一種誘導多能干細胞的培養(yǎng)基及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)誘導多能干細胞的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中含有人參皂苷單體Rb1、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd。本發(fā)明還提供一種誘導多能干細胞的方法，所述方法包括以下步驟：1)將多能性相關基因?qū)牍w細胞；2)將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單細胞懸液，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞；3)鑒定誘導多能干細胞克隆。鑒于目前ips應用于臨床的瓶頸，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了人參皂苷單體Rb1、人參皂苷單體Rb3、人參皂苷單體Rd能顯著提高ips誘導效率，并可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的增殖，將對整個干細胞研究及新藥研發(fā)領域產(chǎn)生深遠影響。
【專利說明】一種誘導多能干細胞的培養(yǎng)基及其用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及人參皂苷的用途，具體涉及含有人參皂苷單體的 多能干細胞培養(yǎng)基在提高細胞重編程效率、延緩細胞衰老、促進細胞增殖方面的用途。 技術背景
[0002] 中草藥為藥物提供廣闊的來源，在傳統(tǒng)醫(yī)學中起重要作用。一些中藥對腦部發(fā)育、 免疫性等有顯著療效，但具體的分子機制還不清楚，包括比如作用靶標、信號通路等。中國 傳統(tǒng)醫(yī)學中，中藥人參能增強記憶力，明目定神。分析發(fā)現(xiàn)人參含有特定活性物質(zhì)-人參 皂苷（gins en〇Side，GS)。人參皂苷具有類似基本化學結構，大致可分類為達瑪烷型和齊墩 果烷型。由于對單體進行生物活性研究，易于闡明其確切的藥理作用，發(fā)現(xiàn)活性較強的化 合物，隨著現(xiàn)代分離和分析技術的進步，人參化學成分得到了進一步的闡明，人參皂苷是人 參主要的生物活性物質(zhì)，現(xiàn)已確證人參皂苷單體約40種；根據(jù)人參皂苷的皂甙元，可以將 他們分為兩組：人參二醇（例如Rgl，Rbl，Re，Rf，RC，RB2, Rb3等）和原人參三醇型（例如 RS3，RK1，RG5，RS4，RS5等）。其中，Rd、Rgl已用于研究神經(jīng)細胞增殖的。但是人參皂苷在 正常細胞中尤其是在干細胞中固定功能和作用機制并不清楚。
[0003] 其中，現(xiàn)有技術表明，人參皂苷Rbl在西洋參（花旗參）中含量最多，可影響動物 睪丸的潛力，小鼠的胚胎發(fā)育等。協(xié)調(diào)膽堿系統(tǒng)的功能，增加乙酰膽堿合成、釋放，改善記憶 力。人參皂苷Rb3可增強心肌功能，保護人體自身免疫系統(tǒng)?？梢杂糜诟鞣N不同原因引起 的心肌收縮性衰竭的治療。人參皂苷Rd可減少乙酰膽堿誘發(fā)的豚鼠離體子宮收縮。對大 鼠有減慢心率和雙相性血壓（先升后降）作用?？梢种曝埖男袨楹湍X電圖。此外有抗疲勞 作用。
[0004] 2006年，Yamanaka等人建立了一種新的重編程技術，建立了誘導多能性干細胞 (induced pluripotent stem cell，iPS cell)系。2007 年，Yamanaka 和 Thomson 研究組 分別建立了人的iPS細胞系。這一重大科學進展使體細胞重編程研究具體到了基因?qū)用妫?為研究和應用提供寶貴的細胞資源。由于iPS細胞來自于體細胞而非胚胎，可避免倫理爭 議，具有廣闊的應用前景。
[0005] 細胞重編程是組織修復、器官重建和個體化的再生醫(yī)療的基石。如果能掌握細胞 重編程技術，將為組織器官重建等重大科學問題掃除屏障。利用自身體細胞重編程為iPS 細胞，通過體內(nèi)外誘導技術獲得目標組織和器官，既解決了免疫排斥問題，也解決供型不足 的問題，將會成為人類醫(yī)療歷史上重要里程碑。細胞重編程建立疾病模型ips細胞系可作 為疾病機制機理的研究材料，為采取相應的治療手段提供最可靠的醫(yī)學依據(jù)。腫瘤、糖尿病 和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疑難疾病的發(fā)生、發(fā)展受表觀遺傳修飾調(diào)控，相對應的，細胞重編程對基 因定向編輯的研究將對這些疑難疾病的預防、治療提供新的思路。
