一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法，該方法包括高速離心獲取發(fā)酵上清液，用10kda中空纖維柱進(jìn)行超濾去除雜蛋白，用反滲透法進(jìn)行濃縮和除鹽，然后用CMSepharoseFF陽(yáng)離子交換層析柱進(jìn)行層析，得電泳純抗菌肽，該方法簡(jiǎn)單易行，能耗低，獲得的抗菌肽產(chǎn)品純化高，是一種新型工業(yè)化分離純化方法。
【專利說(shuō)明】一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)多肽分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離 純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在 2000?7000道爾頓，由20?60個(gè)氨基酸殘基組成，具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌性， 對(duì)細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、病毒等均有殺滅作用，尤其是對(duì)某些耐藥性病原菌具有殺滅作用，是解 決當(dāng)前抗藥性問(wèn)題的一種全新類型的抗菌物質(zhì)。目前，抗菌肽主要來(lái)源于昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、 兩棲動(dòng)物、植物、細(xì)菌等。
[0003] 抗菌肽產(chǎn)業(yè)是一個(gè)新興的高科技生物工程和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，其市場(chǎng)應(yīng)用廣泛。在 農(nóng)業(yè)上，可用于飼料添加劑，并且適合于多種動(dòng)物的飼養(yǎng)；醫(yī)藥上，可以作為優(yōu)秀的抗菌素 替代品；工業(yè)上，可以作為綠色防腐劑；人類生活上，可作為保健品與抗菌物的替代品。
[0004] 當(dāng)前，我國(guó)抗菌肽產(chǎn)業(yè)仍處于起步階段。在國(guó)內(nèi)抗菌肽的基礎(chǔ)研究已取得一定的 成果，如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃自然教授等從我國(guó)特有物種柞蠶蛹中經(jīng)人工誘導(dǎo)和提取的產(chǎn)物 (溶菌酶抗菌肽，是經(jīng)過(guò)十幾年的努力取得的一項(xiàng)首創(chuàng)性科研成果?？咕姆蛛x純化基 礎(chǔ)研究如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳海英博士論文中有論述，但在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上有待進(jìn)一步研究。 國(guó)內(nèi)抗菌肽產(chǎn)品主要用于動(dòng)物用飼料及養(yǎng)殖，屬于新一代動(dòng)物保健產(chǎn)品，能有效解決現(xiàn)有 抗生素使用過(guò)程中存在的諸多弊端，此種用法考慮成本因素一般不需要高純度抗菌肽。
[0005] 抗菌肽的生物學(xué)活性顯示了其在醫(yī)學(xué)上良好的應(yīng)用前景。抗菌肽醫(yī)藥產(chǎn)品即以生 物工程方法將抗菌肽純化為一類新型藥物，具有廣譜性殺菌作用，并能抑制乙型肝炎病毒 的復(fù)制，特別是對(duì)耐藥性細(xì)菌，抗菌肽有較強(qiáng)殺滅作用，并能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，是一種 具有作用靶點(diǎn)及新作用機(jī)制的化合物。目前，已有多種抗菌肽正在進(jìn)行臨床前的可行性研 究，其中magainins已經(jīng)完成或接近完成三期臨床試驗(yàn)，即將上市。國(guó)內(nèi)，抗菌肽在生物醫(yī) 藥上的研究甚少，工業(yè)化分離純化方法鮮有報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏工業(yè)化分離抗菌肽的技術(shù)缺陷，提供一種細(xì)菌源 抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下方案予以實(shí)現(xiàn)的： 一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法，包括下列步驟： 51. 將250(T6000L的細(xì)菌發(fā)酵液15000rpm/min離心，離心速度為750L/小時(shí)，去除菌 體和發(fā)酵液殘?jiān)?，收集上清液?52. 將上清液經(jīng)lOkda中空纖維柱超濾，去除大分子雜蛋白； 53. 將S2超濾后的溶液經(jīng)0. 001um-0.OOOlum孔徑反滲透膜超濾，去除液體中部分水分 子、無(wú)機(jī)鹽，得到抗菌肽濃縮液； S4.