同一性顯著高于D407與fe RPE之間(2. 3倍差異-849個基因/373個基因)和ARPE-19 與feRPE之間(1. 6倍差異-588個基因/364個基因)的同一性(圖5c/5d)。以上鑒定的只存在于hES-RPE中而不存在于ARPE-19或D407中的RPE特異性標(biāo)志也存在于feRPE中， 表明hES-RPE與其體內(nèi)同等物之間的相似程度比培養(yǎng)的RPE細(xì)胞系之間的相似程度要高。hES-RPE中的784個基因在feRPE和ARPE-19數(shù)據(jù)組中沒有。由于保持“滋生”基因可能在移植入患者體內(nèi)時潛在的引起hES衍生物轉(zhuǎn)化成惡性的畸胎瘤，所以我們利用目前可利用的Affymetrix點陣數(shù)據(jù)組(Abeyta等2004 Sato 2003)建立了保守的潛在“滋生”基因數(shù)據(jù)。這產(chǎn)生了出現(xiàn)于所有12個數(shù)據(jù)組中的3806個基因的列表(包括共同的持家基因)。存在于hES-RPE數(shù)據(jù)組但不存在于feRPE-ARPE-19中的784個基因中只有36個是與3806個潛在滋生基因是相同的。這些基因中沒有一個是諸如0ct4、Sox2、TDGFl等已知的滋生性基因。實施例10利用RPE細(xì)胞治療帕金森癥因為hRPE分泌L-D0PA，所以它們可作為備選細(xì)胞來源用于帕金森癥細(xì)胞療法中。 研究顯示所述的附著于明膠包被微載體上的細(xì)胞可成功的被移植入一側(cè)患帕金森癥的猴子中并產(chǎn)生并顯著改善癥狀(每個靶目標(biāo)移植1萬至5萬個細(xì)胞)，而在FDA核準(zhǔn)的試驗中，開始在接受hRPE條紋內(nèi)移植的2000名患者中均未觀察到有不利的效果。使用hES細(xì)胞來源RPE的許多優(yōu)勢之一是它避開了捐贈的眼組織不足的問題。同時還促進(jìn)了基因療法的應(yīng)用。其它實施方案從前文的敘述中，顯而易見可對本文所述的本發(fā)明進(jìn)行變更和修飾以使其適應(yīng)不同的用途和條件。
權(quán)利要求
1.用于治療或預(yù)防視網(wǎng)膜變性的方法，包括使用選自下組細(xì)胞中的至少一種RPE細(xì)胞、RPE樣細(xì)胞、由哺乳動物胚胎干細(xì)胞衍生的RPE或RPE樣祖細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中視網(wǎng)膜變性狀況選自下組中的至少一種色素性視網(wǎng)膜炎和黃斑變性。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括通過玻璃體切割術(shù)將細(xì)胞移植到眼球的視網(wǎng)膜下空間中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中細(xì)胞在懸浮液、基質(zhì)、或基底中進(jìn)行移植。
5.權(quán)利要求2的方法，其中色素性視網(wǎng)膜炎與動物模型有關(guān)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中動物模型選自下組rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、矮胖樣小鼠、RCS大鼠、阿比西尼亞貓、視錐變性“Cd”犬、進(jìn)行性視桿-視錐變性“prcd”犬、早期視網(wǎng)膜變性“erd”犬、視桿-視錐發(fā)育異常1、2和3 "rcdl, rcd2和rcd3”犬、光受體發(fā)育異常 “Pd” 犬、和 Briard “RPE-65” 犬。
7.權(quán)利要求6的方法，其中使用行為測試、熒光血管造影術(shù)、組織學(xué)、和功能測試諸如測量細(xì)胞進(jìn)行吞噬(光受體片段)的能力、維生素A代謝、緊密接頭傳導(dǎo)性、或使用電子顯微鏡的評估其中一項或多項來評估動物模型的治療效果。
8.用于使hES細(xì)胞自發(fā)分化成RPE細(xì)胞、RPE樣細(xì)胞、或RPE祖細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使hES細(xì)胞培養(yǎng)物在MEF上過度生長；b)使hES細(xì)胞培養(yǎng)物形成厚厚的多層細(xì)胞；c)培養(yǎng)hES細(xì)胞；d)由得到的細(xì)胞培養(yǎng)物分離并培養(yǎng)有色RPE細(xì)胞、REP樣細(xì)胞、和/或RPE祖細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中分離并培養(yǎng)RPE樣細(xì)胞包括a)用酶消化培養(yǎng)的hES細(xì)胞或EB's；b)選擇性分離有色細(xì)胞；c)將分離的細(xì)胞平板接種在明膠或?qū)诱尺B蛋白上培養(yǎng)1-2天以形成原代培養(yǎng)物 (PO)；d)將原代培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)至多達(dá)3周的一段時間；和e)分離RPE樣細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中酶選自下組中的一種或多種胰蛋白酶、膠原酶、和分散酶。
11.權(quán)利要求8的方法，其中培養(yǎng)RPE細(xì)胞以建立新的RPE細(xì)胞系。
12.權(quán)利要求11的方法，其中RPE細(xì)胞系分化成交替譜系，包括在培養(yǎng)中用bFGF或FGF 處理RPE細(xì)胞系。
13.權(quán)利要求11的方法，其中在RPE樣細(xì)胞衍生自不同ES細(xì)胞系時，新的RPE細(xì)胞系因至少一種選自下組的特征與早已建立的RPE細(xì)胞系不同生長速率、色素表達(dá)、在培養(yǎng)中去分化、和在培養(yǎng)中再分化。
14.用于使RPE系或RPE細(xì)胞前體衍生成具有增加的預(yù)防新血管生成能力的RPE細(xì)胞的方法，所述方法包括a)使來自動物的體細(xì)胞老化，使得端粒酶縮短，其中細(xì)胞已經(jīng)度過了至少10%的正常復(fù)制壽命；和b)使用體細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞以生成過度表達(dá)血管發(fā)生抑制物的細(xì)胞，其中血管發(fā)生抑制物可以是色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中用抑制新血管生成的外源基因遺傳修飾體細(xì)胞。
16.權(quán)利要求8的方法，其中RPE樣細(xì)胞衍生自HLA區(qū)純合性ES或胚胎衍生細(xì)胞庫使得ES衍生細(xì)胞具有降低的HLA抗原復(fù)雜性。
17.權(quán)利要求8的方法，其中ES細(xì)胞衍生自人。
18.用于治療帕金森氏病的方法，包括移植RPE樣細(xì)胞或祖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于視網(wǎng)膜變性的改良的基于細(xì)胞的療法和用于使人胚胎干細(xì)胞和人胚胎衍生細(xì)胞分化成視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的方法。
文檔編號A61K48/00GK102204930SQ20111013230
公開日2011年10月5日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月23日
發(fā)明者I·V·克利曼斯卡亞 申請人:先進(jìn)細(xì)胞技術(shù)公司