[0006] 在開展人類ESC、iPSC治療疾病進程中，需要解決很多科學問題。比如高效獲得 非病毒非整合完全重編程iPSC，高效誘導iPSC分化為目的細胞、高效去除未分化的殘留細 胞，快速準確的將多能性干細胞進行胚胎干細胞與iPSC的多能性研究，確認分化獲得的目 的細胞功能、表觀遺傳修飾等與體內(nèi)細胞完全一致性，大規(guī)模培養(yǎng)非動物源性（xeno-free) 干細胞及分化細胞等問題。目前在某些領域取得一些進展，比如Warren等通過mRNA誘導 iPSC，能高效獲得非病毒非整合iPSC。但要將iPSC應用于臨床治療，還有很長一段路需要 摸索。早期iPSC誘導效率僅為0. 01-0. 5%，與體細胞核移植為技術基礎重編程效率存在很 大差距，因此，如何提高iPSC誘導效率是iPSC研究領域的熱點研究內(nèi)容之一。篩選新供體 細胞、添加活性小分子誘導是有效提高iPSC重編程效率方法之一，特別是候選小分子能大 幅度提高ips誘導效率，現(xiàn)在急需解決的問題是臨床前安全性確認。
[0007] 因此，篩選安全有效的重編程活性小分子具有重要實用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 如本文中所使用地，術語"iPS"與"誘導多功能干細胞"可互換地使用，二者具有 相同的含義。
[0009] 本發(fā)明涉及的人參皂苷單體為人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3、人參皂苷單 體Rd。
[0010] 本發(fā)明的一個目的在于，提供一種誘導多能干細胞培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有Rbl、 人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd，并提供了所述培養(yǎng)基在制備誘導多能干細胞中 的用途。
[0011] 本發(fā)明的又一個目的在于，提供人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參 皂苷單體Rd在制備用于防治衰老的藥物組合物或者在制備用于延緩衰老的保健品或生活 產(chǎn)品中的用途。
[0012] 本發(fā)明的目的還在于，提供人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在制備用于 促進細胞增殖的組合物中的用途。
[0013] 本發(fā)明的目的還在于提供采用人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd促進細 胞增殖的方法。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的。
[0015] 在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)誘導多能干細胞的培養(yǎng)基，其特征 在于，所述培養(yǎng)基由常規(guī)誘導多能干細胞培養(yǎng)基以及人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3 和/或人參皂苷單體Rd組成。
[0016] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基為含有人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷 單體Rd的K0SR培養(yǎng)基。
[0017] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基中人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體 Rd的工作濃度為1-100 μ M，優(yōu)選地，濃度為5-100 μ M，進一步優(yōu)選地，濃度為25-100 μ M，更 優(yōu)選地，濃度為50-75 μ Μ。優(yōu)選地，在制備所述培養(yǎng)基時，將所述人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd溶解于微量的DMS0中，然后添加到培養(yǎng)基中。
[0018] 在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供一種誘導多能干細胞的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0019] 1)將多能性相關基因?qū)牍w細胞；
[0020] 2)將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單細胞懸液，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基 培養(yǎng)步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞，得到誘導多能干細胞
[0021] 優(yōu)選地，所述方法還包括鑒定誘導多能干細胞的步驟。
[0022] 優(yōu)選地，所述步驟1)中通過包括以下步驟的方法實現(xiàn)的：
