一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法，涉及植物病原菌的分離與純化技術(shù)。從采集的輪紋病枝上，切取新鮮的輪紋病斑或病鍵交界處的寄主組織，在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中侵泡5~20分鐘后，直接接種30~80日齡蘋果幼果的人制傷口，在20~30℃環(huán)境下保濕培養(yǎng)5~7天；待接種果實(shí)發(fā)病并形成0.2~1cm寬的環(huán)狀病斑后，轉(zhuǎn)入黑光燈或紫外燈下培養(yǎng)5~10天，誘導(dǎo)病斑產(chǎn)生分生孢子；將孢子涂布到2%瓊脂平板上，在顯微鏡下挑取單個(gè)的分生孢子，轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可獲得蘋果輪紋病菌的單孢分離菌株。本發(fā)明以克服了常規(guī)方法分離純化方法工作量大、誘導(dǎo)產(chǎn)孢困難、分離頻率低等問題，為輪紋病的研究提供了一套簡便、快捷、準(zhǔn)確、可靠的病原菌分離純化技術(shù)。
【專利說明】
一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物病原菌的分離與純化研究領(lǐng)域，涉及病原真菌的分離、純化、誘導(dǎo)產(chǎn)孢與培養(yǎng)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果輪紋病是蘋果上的重要病害，主要為害枝干和果實(shí)，在環(huán)渤海灣和黃河故道蘋果產(chǎn)區(qū)危害尤為嚴(yán)重，已成為蘋果樹上的第一大病害。
[0003]病菌侵染枝干形成病瘤、粗皮和干腐病斑，嚴(yán)重影響樹勢，當(dāng)樹體受到干旱脅迫或衰弱時(shí)，輪紋病菌在枝干內(nèi)迅速擴(kuò)展，形成干腐病斑，最終導(dǎo)致樹體或枝干死亡；2008年，對全國7個(gè)蘋果主產(chǎn)省，88個(gè)果園枝干輪紋病調(diào)查表明，蘋果枝干輪紋病的總體發(fā)病率達(dá)77.6%。
[0004]輪紋病菌侵染果實(shí)，導(dǎo)致果實(shí)輪紋病，嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)；在未套袋果實(shí)上，因輪紋病導(dǎo)致的爛果每年都在5%~30%之間，重病園高達(dá)80%以上。
[0005]蘋果輪紋病是由子囊菌亞門葡萄座腔菌屬方oiriWfMaeria spp.的真菌侵染引起的一種真菌病害；分離純化病原菌是開展病原菌生物學(xué)、群體遺傳、病害發(fā)生流行規(guī)律、篩選防治藥劑等項(xiàng)研究的前提和基礎(chǔ)，這些研究都需要純化的輪紋病菌。
[0006]分離與純化蘋果輪紋病的常規(guī)方法需要病菌分離、誘導(dǎo)產(chǎn)孢、單孢分離和致病性驗(yàn)證4個(gè)步驟；病菌分離是從果園內(nèi)采集枝條或果實(shí)上的病斑，切取病健交界處的寄主組織，用70%的酒精和次氯酸鈉消毒后，轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上分離培養(yǎng)，獲得病菌；誘導(dǎo)產(chǎn)孢是在分離獲得病原菌后，通過黑光照謝處理，誘導(dǎo)PDA上培養(yǎng)的病菌產(chǎn)生分生孢子；單孢分離是當(dāng)誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生孢子后，挑取單個(gè)的孢子轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中，獲得單孢分離菌株；致病性驗(yàn)證則是將獲得單孢分離菌株回接到蘋果果實(shí)或枝條上，能使接種果實(shí)和枝條發(fā)病的分離菌株才是致病的輪紋病，才能用于下一步的試驗(yàn)研究。
[0007]蘋果輪紋病菌常規(guī)分離純化方法的缺點(diǎn)是:工作量大，步驟繁瑣，而且從寄主組織內(nèi)分離到的雜菌多，獲得目標(biāo)菌株的概率低，利用純培養(yǎng)的菌株誘導(dǎo)產(chǎn)孢困難，獲得單孢分離菌株的概率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對常規(guī)方法的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一套簡便、快捷、準(zhǔn)確、可靠的分離純化技術(shù)，以解決蘋果輪紋病菌分離純化工作量大、誘導(dǎo)產(chǎn)孢困難、分離頻率低等問題。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)原理如下:輪紋病菌能夠從傷口侵染幼齡的蘋果果實(shí)，并誘發(fā)褐色病斑；不能誘發(fā)幼果發(fā)病的真菌，不是輪紋病菌，或不是致病的輪紋病，從而對病菌的致病性進(jìn)行篩選；果實(shí)發(fā)病并形成較大的病斑后，對發(fā)病果實(shí)進(jìn)行黑光或紫外光照謝處理，誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生分生孢子；蘋果幼果上的輪紋病斑在短波光的照謝下很容易產(chǎn)生分生孢子；挑取病斑上的單個(gè)分生孢子培養(yǎng)，可獲得純化且具有致病的輪紋病菌；通過單孢分離，實(shí)現(xiàn)對病菌的分離與純化。
