專利名稱：細(xì)菌菌毛純化新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化工藝，確切地說是一種細(xì)菌菌毛純化新工藝。
注射疫苗是預(yù)防致病細(xì)菌感染的有效手段。有些疫苗可以由該致病細(xì)菌的菌毛來制備。純凈的菌毛自人工培養(yǎng)的細(xì)菌上收集后經(jīng)純化而得。整個生化工藝包括細(xì)菌的培養(yǎng)和收集，然后用高速攪拌機(jī)使菌毛自菌體上脫落，離心分離，保留含有菌毛的上清液，加入硫酸銨使菌毛沉淀，最后純化。
目前公知的菌毛純化方法是將沉淀的菌毛懸浮在氯化銫溶液中，用超速離心機(jī)離心分離8小時，利用氯化銫溶液所獨(dú)具的濃度梯度分布這一特定的性質(zhì)來純化菌毛。該工藝不僅需要貴重的儀器超速離心機(jī)和昂貴的氯化銫試劑，而且制備的菌毛純度不高，其中混有雜質(zhì)蛋白，尤其是菌毛自菌體脫落時所粘附的細(xì)菌外膜蛋白難以除去。
本發(fā)明所提供的純化工藝可以有效地除去細(xì)菌外膜蛋白等雜質(zhì)蛋白，旨在為制備疫苗提供高純度的細(xì)菌菌毛。
本發(fā)明所提供的純化工藝基于以下兩個思路。一、菌毛也是一種蛋白質(zhì)，但分子量較大，一般超過1千萬道爾頓(10,000KD)，而菌毛中混雜的雜質(zhì)蛋白分子量較小，一般只有數(shù)萬道爾頓，因此可以使用超濾器，選擇適當(dāng)?shù)某瑸V膜就可以分離、去除雜質(zhì)蛋白。一般情況下選擇10萬道爾頓的超濾膜就可滿足純化要求，為節(jié)省超濾時間也可以選擇20萬、30萬道爾頓等較大濾孔的超濾膜。二、選擇恰當(dāng)?shù)娜ス竸?，在攪拌條件下去除菌毛粘附的細(xì)菌外膜蛋白，最后分離得到高純度的菌毛。這種去垢劑應(yīng)選擇PH值接近中性的表面活性劑，如月桂醇硫酸鈉、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸鹽、甜菜堿衍生物等。
本工藝操作簡單，使用的超濾器比超速離心機(jī)要簡單、廉價得多，所用的表面活性劑也比氯化銫容易得到且價格便宜，制備成本可大幅度降低，而且可以大批量制備高純度的菌毛，用這種菌毛制備的疫苗特異性強(qiáng)。
非限定實(shí)施例一、陰溝桿菌菌毛的純化
陰溝桿菌(如

圖1所示)是住院的病人很容易感染的條件性致病菌。它對多種抗生素如青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等均呈現(xiàn)耐藥性。患者一旦被感染很難控制。若利用該菌的菌毛制備疫苗，可使患者獲得免疫力，從而預(yù)防由該致病菌所引起的感染。
1、陰溝桿菌的培養(yǎng)與收集用液體培養(yǎng)基(CB或BBL)培養(yǎng)陰溝桿菌，然后離心收集陰溝桿菌。
2、菌毛的收集將陰溝桿菌懸浮在三羥基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl，濃度10毫摩爾/升、PH7.2)緩沖溶液中，用高速攪拌機(jī)攪拌3-5分鐘，停3-5分鐘，防止溫度過高引起菌體破裂。如此重復(fù)攪拌若干次，離心分離，棄去沉淀的菌體，保留上清液。
用飽和的硫酸銨溶液等體積加入上清液中，攪拌均勻，4℃條件下靜置4小時。30000g低溫離心分離15分鐘，棄去上清液，保留沉淀的菌毛。
3、菌毛的純化(1)超濾將收集的菌毛再次懸浮在Tris-HCl緩沖溶液中，使用超濾器進(jìn)行超濾，選擇10萬道爾頓的超濾膜，使溶液中分子量小于10道爾頓的雜質(zhì)蛋白被除去，而菌毛被截留。
