專利名稱：3株囊球粘細菌及篩選純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及3株囊球粘細菌"/^/ococc^ )及其篩選純化方法。
技術背景粘細菌是最高等的原核生物類群，是以滑動方式運動的具有復雜的多細 胞行為的革蘭氏陰性細菌。粘細菌不僅在細胞分化、發(fā)育和生物進化研究中 占有重要地位，而且粘細菌能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生抑菌活性的陽 性菌率甚至高于著名的次級代謝物產(chǎn)生菌放線菌，至今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)粘細菌 產(chǎn)生了幾百種結構不同的化合物，這些化合物中的許多是以前從未發(fā)現(xiàn)過的。 因此，粘細菌是極具有研究開發(fā)價值的微生物類群。然而目前，粘細菌的分 離純化和培養(yǎng)耗時制約著粘細菌的研究，導致全世界只有很少數(shù)實驗室研究 粘細菌。所以，粘細菌及其次級代謝產(chǎn)物均顯得非常珍貴。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明分離得到了 3株囊球粘細菌菌株，其在中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物保藏中心保藏，保藏編號分別為CGMCC1959, CGMCC1960， CGMCC1961。 篩選方法1.平板篩選取兔糞適量，用抗真菌藥浸泡6h，然后接種于含抗真菌藥的安琪酵母水培養(yǎng)基平板，置30 'C孵箱恒溫保濕培養(yǎng)4天，及時挑取疑 似粘細菌的菌落，轉(zhuǎn)接于VY/4培養(yǎng)基(維生素酵母培養(yǎng)基/4:安琪酵母 0.25%， CaClr2H2O0.1%，維生素B12 0,5 |ag/mL，瓊脂粉1.5%， pH7.2)平 板上，繼續(xù)置3(TC恒溫保濕培養(yǎng)3-4天。2. 劃線稀釋純化從VY/4平板上挑取疑似菌落邊緣的細菌，于VY/4 培養(yǎng)基平板上劃線，30 。C恒溫保濕培養(yǎng)3-4天。3. 低溫凍融處理將第2步所得單菌落接種于VY/4斜面培養(yǎng)基上，置 一80。C冰箱冷凍48 h，取出放至室溫后立即轉(zhuǎn)接于VY/4斜面培養(yǎng)基上，30 °C3恒溫保濕培養(yǎng)3-4天。該步驟重復3次。4. 加熱處理將第3步所得疑似細菌的VY/4斜面置于58 X:孵箱恒溫 保濕培養(yǎng)30min，然后放至室溫，轉(zhuǎn)接于另一VY/4培養(yǎng)基上，30 'C孵箱恒 溫保濕培養(yǎng)3-4天。5. 進一步篩選用酵母菌和大腸桿菌(活菌或死菌)在氯化鈣水培養(yǎng)基 (CaCl2*2H20 0.1%，瓊脂粉1.5%， pH 7.2)上交叉劃線，將第4步所得疑似菌落轉(zhuǎn)接于劃線處，3(TC恒溫保濕培養(yǎng)3-4天。依次經(jīng)過上述5個篩選步驟，篩選得到純菌株，將所得菌株分別在光學 顯微鏡(革蘭氏染色后)及掃描電子顯微鏡下觀察細菌，其菌學特性為3 個菌株均為革蘭氏陰性細菌，可在固體平板上滑動，在肉湯培養(yǎng)基中不生長， 營養(yǎng)缺乏時易聚集形成子實體，可分解細菌和酵母菌，不能分解纖維素。 CGMCC1959菌為桿狀、兩端略細，菌寬0.75-0.8 um，菌長3.7-5.4um;菌落 邊緣有火焰狀突出，分泌水溶性的金黃色物質(zhì)；子實體復雜，1個粘桿上頂 有1個或多個粘孢子，且子實體上有些粘孢子成曲折鏈狀排列；粘孢子球形， 直徑1.3-1.6ixm。 