[0023] a.將供體細胞接種到含有SP (青鏈霉素雙抗溶液）的10 % DMEM培養(yǎng)液中；優(yōu)選 地，所述細胞的接種密度為1. 5-2*104/cm2 ;
[0024] b. -天后，將所述含有SP的10% DMEM培養(yǎng)液換成不含SP的10% DMEM，并使用 含有多能性相關基因的病毒感染供體細胞；
[0025] 優(yōu)選地，所述多能性相關基因為Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ;
[0026] 優(yōu)選地，在感染的同時，加入8 μ g/ml聚凝胺；
[0027] c.誘導24小時后，棄去含有病毒的培養(yǎng)液，換上含有SP的10% DMEM，隔天再換液 一次；
[0028] d.感染后第六天得到感染好的供體細胞。
[0029] 優(yōu)選地，所述步驟2)中通過包括以下步驟的方法實現(xiàn)的：
[0030] I )將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單細胞懸液，并接種到飼養(yǎng)層細 胞上；
[0031] 優(yōu)選地，使用胰酶將供體細胞消化成單細胞，優(yōu)選地，所述胰酶的濃度為 0.25g/100mL ；
[0032] 優(yōu)選地，供體細胞與飼養(yǎng)層細胞的數(shù)量比優(yōu)選為1 :6-1 :9,更優(yōu)選為1 :8 ;
[0033] 優(yōu)選地，所述飼養(yǎng)層細胞為經(jīng)絲裂霉素 C處理過的無分化能力的小鼠成纖維細 胞；
[0034] II )將步驟1)中接種好的細胞使用10% DMEM的培養(yǎng)液培養(yǎng)1-2天；
[0035] III)棄去10% DMEM的培養(yǎng)液，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；
[0036] IV )每隔一天更換一次培養(yǎng)基；
[0037] V )培養(yǎng)3-4天后，得到誘導多能干細胞；
[0038] 在本發(fā)明的再一個方面，本發(fā)明提供了人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/ 或人參皂苷單體Rd在制備用于防治衰老的藥物組合物或者在制備用于延緩衰老的保健品 或生活產(chǎn)品中的用途。
[0039] 在本發(fā)明的再另一個方面，本發(fā)明提供了人參皂苷單體Rb 1、人參皂苷單體Rb3和 /或人參皂苷單體Rd在制備用于促進細胞增殖的藥物中的用途。
[0040] 本發(fā)明具有以下的意義：
[0041] 鑒于目前ips應用于臨床的瓶頸，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體 Rb3、人參皂苷單體Rd能顯著提高ips誘導效率，并可以顯著延緩細胞的衰老和促進細胞的 增殖，由于包括人參皂苷在內(nèi)的中草藥提取物通過臨床實踐證明安全性較高。因此，本申請 的發(fā)現(xiàn)可以加速其在臨床上的應用并開發(fā)出基于干細胞調(diào)控的藥物，將對整個干細胞研究 及新藥研發(fā)領域產(chǎn)生深遠影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0043] 圖1顯示了在ips誘導過程中，加入不同人參皂苷單體處理后的克隆數(shù)統(tǒng)計結果。 結果表明相對于對照組（DMS0組），經(jīng)Rd、Rbl、Rb3處理后的iPSC克隆數(shù)顯著增多，提示 Rd、Rbl、Rb3對ips誘導有顯著的促進作用，柱狀圖是一個統(tǒng)計的結果。
[0044] 圖2是流式細胞儀分析的結果，對誘導第10天的MEF細胞進行0CT4-GFP陽性細 胞數(shù)的統(tǒng)計，結果表明經(jīng)人參皂苷單體Rd，Rb3處理過的實驗組中GFP陽性細胞數(shù)目遠遠多 于對照組（DMS0組），其中Vc是作為陽性對照組，Vc在促進細胞重編程中的作用已經(jīng)被報 道過。
[0045] 圖3顯示的是MEF細胞的細胞周期分析，Hoechst核定位，EdUS對S期細胞進行 標記染色，PHH3對Μ期細胞進行標記染色，對不同細胞周期包括M，S和細胞總數(shù)進行了標 記，以驗證藥物對細胞的增殖影響，結果表明人參皂苷單體（Rbl，Rb3, Rd)可以部分提高細 胞增殖。
[0046] 圖4顯示的是MEF細胞中Μ期細胞所占的比例，經(jīng)人參皂苷單體處理后的MEF細 胞處于Μ期的細胞比例高于對照組。
[0047] 圖5顯示的是MEF細胞的狀態(tài)，傳到第7代時狀態(tài)變得不好，有很多細胞開始凋 亡，如對照中所示。在培養(yǎng)過程中加入了人參皂苷單體的MEF卻能保持很好的生長狀態(tài)。
[0048] 圖6為不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的MEF細胞中衰老基因的表達情況，在加入人參皂苷培養(yǎng) 液中生長的MEF細胞表達衰老基因明顯低于對照組。當細胞傳代至第七代時，正常培養(yǎng)液 中的細胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，而在加入人參皂苷單體的培養(yǎng)液中生長的MEF細胞狀態(tài)良 好，極少出現(xiàn)凋亡
