一種用于培養(yǎng)人脂肪干細胞的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種人脂肪干細胞的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離 得到的一種具有多向分化潛能的干細胞，具有可迅速擴增、不易衰老等一般干細胞的特點。 人脂肪干細胞即人體脂肪間充質(zhì)干細胞是目前廣泛應用于組織工程及再生醫(yī)學領(lǐng)域的一 種成體干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細胞樣生長，胞 漿和核仁豐富，呈平行或縱滿樣排列。細胞周期分析顯示G0/G1期的細胞占69%，S期占24%， G2/M期占8%。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2-3天細胞增殖1倍。多次傳代（10-20代） 后，細胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細胞群體中出現(xiàn)衰老細胞，第15代細胞群體中 衰老細胞約占15%。
[0003] 由于人脂肪間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)周期較長，原代細胞鋪滿的時間約2周W上，達 到一定的數(shù)量需要3周左右。人脂肪間充質(zhì)干細胞體外長期培養(yǎng)傳代容易發(fā)生自發(fā)分化，失 去其多向分化的潛能。所W為保證實驗的連續(xù)性，必須隨時提供大量的實驗或組織工程用 的種子細胞。因此，對于細胞培養(yǎng)基的需求非常強烈。
[0004] 目前常用的ADSCs培養(yǎng)是利用飼養(yǎng)層細胞與采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行培 養(yǎng)。運種培養(yǎng)干細胞方法的缺點是方法復雜，提取的干細胞數(shù)量少，純度不高，繼代增殖緩 慢，更要緊的是使用飼養(yǎng)層細胞和動物血清容易導致干細胞污染，特別是動物血清內(nèi)潛在 動物源性內(nèi)毒素或病毒將對人體健康構(gòu)成極大地風險，運樣培養(yǎng)出的干細胞不適于直接應 用于臨床。因此，開發(fā)一種合適的有效的培養(yǎng)基變得迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種人脂肪干細胞培養(yǎng)基，克服使用血清制備細胞培養(yǎng)基的 缺點和風險。大規(guī)模生產(chǎn)中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構(gòu)成動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)成 本的主要部分之一。
[0006] 本發(fā)明提供一種特別適合于人脂肪干細胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由如下組分組成： DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、還原型谷脫甘膚、亞油酸、青霉素，鏈霉素，1^-谷 氨酷胺，堿性成纖維細胞生長因子，維生素 C和植物提取多膚組成。
[0007] 其中，各組分的具體用量分別為青霉素 lOOIU/ml，鏈霉素10化g/ml，レ谷氨酷胺 2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml，維生素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13yg/mL， 轉(zhuǎn)鐵蛋白化g/mL、還原型谷脫甘膚濃度為lOyg/mL、亞油酸濃度為扣g/mL，植物提取多膚30μ g/mlo
[000引本發(fā)明另外提供一種培養(yǎng)人脂肪干細胞的方法，包括將人脂肪干細胞加入到所述 的人脂肪干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的步驟。
[0009]本發(fā)明另外提供一種獲得植物多膚，該多膚從天然植物川西喜冬草中提取，川西 喜冬草常綠小草本狀半灌木，其葉片稍肥厚有光澤，申請人推測其就有較強的耐逆和抗旱 抗氧化的功效。申請人通過分離該植物葉片通過制備蛋白庫功能分析發(fā)現(xiàn)，該植物提取的 多膚具有穩(wěn)定人脂肪干細胞，促進干細胞生長，保持干細胞正常生長狀態(tài)的功效。
[0010] 本發(fā)明另外提供一種獲得植物多膚的方法，（1)將川西喜冬草葉片清洗干凈，絞 碎，棒汁，加入木瓜蛋白酶和膜蛋白酶，加酶量15000IU/g葉片，酶解溫度45° C，pH值7.0，酶 解時間化，酶解完成后92°C滅酶13min ; (2)滅酶后的物料過濾除去不溶物，得到溶液，所得 多膚溶液加入4%活性炭吸附脫色，用葡聚糖G-50(Sephadex G-50)進行多膚分離，20mmol/L 肥1溶液洗脫，流速1.3mL/分鐘，分別收集不同時間段的洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液至抑7.0，10000 轉(zhuǎn)/分鐘離屯、15分鐘，經(jīng)大孔樹脂DA201-C脫鹽處理后，真空濃縮，上清液冷凍干燥備用；經(jīng) 十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的條帶，其中經(jīng)過功能驗 證，共得到27個小膚的序列具有促進細胞生長的功能。根據(jù)色譜柱中不同的峰值分離時間， 可W批量獲得相應的小膚，也可人工合成所述的多膚。所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1-27 所示。分別命名為CXXDC-^27。