以陽(yáng)離子交換層析柱對(duì)抗菌肽濃縮液進(jìn)行層析，分步收集洗脫液，得電泳純抗菌 肽。 對(duì)于抗菌肽的分離純化，現(xiàn)有技術(shù)中僅僅停留在實(shí)驗(yàn)室分離級(jí)別，實(shí)驗(yàn)室分離抗菌肽 處理的菌體發(fā)酵液體積特別少，一般在幾十毫升，最多也不會(huì)超過(guò)10L。所以，實(shí)驗(yàn)室分離抗 菌肽的時(shí)候不會(huì)考慮材料昂貴、分離時(shí)柱子容易堵塞的問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)大量的探索性試 驗(yàn)，合理控制每一處理步驟的先后順序和處理?xiàng)l件，得到一種適合工業(yè)化分離細(xì)菌源抗菌 肽的方法。另外，本發(fā)明從技術(shù)上也適用于動(dòng)物源抗菌肽的分離純化，但抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi) 含量極微，從動(dòng)物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生 產(chǎn)，因此，在實(shí)際應(yīng)用中，本發(fā)明并不適合分離純化動(dòng)物源抗菌肽。
[0008] 本發(fā)明首先利用高速離心去除菌體及發(fā)酵殘?jiān)?，其目的是為了減少發(fā)酵液對(duì)中空 纖維超濾的影響，提高中空纖維超濾的效率。而在超濾去除雜蛋白時(shí)，本發(fā)明選取截留分子 量在lOkda的中空纖維柱對(duì)發(fā)酵上清液去除大分子雜蛋白，檢測(cè)抗菌肽效價(jià)表明，抗菌肽 上清液經(jīng)過(guò)超濾后，能夠去除高分子量雜蛋白，且抗菌肽溶液的活性基本保持不變。選取多 少截留分子量的中空纖維柱決定了雜蛋白去除的效果。雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道細(xì)菌源 抗菌肽的分子量在lkda左右，只要選取截留分子量大于lOkda的中空纖維柱就可以把抗菌 肽留下來(lái)，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員并不知道雜蛋白的分子量有多大，到底選取截留分子量多 大的中空纖維柱才可能盡可能多的將雜蛋白去除掉，發(fā)明人經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)，選取截 留分子量在lOkda的中空纖維柱可以盡可能多的將雜蛋白去除掉。
[0009] 在反滲透濃縮中，選取的反滲透膜孔徑在0. 00lum-0. 000lum之間，選取的孔徑可 以最大量的去除水分子、無(wú)機(jī)鹽、小分子物質(zhì)等，但是抗菌肽分子不能透過(guò)反滲透膜。發(fā)明 人經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇〇. 〇〇lum-〇.OOOlum孔徑的反滲透膜可以去除80%以上的水，如果 再增大或減小孔徑的大小，都不利于水分、無(wú)機(jī)鹽和小分子物質(zhì)的析出。
[0010] 在陽(yáng)離交換柱層析中，本發(fā)明以陽(yáng)離子交換層析柱對(duì)抗菌肽溶液層析?，F(xiàn)有技術(shù) 中對(duì)于蛋白的層析有多種選擇，可以選擇離子交換層析或凝膠層析，本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)， 工業(yè)化分離抗菌肽不能采用凝膠層析，原因在于，凝膠層析的分辨率不高，分離操作較慢， 因凝膠層析是以物質(zhì)分子量的不同作為分離依據(jù)的，對(duì)于分子量相差不多的物質(zhì)難以達(dá)到 很好的分離效果。
[0011] 優(yōu)選地，所述陽(yáng)離子交換層析柱為CMSepharoseFF陽(yáng)離子交換層析柱或 CM-A-Sephadex25〇
[0012] 優(yōu)選地，當(dāng)所述陽(yáng)離子交換層析柱為CMSepharoseFF陽(yáng)離子交換層析柱時(shí)，所用 的上柱緩沖液為PH5. 0的5mmol/L醋酸鈉緩沖液。
[0013] 本發(fā)明在陽(yáng)離子交換層析時(shí)，先用洗脫液1去除掉雜蛋白，此時(shí)不必收集洗脫液； 然后再使用洗脫液2,分階段收集洗脫液，0D280值低于0. 1時(shí)為第一階段，0D280值高于 〇. 1開(kāi)始收集第二階段，待0D280值低于0. 1時(shí)洗脫液收集完畢。