(2)向懸浮有菌毛的Tris-HCl緩沖液(即超濾截留液)中加入月桂醇硫酸鈉，使每升截留液中含25-55克，同時加入二硫蘇糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩爾，攪拌2小時，離心分離，棄去上清液，將保留在沉淀中的菌毛反復(fù)處理三次，便得到高純度的陰溝桿菌的菌毛。
去垢劑除了月桂醇硫酸鈉外，還可使用月桂醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、烷基苯磺酸鈉、去氧膽酸鹽、甜菜堿衍生物等。其使用濃度亦為每升截留液中含25-55克。
圖2所示是各種方法純化的陰溝桿菌菌毛用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法測定得到的電泳圖。
A行是標(biāo)準(zhǔn)分子量，自上而下依次為97KD、66KD、45KD、30KD、20KD、14KD。KD為千道爾頓。
B行是硫酸銨沉淀得到的菌毛電泳圖譜。
C行、D行是氯化銫溶液純化得到的菌毛電泳圖譜。
E行是本工藝得到的菌毛電泳圖譜。
從以上圖譜中可以看到，雜質(zhì)蛋白B行最多，E行最少。在E行中清楚地顯示主亞基分子量1.8萬道爾頓(18KD)，其中含量較少被稱之為粘附蛋白的亞基為3.5萬道爾頓(35KD)。此粘附蛋白起識別粘膜組織特異性受體的作用。
二、致病大腸桿菌菌毛的純化1、致病大腸桿菌的培養(yǎng)、收采及菌毛的收集同實(shí)施例一。
2、菌毛的純化(1)超濾將沉淀的菌毛懸浮在Tris-HCl緩沖溶液中(濃度同實(shí)施例一)，使用超濾器進(jìn)行超濾，選擇20萬道爾頓的超濾膜，除去雜質(zhì)蛋白，截留菌毛。
(2)向截留液中加入去氧膽酸鹽，使每升截留液中含25-55克，同時加入二硫蘇糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩爾，攪拌2小時，離心分離，棄去上清液，將保留在沉淀中的菌毛反復(fù)處理三次，便得到高純度的致病大腸桿菌菌毛。
去垢劑還可以使用甜菜堿衍生物，月桂醇硫酸鈉、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、烷基苯磺酸鈉等，其使用濃度亦為每升截留液中含25-55克。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)菌菌毛純化新工藝，包括細(xì)菌的培養(yǎng)和收集以及菌毛的收集和純化，其特征在于所述的純化為(1)將收集的菌毛懸浮在Tris-HCl緩沖溶液中，使用超濾器選擇等于或大于10萬道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，保留含有菌毛的截留液；(2)向截留液中加入PH值接近中性的去垢劑月桂醇硫酸鈉或者月桂醇聚氧乙烯醚硫酸鈉或者烷基苯磺酸鈉或者去氧膽酸鹽或者甜菜堿衍生物，使每升截留液中含去垢劑25-55克，同時加入二硫蘇糖醇，使每升截留液中含8-12毫摩爾，充分?jǐn)嚢?，離心分離，收集沉淀的菌毛。
全文摘要
一種細(xì)菌菌毛純化新工藝,包括細(xì)菌的培養(yǎng)和收集以及菌毛的收集和純化,所述的純化是將采集的菌毛懸浮在Tris－HCl緩沖溶液中,使用超濾器進(jìn)行超濾以去除雜質(zhì)蛋白,再使用去垢劑去除菌毛粘附的細(xì)菌外膜蛋白。本工藝簡單,低成本,可大批量制備高純度的菌毛,用這種菌毛制備的疫苗特異性強(qiáng)。
文檔編號C07K1/36GK1228439SQ9910384
公開日1999年9月15日 申請日期1999年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月24日
發(fā)明者徐斌, 熊祖應(yīng) 申請人:徐斌, 熊祖應(yīng)