[0010]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:切取輪紋病的病組織直接接種蘋果幼齡果實(shí)，誘發(fā)果實(shí)產(chǎn)生輪紋病斑，果實(shí)發(fā)病后，將病果放在短波光下照謝，誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生分生孢子；當(dāng)病菌產(chǎn)孢后，挑取單個(gè)的分生孢子，轉(zhuǎn)入PAD中培養(yǎng)，獲得純化菌株。
[0011]具體實(shí)施方案如下:
(1)樣品采集:從目標(biāo)果園內(nèi)采集帶有輪紋病斑的枝條和果實(shí)，用小刀切取病斑或病健交界處的寄主組織，修成不超過5毫米見方的組織塊；接種時(shí)無需要進(jìn)行消毒處理；
(2)幼果準(zhǔn)備:從果園內(nèi)摘取30~80日齡蘋果的幼果，其中50~60日富士品種果實(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)孢效果最好；蘋果幼果可以放在3°C ~5°C的冷藏箱內(nèi)長期保存；接種時(shí)，取保存的幼果，用70%的酒精擦試果實(shí)表面消毒；取直徑5毫米的消毒打孔器，或者消毒小刀，沿幼果腰部均勻挖孔，人為制造2~4個(gè)傷口，傷口直徑和深度都不能超過5毫米，傷口間的距離不小于2厘米；
(3)接種與培養(yǎng):取輪紋病的病組織在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中浸泡5~20分鐘，用消毒攝子將病組織直接塞入幼果的傷口中，每孔一塊病組織，讓病組織盡可能多地接觸果肉；將接種幼果放入鋪有濕潤濾紙的保濕缸或保濕盒內(nèi)，轉(zhuǎn)入20°C ~25°C的環(huán)境中保濕培養(yǎng)5~7天；待大部分接種傷口發(fā)病，并形成0.2~lcm寬的環(huán)狀病斑后，取出果實(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)孢；
(4)誘導(dǎo)產(chǎn)孢:將發(fā)病的果實(shí)放在10W~60W，波長約為365nm黑光燈，或波長為256nm紫外燈下培養(yǎng)5~10天，病斑上產(chǎn)生黑色球狀的分生孢子器，并溢出灰白色的線狀分生孢子角；病果離燈的距離不超過20厘米，環(huán)境溫度控制在20°C ~30°C之間，相對濕度控制在60%-90% 之間；
(5)分離單孢:稱取2克瓊脂粉，加入98毫升蒸餾水，經(jīng)121°C滅菌20min;在超凈工作臺上，用移液槍取5毫升融化的水瓊脂，均勻的涂布到滅菌的載玻片上，制成平板，平板厚度為0.5~1毫米；取玻璃毛細(xì)管，在酒精燈上從中間灼燒后拉細(xì)，冷卻后折斷；用燒制后的玻璃毛細(xì)管挑取分生孢子角，涂布到水瓊脂上，滴加1~2滴無菌水，將孢子涂開；在100倍顯微境下，找單個(gè)的分生孢子，用燒制的毛細(xì)管挑出，轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基上；自每塊病組織產(chǎn)生的分生孢子中，挑取3~4個(gè)分生孢子，置入同一個(gè)培養(yǎng)皿中，在25°C下培養(yǎng)3-4天，選取生長良好，性狀典型的菌落，即為純化后的蘋果輪紋病菌。
[0012]本發(fā)病的優(yōu)點(diǎn)在于:方法簡便，分離純化病菌的效率高，獲得的菌株可靠，不需要再作致病性驗(yàn)證。
[0013]應(yīng)用實(shí)例，用于抗藥檢測輪紋病菌菌株的分離與純化:
(1)樣品準(zhǔn)備:2014年8月份，自山東沂源的果園內(nèi)，采集的帶有3個(gè)以上輪紋病瘤或馬鞍狀病斑的枝段20個(gè)，每個(gè)枝段長約5厘米，以枝段為單位分離輪紋病菌；病菌分離時(shí)，用小刀從每個(gè)枝段上切取3個(gè)輪紋病瘤或馬鞍狀病斑，修成約0.5厘米見方的組織塊，在滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中浸泡5~10分鐘；