[0049] 圖7為衰老基因（P21、btg2、gadd45b)的表達水平比較，在加入人參皂苷培養(yǎng)液中 生長的MEF細胞表達衰老基因明顯低于對照組（DMS0)，圖中將對照組的基因表達水平設置 為1，人參皂苷培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細胞的衰老基因表達水平明顯低于對照組。

【具體實施方式】
[0050] 豐要材料和試劑
[0051] 低溫保存箱購自中國，海爾；制冰機購自中國，唯利安；液氮罐購自中國，東亞；四 度離心機購自美國，Beckman ;生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱和Nanodrop購自美國，Thermo ; 體式顯微鏡、石錯切片機購自德國，Leica;細胞計數(shù)儀、純水儀、病毒超濾離心管（Amicon ultra-15 centrifugal filter unit)購自美國，Millipore;電子天平購自德國，賽多利斯； 移液槍、多聚酶鏈式反應（PCR)儀購自德國，Eppendorf ;激光共聚焦顯微鏡購自德國，Carl Zeiss ;實時熒光定量PCR儀購自美國，Talent ;滅菌鍋購自日本，Sanyo ;正置顯微鏡購自日 本，Olympus ;
[0052] 電泳儀套裝，GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)購自美國，BI0-RAD ;圓形玻片（Coverslip) 購自美國Bellco Glass。除非特別指明，本文中的試劑來源如下：0pti-MEM培養(yǎng)液， Invitrogen 公司；Knock0ut?DMEM 培養(yǎng)液，Invitrogen 公司；KnockOut? 血清（K0SR), Invitrogen 公司；胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS), Invitrogen 公司；0.05 % 及 0.25%胰蛋白酶，Invitrogen公司；100X鏈霉素-青霉素（S-P), Invitrogen公司；二甲基 亞砜（DMS0)，Invitrogen公司；人參皂苷單體（Rd，Rbl，Rb3)，上海智化醫(yī)藥科技有限公司； ΙΟΟχ 非必需氨基酸（Non essential amino acids，NEAA)，Invitrogen 公司；100 X 谷氨醜 胺，Invitrogen 公司；N_2 supplement, Invitrogen 公司；B_27Supplements, Invitrogen 公司；i3-mercaptoethanol(i3-疏基乙醇，100M)，Invitrogen 公司；lOOx 鏈霉素 / 青霉 素（Streptomycin/Penicillin, SP), Invitrogen 公司；TrypLE?, Invitrogen 公司；明膠， Sigma 公司；絲裂霉素 C，Sigma;SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-，Real_Time 試劑盒，日本 Τ0Υ0Β0 公司；TRIzol，Invitrogen 公司；pMX_0ct4，pMX_Sox2，pMX-c-Myc 和 pMX-Klf4質(zhì)粒，Addgene公司；RNA Reverse試劑盒，Invitrogen公司；AP試劑盒，碧云天； 感受態(tài)DH5a菌株，TransGen公司；Triton X-100,北京索萊寶科技有限公司；多聚甲醛 (PFA), Sigma ；Hoechst 33342, Invitrogen。
[0053] 除非特別指明，本文中所用到的細胞，購自中國科學院動物研究所。
[0054] 除非特別指明，以下實施例中所用的試劑均為分析純級試劑，且可從正規(guī)渠道商 購獲得。
[0055] 實施例1培養(yǎng)某的制各
[0056] K0SR培養(yǎng)基為一種用于培養(yǎng)干細胞的常規(guī)培養(yǎng)基，本實施例中的K0SR培養(yǎng)基購 自Invitrogen公司。配方如表1所示
[0057] 表1 K0SR培養(yǎng)基的配方
[0058]

【權利要求】
1. 一種用于培養(yǎng)誘導多能干細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基由常規(guī)誘導多能 干細胞培養(yǎng)基以及人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd組成。