CGMCC1960菌為船形，兩端略細，菌寬0.6-0.7nm，菌長 4-8 um;菌落邊緣有火焰狀突出，分泌水溶性的淡粉紅色物質(zhì)；子實體復雜， 成叢存在，有分支，大小不等；粘孢子球形，直徑0.9-1.1 um。 CGMCC1961 菌為桿狀，兩端略細,菌寬0.4-0.6 um，菌長3.7-5.4 um;菌落邊緣有火焰狀 突出，有明顯輻射狀波紋，分泌水溶性的金黃色物質(zhì)；子實體大小不等，1 個粘桿上有2個至多個粘孢子，并且子實體上有些粘孢子成曲折鏈狀排列； 粘孢子球形，直徑0.9-1.6 um。本發(fā)明的上述方法分離得到了三3個菌株，根據(jù)《Bergey，s Manual of Determinative Bacteriology》第9版的描述，這3株菌均屬于粘細菌的囊球粘 細菌屬。目前我國的粘細菌庫中菌種很少，尚未見到具有上述菌學特性的粘 細菌，因此本發(fā)明篩選得到的3個新菌株將極大地豐富我國的粘細菌庫資源。粘細菌是極具有研究開發(fā)價值的微生物類群，能產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物。實驗結果表明，本發(fā)明的上述方法篩選得到的粘細菌菌株不僅能產(chǎn)生具有抗菌活性的次級代謝物，而且能產(chǎn)生具有纖溶活性的次級代謝產(chǎn)物，具有 極大的研究和開發(fā)價值。以下結合附圖所示的試驗結果，通過若干實例的具體實施方式
，再對本 發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的 范圍僅局限于下述的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā) 明的范圍。


圖1是菌株CGMCC1959子實體的掃描電鏡圖 圖2是菌株CGMCC1960子實體的掃描電鏡圖 圖3是菌株CGMCC1961子實體的掃描電鏡圖 所有圖片的放大倍數(shù)均為5000倍。
具體實施方式
實例l: 1.平板篩選取兔糞適量，用抗真菌藥(多菌靈30mg/l)浸泡6 h，然后接種于含抗真菌藥(多菌靈30 mg/l)的安琪酵母水培養(yǎng)基(安琪酵母 0.2%，瓊脂粉1.5%， pH7.2)平板，置30 'C孵箱恒溫保濕培養(yǎng)4天，及時 挑取疑似粘細菌的菌落，轉(zhuǎn)接于VY/4培養(yǎng)基(維生素酵母培養(yǎng)基/4:安琪酵 母0.25%， CaCl2'2H2O0.1%，維生素B12 0.5 ng/mL，瓊脂粉1.5%， pH7.2) 平板上，繼續(xù)置3(TC恒溫保濕培養(yǎng)4天。2. 劃線稀釋純化從VY/4平板上挑取疑似菌落邊緣的細菌，于VY/4 培養(yǎng)基平板上劃線，30 'C恒溫保濕培養(yǎng)4天。3. 低溫凍融處理將第2步所得單菌落接種于VY/4斜面培養(yǎng)基上，置 一8(TC冰箱冷凍48 h，取出放至室溫后立即轉(zhuǎn)接于VY/4斜面培養(yǎng)基上，30 °C 恒溫保濕培養(yǎng)4天。該步驟重復3次。4. 加熱處理將第3步所得疑似細菌的VY/4斜面置于58 'C孵箱恒溫 保濕培養(yǎng)30min，然后放至室溫，轉(zhuǎn)接于另一VY/4培養(yǎng)基上，30 。C孵箱恒 溫保濕培養(yǎng)4天。5.進一步篩選用死酵母菌在氯化鈣水培養(yǎng)基(CaCl2*2H20 0.1%，瓊 脂粉1.5%， pH7.2)上交叉劃線，將第4步所得疑似菌落轉(zhuǎn)接于劃線處，30 'C恒溫保濕培養(yǎng)4天。依次經(jīng)過上述5個篩選步驟，篩選得到純菌株，保藏編號為 CGMCC1959。實例2:篩選方法與實例1相同，抗真菌藥為灰黃霉素60 mg/1，恒溫保 濕培養(yǎng)4天，進一步篩選時用活大腸桿菌在氯化鈣水培養(yǎng)基上交叉劃線。篩 選得到純菌株，保藏編號為CGMCC1960。實例3:篩選方法與實例l相同，抗真菌藥為克霉唑60 mg/1,恒溫保濕 培養(yǎng)3天，進一步篩選時用活酵母菌在氯化鈣水培養(yǎng)基上交叉劃線。篩選得 到純菌株，保藏編號為CGMCC1961。