(2)幼果接種:取6月采集，且在5°C冷藏箱中保存的蘋果幼果20個(gè)，用70%的乙醇擦拭表面消毒后，用直徑0.5厘米打孔器，沿果實(shí)腰部均勻打3個(gè)深度3~5毫米的孔，把在滅菌馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中浸泡的組織塊直接塞入孔內(nèi)，每個(gè)枝條上的病組織接種于同一個(gè)果實(shí)上，共接種20個(gè)果實(shí)； (3)誘導(dǎo)產(chǎn)孢:把接種幼果放入保濕缸內(nèi)，在保濕缸內(nèi)加入蒸餾水，將缸內(nèi)相對濕度控制在100%，然后轉(zhuǎn)入25°C的恒溫箱中培養(yǎng)，5天后共有18個(gè)果實(shí)發(fā)病，每個(gè)果實(shí)至少有I個(gè)典型的輪紋病斑；把發(fā)病的果實(shí)轉(zhuǎn)入30W的黑光燈下誘導(dǎo)產(chǎn)孢，病果離黑光燈5厘米左右，相對濕度控制在60%~90%之間，溫度控制在20~30°C之間，培養(yǎng)5天后，發(fā)病果實(shí)陸續(xù)產(chǎn)孢，并溢出孢子角；病斑的產(chǎn)孢率在90%以上；
(4)單孢分離:挑取病斑上的分生孢子角，涂布在2%水瓊脂上，顯微鏡下用毛細(xì)管挑取單個(gè)孢子轉(zhuǎn)入PDA平板培養(yǎng)基中，從每個(gè)病果上挑取3~6個(gè)分生孢子，轉(zhuǎn)入2個(gè)培養(yǎng)皿中，25°C培養(yǎng)3~5天后，選取典型菌落，即為純化的單孢菌株；
(5)結(jié)果:從20個(gè)枝條接種的20個(gè)幼果中，共分離獲得18個(gè)純化的單孢菌株。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法；其特征在于:在蘋果幼齡果實(shí)的傷口內(nèi)直接接種輪紋病的病組織，保濕培養(yǎng)，待果實(shí)發(fā)病并形成病斑后，誘導(dǎo)病斑產(chǎn)生分生孢子，挑取單個(gè)的分生孢子培養(yǎng)，獲得輪紋病菌的單孢菌株； 所述蘋果幼齡果實(shí)為從果園內(nèi)摘取的30~80日齡的蘋果幼果，其中用50~60日齡的富士品種幼果誘導(dǎo)產(chǎn)孢效果最好；蘋果幼果可以放在3°C ~5°C的冷藏箱內(nèi)長期保存； 所述傷口是對蘋果幼果進(jìn)行表面消毒后，用打孔器或小刀，在果實(shí)表面均勻挖孔，人為制造傷口，傷口直徑和深度不要超過5毫米，間距不小于2厘米； 所述輪紋病的病組織是從果園內(nèi)采集帶有輪紋病斑的枝條和果實(shí)，用小刀切取病斑，或病健交界處的寄主組織，病組織大小不超過5毫米； 所述接種是將輪紋病的病組織在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中浸泡5~20分鐘后，直接塞入幼果的傷口中，每個(gè)傷口一塊病組織； 所述保濕培養(yǎng)是把接種幼果放入保濕缸或保濕盒內(nèi)，轉(zhuǎn)入20°C ~25°C的環(huán)境中保濕培養(yǎng)5~7天，誘導(dǎo)接種果實(shí)發(fā)??； 所述誘導(dǎo)病菌產(chǎn)生分生孢子是當(dāng)發(fā)病幼果形成0.2~lcm寬的環(huán)狀病斑后，將病果放在10W~60W，波長約為365nm黑光燈，或波長約為256nm紫外燈下培養(yǎng)5~10天；病果離燈的距離不超過20厘米，環(huán)境溫度控制在20°C ~30°C之間，相對濕度控制在60%~90%之間，誘導(dǎo)病斑上的輪紋病菌產(chǎn)生分生孢子；其中黑光燈誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)孢的效果更好； 所述挑取單個(gè)的分生孢子培養(yǎng)是用玻璃毛細(xì)管挑取分生孢子角，涂布到2%水瓊脂平板上，在100倍顯微境下，找單個(gè)的分生孢子，用燒制的毛細(xì)管或挑針挑出，轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上培養(yǎng)。2.權(quán)利要求1所述的一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法，其特征是:在蘋果幼果的傷口內(nèi)直接接種輪紋病的病組織，待果實(shí)發(fā)病后，在黑光燈或紫外燈誘導(dǎo)病菌產(chǎn)孢，然后挑取單個(gè)分生孢子培養(yǎng)，順序操作。
【文檔編號】C12R1/645GK106032523SQ201510116069
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發(fā)明人】李保華, 靳丹丹, 董向麗
【申請人】李保華, 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)