[0014] 所述洗脫液1為PH6. 5的10mm〇l/L磷酸氫二鈉緩沖液；洗脫液2為pH8. 0的 10mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液+10mmol/L甘氨酸，檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供的細(xì)菌源抗菌肽分離純化方法，操作簡(jiǎn)易、環(huán)保、能耗低，無(wú)需使用大量的 化學(xué)試劑，特別是用中空纖維超濾去除雜蛋白和用反滲透法濃縮，自動(dòng)化程度高，適宜于工 業(yè)上生產(chǎn),經(jīng)過(guò)層析后的抗菌肽純度高，純化倍數(shù)為99倍。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的 限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。 除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購(gòu)。
[0017] 抗菌肽活性的測(cè)定：采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使用抗菌肽微生物檢定法，抑菌指示菌為大腸 桿菌（k12d31)。
[0018] 實(shí)施例1 發(fā)酵培養(yǎng)基為糖蜜6% (Wt)、蛋白胨2%(Wt)、硫酸銨0. 5%(Wt)、硫酸鎂0. 02%(Wt)、磷酸二氫鉀〇.2%(Wt)，pH7.0、培養(yǎng)溫度35°C。采用逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，即50L發(fā)酵罐一500L 發(fā)酵罐一5000L發(fā)酵罐，發(fā)酵時(shí)間為20小時(shí)，發(fā)酵罐的裝液量為50%，5000L發(fā)酵罐內(nèi)含發(fā) 酵液2500L。發(fā)酵完畢后，取樣檢測(cè)發(fā)酵液內(nèi)抗菌肽效價(jià)為15200IU/mL。
[0019] 工業(yè)化分離純化抗菌肽，包括如下步驟： 51. 離心收集上清液：采用轉(zhuǎn)鼓式離心機(jī)離心上述發(fā)酵液，離心轉(zhuǎn)速為15000rpm/min， 離心速度為750L/h，去除菌體和發(fā)酵液殘?jiān)占锨逡?，上清液的體積約2500L; 52. 超濾去除雜蛋白：取步驟S1的上清液，經(jīng)lOkda中空纖維柱超濾，去除抗菌肽 溶液中大分子雜蛋白；使用二級(jí)超濾，超濾后，抗菌肽溶液的效價(jià)為15700IU/mL，體積為 2200L； 53. 反滲透濃縮：取步驟S2的上清液，經(jīng)反滲透膜超濾，去除液體中部分水分子、無(wú)機(jī) 鹽，反滲透膜的孔徑為〇. 〇〇〇5um，采用制水速度為500L/h規(guī)格的膜和泵，經(jīng)過(guò)3-4h濃縮后， 抗菌肽溶液的體積為210L，抗菌肽效價(jià)為163000IU/mL; 54. 陽(yáng)離子交換層析：將S3濃縮的抗菌肽溶液用CMS印haroseFF陽(yáng)離子交換層析，具 體操作步驟為：用醋酸將S3濃縮的抗菌肽溶液pH值調(diào)至5.00,加入陽(yáng)離子樹(shù)脂交換吸附， 吸附時(shí)攪拌速度為30rpm/min，洗脫液洗脫，先用pH6. 50 10mm〇l/L磷酸氫二鈉緩沖液去除 雜蛋白，然后用PH8. 00 10mm〇l/L磷酸氫二鈉緩沖液+10mmol/L甘氨酸緩沖液收集抗菌肽 溶液，收集的高純度抗菌肽溶液體積為16. 9L，抗菌肽效價(jià)為1510000IU/mL，純度為發(fā)酵液 的99倍。表1顯示，經(jīng)陽(yáng)離子交換層析后抗菌肽的活性為1510000IU/mL。
[0020] 表1分離純化各步驟中抗菌肽效價(jià)的變化

【權(quán)利要求】
1. 一種細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟：
51. 將250(T6000L的細(xì)菌發(fā)酵液15000rpm/min離心，離心速度為750L/小時(shí)，去除菌 體和發(fā)酵液殘?jiān)?，收集上清液?br> 52. 將上清液經(jīng)lOkda中空纖維柱超濾，去除大分子雜蛋白；
53. 將S2超濾后的溶液經(jīng)0. 001um-0. OOOlum孔徑反滲透膜超濾，去除液體中部分水分 子、無(wú)機(jī)鹽，得到抗菌肽濃縮液；
54. 以陽(yáng)離子交換層析柱對(duì)抗菌肽濃縮液進(jìn)行層析，分步收集洗脫液，得電泳純抗菌 肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法，其特征在于，所述細(xì) 菌發(fā)酵液的體積為250(T4000L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)菌源抗菌肽的工業(yè)化分離純化方法，其特征在于，所述陽(yáng) 離子交換層析柱為CM Sepharose FF陽(yáng)離子交換層析柱或CM-A-Sephadex 25陽(yáng)離子交換 層析柱。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK104387459SQ201410585338
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】黃樂(lè)天, 曹丁, 夏楓耿, 黃魁英, 明飛平 申請(qǐng)人:廣州市微生物研究所