權利要求
1. 3株囊球粘細菌菌株(Angiococcus sp.)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號分別為CGMCC1959，CGMCC1960，CGMCC1961。
2. 根據(jù)權利要求1所述的3株囊球粘細菌菌株，其特征是① 以兔糞為篩選原材料，用抗真菌藥抑制霉菌等真菌的生長，依次采用平板 篩選、劃線稀釋純化，低溫凍融和加熱處理等方法進行篩選和純化，同時使用經(jīng) 過酵母菌和大腸桿菌(活菌或死菌)交叉劃線的氯化鈣水培養(yǎng)基(CaC1^2H20 0.1%，瓊脂粉1.5%， pH7.2)進一步篩選；② 菌學特性3個菌株均為革蘭氏陰性細菌，可在固體平板上滑動，在肉湯 培養(yǎng)基中不生長，營養(yǎng)缺乏時易聚集形成子實體，可分解細菌和酵母菌，不能分 解纖維素。CGMCC1959菌為桿狀、兩端略細，菌寬0.75-0.8nm，菌長3.7-5.4u m; 菌落邊緣有火焰狀突出，分泌水溶性的金黃色物質(zhì)；子實體復雜，l個粘桿上頂 有l(wèi)個或多個粘孢子，且子實體上有些粘孢子成曲折鏈狀排列；粘孢子球形，直 徑1.3-1.6u m。 CGMCC1960菌為船形，兩端略細，菌寬0.6-0.7 W m，菌長4-8um; 菌落邊緣有火焰狀突出，分泌水溶性的淡粉紅色物質(zhì)；子實體復雜，成叢存在， 有分支，大小不等；粘孢子球形，直徑0.9-1.1 nm。 CGMCC 1961菌為桿狀，兩端 略細，菌寬0.4-0.6 nm，菌長3.7-5.4 u m;菌落邊緣有火焰狀突出，有明顯輻射狀 波紋，分泌水溶性的金黃色物質(zhì)；子實體大小不等，l個粘桿上有2個至多個粘 孢子，并且子實體上有些粘孢子成曲折鏈狀排列；粘孢子球形，直徑0.9-1.6!xm。
3. 根據(jù)權利要求2所述的3株囊球粘細菌菌株的篩選純化方法，其特征是 篩選純化中使用了 VY/4培養(yǎng)基(維生素酵母培養(yǎng)基/4:安琪酵母0.25%， CaCl2'2H2O0.1%，維生素B12 0.5 (ig/mL，瓊脂粉1.5%， pH7.2)。
全文摘要
本發(fā)明涉及3株嗜細菌群囊球粘細菌(Angiococcus sp.)及篩選純化方法。以兔糞為篩選原材料，用抗真菌藥抑制霉菌等真菌的生長，依次采用平板篩選、劃線稀釋純化，低溫凍融和加熱處理等方法進行篩選和純化，同時使用經(jīng)過酵母菌和大腸桿菌(活菌或死菌)交叉劃線的氯化鈣水培養(yǎng)基進一步篩選，分離得到3株菌。根據(jù)菌學特性，鑒定該3株菌均屬于囊球粘細菌屬。根據(jù)《Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology》(第9版)的描述，該3株菌屬于3個新菌株。
文檔編號C12N1/20GK101270341SQ20071004897
公開日2008年9月24日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權日2007年4月27日
發(fā)明者蓉 余, 劉冰花, 卞國寧, 李曉紅, 楊繼虞, 熊世娟 申請人:四川大學