1.一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,包括以下步驟:
A、將人胚胎干細(xì)胞接種到飼養(yǎng)層細(xì)胞中,加入干細(xì)胞完全培養(yǎng)基,放置培養(yǎng)4-5天并定期換液;
b、去除分化細(xì)胞后用酶處理人胚胎細(xì)胞成小團(tuán)塊并接種于培養(yǎng)皿,加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細(xì)胞因子,懸浮培養(yǎng)3天形成類胚體;
c、按照一定的密度將類胚體接種到貼壁培養(yǎng)皿,加入分化培養(yǎng)基并添加特定的細(xì)胞因子,貼壁培養(yǎng)并定期換液11天;
d、更換為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基,放置培養(yǎng)2周,然后用酶處理細(xì)胞并1:2傳代,接種到貼壁培養(yǎng)皿,繼續(xù)培養(yǎng)4周,即可得到100%純化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟a中所述飼養(yǎng)層細(xì)胞為X射線處理小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟a中所述干細(xì)胞完全培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺、β-巰基乙醇及成纖維細(xì)胞生長因子,其中,血清替代物的體積含量為20%,非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L,青霉素的濃度為100U/ml,鏈霉素的濃度為100ug/ml,谷氨酰胺的濃度為1mmol/L,β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L,成纖維細(xì)胞生長因子濃度為4ng/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟b中所述去除分化細(xì)胞是用玻璃針挑除分化的干細(xì)胞;所述酶處理為5mg/ml膠原酶IV處理12分鐘并用移液器機(jī)械吹打;所述小團(tuán)塊為20~50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊;所述培養(yǎng)皿為不貼壁的細(xì)菌培養(yǎng)皿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟b中所述分化培養(yǎng)基成分為:Neurobasal medium和 DMEM/F12等體積混合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、N2、B27、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇,其中,N2體積含量為1%,B27體積含量為1%,青霉素的濃度為100U/ml,鏈霉素的濃度為100ug/ml,谷氨酰胺的濃度為1mmol/L,β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟b中所述特定的細(xì)胞因子為CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1與PJ34,各細(xì)胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為:CKI-7:5μM,SB431542:5μM,Noggin:1μg/ml;IGF1:5ng/ml,PJ34:3μM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟c中所述一定的密度為10個(gè)類胚體/cm2;所述貼壁培養(yǎng)皿為300ug/ml matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟c中所述特定的細(xì)胞因子為CKI-7、SB431542、Noggin、IGF1與PJ34,各細(xì)胞因子在分化培養(yǎng)基中含量分別為:CKI-7:5μM,SB431542:5μM,Noggin:10μg/ml;IGF1:10ng/ml,PJ34:3μM。。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,步驟d中所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇,其中,血清替代物的體積含量為20%,非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L,青霉素的濃度為100U/ml,鏈霉素的濃度為100ug/ml,谷氨酰胺的濃度為1mmol/L,β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L;所述酶處理為0.25%胰酶處理10分鐘;所述貼壁培養(yǎng)基為300ug/ml matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿;100%純化視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為整皿的單層視網(wǎng)膜色素上皮樣細(xì)胞,該細(xì)胞呈鵝卵石樣形態(tài),有色素積累。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法,其特征在于,各步驟中所述培養(yǎng)是在37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。