2. 根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基為含有人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd的KOSR培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的培養(yǎng)基，其中，所述培養(yǎng)基中人參皂苷單體Rbl、人參皂 苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd的濃度為1-100 μ M，優(yōu)選地，濃度為5-100 μ M，進一步 優(yōu)選地，濃度為25-100 μ Μ，更優(yōu)選為50-75 μ Μ。
4. 一種制備如權利要求1-3中任一項所述的培養(yǎng)基的方法，包括將人參阜苷單體Rbl、 人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd溶解于微量的DMSO中得到溶液，然后將上述溶液 加入到常規(guī)培養(yǎng)基中，使所述培養(yǎng)基中人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂 苷單體Rd的濃度為1-100 μ M，優(yōu)選地，濃度為5-100 μ M，進一步優(yōu)選地，濃度為25-100 μ M， 更優(yōu)選為50-75 μ Μ。
5. -種誘導多能干細胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 將多能性相關基因?qū)牍w細胞； 2) 將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單細胞懸液，使用權利要求1-3中任一 項所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟1)中導入多能性相關基因的供體細胞，得到誘導多能干細胞； 優(yōu)選地，所述方法還包括鑒定誘導多能干細胞的步驟。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟1)是通過包括以下步驟的方法 實現(xiàn)的： a. 將供體細胞接種到含有SP的10% DMEM培養(yǎng)液中； 優(yōu)選地，所述細胞的接種密度為1. 5-2*104/cm2 ; b. -天后，將所述含有SP的10% DMEM培養(yǎng)液換成不含SP的10% DMEM，并使用含有 多能性相關基因的病毒感染供體細胞； 優(yōu)選地，所述多能性相關基因為Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ; 優(yōu)選地，在感染的同時，加入8 μ g/ml聚凝胺； c. 誘導24小時后，棄去含有病毒的培養(yǎng)液，換上含有SP的10% DMEM，隔天再換液一 次； d. 感染后第六天得到感染好的供體細胞。
7. 根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述步驟2)是通過包括以下步驟的 方法實現(xiàn)的： I )將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單細胞懸液，并接種到飼養(yǎng)層細胞 上； 優(yōu)選地，使用胰酶將供體細胞消化成單細胞，優(yōu)選地，所述胰酶的濃度為 0.25g/100mL ； 優(yōu)選地，供體細胞與飼養(yǎng)層細胞的數(shù)量比優(yōu)選為1 :6-1 :9,更優(yōu)選為1 :8 ; 優(yōu)選地，所述飼養(yǎng)層細胞為經(jīng)絲裂霉素 C處理過的無分化能力的小鼠成纖維細胞； II )將步驟1)中接種好的細胞使用10% DMEM的培養(yǎng)液培養(yǎng)1-2天； III)棄去10% DMEM的培養(yǎng)液，使用如權利要求1-3中任一項所述培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞； IV )每隔一天更換一次培養(yǎng)基； V )培養(yǎng)3-4天后，得到誘導多能性干細胞克隆。
8. 人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在制備用于防治衰老 的藥物組合物或者在制備用于延緩衰老的保健品或生活產(chǎn)品中的用途。
9. 人參皂苷單體Rbl、人參皂苷單體Rb3和/或人參皂苷單體Rd在制備用于促進細胞 增殖的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P39/06GK104195103SQ201410394740
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權日:2014年8月12日
【發(fā)明者】周琪, 王秀杰, 顧奇, 郝捷, 韓偉方, 劉鑫, 王磊, 王柳 申請人:中國科學院動物研究所, 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所