[0011] 該培養(yǎng)基提供結(jié)合蛋白、多膚類物質(zhì)、維生素參與細胞代謝，可W起到供應營養(yǎng)、 中和、解毒的效果。該培養(yǎng)基不含動物血清，不含動物血清內(nèi)潛在動物源性內(nèi)毒素或病毒， 方便應用于臨床。
【具體實施方式】
[0012] 下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實驗所用器具儀器試劑 皆可通過商業(yè)途徑獲得。
[0013] 實施例1:不加多膚的培養(yǎng)基配制 1)制備預定量lOOOmL，取900mL高糖型DMEM細胞培養(yǎng)液（廠家：Sigma)，加入青霉素 lOOIU/ml，鏈霉素10化g/ml，レ谷氨酷胺2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml，維生 素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白6yg/mL、還原型谷脫甘膚lOyg/mL、亞油酸 5μ邑/mL。
[0014] 2)調(diào)抑值:用5% NaHCOS調(diào)節(jié)抑至Ij 7.0,用DMEM細胞培養(yǎng)液定容到lOOOml。 [001引 3)過濾除菌：采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um，W 保證過濾效果。
[0016] 實施例2多膚的提取 將川西喜冬草葉片清洗干凈，絞碎，棒汁，加入木瓜蛋白酶和膜蛋白酶，加酶量 15000IU/g葉片，酶解溫度45° C，pH值7.0，酶解時間化，酶解完成后92° C滅酶13min ;滅酶后 的物料過濾除去不溶物，得到溶液，所得多膚溶液加入4%活性炭吸附脫色，用葡聚糖G-50 (Sephadex G-50)進行多膚分離，20mmol/L肥1溶液洗脫，流速1.3mL/分鐘，分別收集不同 時間段的洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液至pH7.0，10000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、15分鐘，經(jīng)大孔樹脂DA201-C脫鹽 處理后，真空濃縮，上清液冷凍干燥備用；經(jīng)十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS- PAGE)，回收小分子量的條帶，其中經(jīng)過功能驗證，共得到27個小膚的序列具有穩(wěn)定人脂肪 干細胞，促進干細胞生長，保持干細胞正常生長狀態(tài)的功效。根據(jù)色譜柱中不同的峰值分離 時間，可W批量獲得相應的小膚，也可人工合成所述的多膚。所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1-27所示。分別命名為CXXDC-^27。
[0017]實施例3含有多膚的培養(yǎng)基的配制 1)制備預定量lOOOmL，取900mL高糖型DMEM細胞培養(yǎng)液（廠家：Sigma)，加入青霉素 lOOIU/ml，鏈霉素10化g/ml，レ谷氨酷胺2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml，維生 素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白6yg/mL、還原型谷脫甘膚lOyg/mL、亞油酸 5yg/mL，CXXDC-1 多膚 30μg/ml。
[001引 2)調(diào)抑值:用5% NaHC03調(diào)節(jié)pH至1] 7.0,用DMEM細胞培養(yǎng)液定容到1000ml。
[0019] 3)過濾除菌：采用0.45um和0.22um濾膜各一張，上層為0.45um，下層為0.22um。審。 備得到的培養(yǎng)基為CXXDC-1培養(yǎng)基。
[0020] 按照上述相同的方法，分別制備CXXDC-2~27的培養(yǎng)基。
[0021] 實施例4本發(fā)明培養(yǎng)基與常規(guī)有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)與效果的比較 將1 X 106個的脂肪干細胞分別接種到30組盛有不同的培養(yǎng)基的直徑100mm培養(yǎng)皿中， 每組10個培養(yǎng)皿，混勻；其中第一組-第27組分別有10個培養(yǎng)皿，加入CXXDC-2~27的培養(yǎng)基 5mL ; 第28組10個培養(yǎng)皿，加入培養(yǎng)基mTeSRU購買自杭州百通生物技術(shù)有限公司，貨號 05850)5址； 第29組10個培養(yǎng)皿，加入高糖型DMEM細胞培養(yǎng)液5mL ; 第30組10個培養(yǎng)皿，加入CN 102732477 B專利文獻中的脂肪干細胞培養(yǎng)基5血。
[0022] 將細胞放在在37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng);置于倒置式顯微鏡觀察，每隔3 天用移液管吸去上層培養(yǎng)基，加入新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0023] 細胞計數(shù):每天在各組中取一個培養(yǎng)皿放入潔凈工作臺，然后用移液管吸棄培養(yǎng) 基。PBS洗涂2次，加入1ml 0.25%時ypsin-EDTA，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)貼壁細胞分離后，加入 4ml含有10%FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止膜酶作用。臺吩藍(Typan Blue)染色血細胞計數(shù)板計數(shù) 活細胞數(shù)，10皿取平均值。結(jié)果如下：

' 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠有效地培養(yǎng)人脂肪干細胞。并且細胞生長曲線與' 現(xiàn)有技術(shù)的S形稍有不同，幾乎為7字型，進入對數(shù)生長期的時間更短，并且細胞的飽和濃度 更高。之后細胞增長減速進入平臺區(qū)，調(diào)亡的細胞并不是很多，保持了更長的細胞穩(wěn)定期。
[0024] 實施例5細胞形態(tài)學分析 取實施例4的高峰期之后的的細胞進行顯微鏡檢測，發(fā)現(xiàn)1-27和30組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細 胞形態(tài)完全相同。而28組合29組的細胞已經(jīng)呈現(xiàn)過早分化的狀態(tài)。取培養(yǎng)10天后的細胞檢 測發(fā)現(xiàn)，1-27組的細胞形態(tài)仍然完好，基本很少出現(xiàn)調(diào)亡細胞。而28和29組有較多的調(diào)亡細 胞，30組也出現(xiàn)較大比例的調(diào)亡細胞，運說明，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基具有較好的保持細胞完 整性和維持細胞活性的功能。
[0025] 實施例6表面抗原分析 取用1-27組培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代脂肪干細胞，去掉培養(yǎng)液，用1: 1的2.5%的膜蛋白酶溶 液和0.0296邸TA溶液混合消化，用含1%牛血清白蛋白（BSA)的PBS洗涂后制成每lOOul含有1 X 106個單細胞懸液，等分為7份，分別加入7個化pendorf管中并編號，一號管加入共20μ L 的FITC Mouse IgGl、APC_CY7Mouse IgG化和染色緩沖液用于檢測由于抗體非特異性結(jié)合 產(chǎn)生的背景作為對照，其他試管分別加入CD29、CD34、44、45、105、HLA.DR單克隆抗體各20μ L，每管分別加入細胞懸液100 μ L (含1 X 106個細胞），室溫解育25min，用含1%BSA的PBS 洗涂后，流式細胞儀檢測。分析結(jié)果:流式細胞儀分析原代人脂肪干細胞六種表面抗原29， 34，44，CD45，CD 105和HLA. DR，結(jié)果表明使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細胞具有人脂肪干細胞 特性。HLA. DR陰性，排除該類細胞是成纖維細胞。
[0026] W上所述的僅是本發(fā)明的一些實施方式。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不 脫離本發(fā)明造構(gòu)思的前提下，還可W做出若干改變和改進，運些都屬于發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于人脂肪干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在高糖型DMEM細胞培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上 加入青霉素100IU/ml，鏈霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，堿性成纖維細胞生長因子 10ng/ml，維生素 C 50μg/ml，人血清白蛋白13yg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白6yg/mL，還原型谷胱甘肽10μ g/mL,亞油酸5yg/mL和多肽30μg/ml組成。2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述的多肽分別如SEQ ID NO: 1-27任一所 不。3. 權(quán)利要求1-2任一項所述的培養(yǎng)基在用于培養(yǎng)人脂肪干細胞中的用途。4. 一種多肽，其序列如SEQ ID NO: 1-27任一所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了ー種用于培養(yǎng)人脂肪干細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由如下組分組成：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、還原型谷胱甘肽、亞油酸、青霉素，鏈霉素，L-谷氨酰胺，堿性成纖維細胞生長因子，維生素？C和植物提取多肽組成。本發(fā)明的培養(yǎng)基具有培養(yǎng)速度，細胞保持較好的完整性和活性。該培養(yǎng)基能夠用于大規(guī)模的細胞培養(yǎng)，成本低廉方便配制。
【IPC分類】C07K7/08, C12N5/0775
【公開號】CN105586311
【申請?zhí)枴緾N201610123460
【發(fā)明人】李倩
【申請人】李倩
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年3月6日