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棉花曲葉病毒啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):3550966閱讀:927來源:國(guó)知局
專利名稱:棉花曲葉病毒啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分離出棉花曲葉病毒啟動(dòng)子,本發(fā)明還涉及利用這種啟動(dòng)子在植物中表達(dá)外源基因的方法。
植物基因工程的根本目標(biāo)是培育能使目的基因穩(wěn)定而且高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株?;虮磉_(dá)受控于轉(zhuǎn)錄起始處的核苷酸序列即啟動(dòng)子成分,它主要包括RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的信號(hào),以指導(dǎo)合成相應(yīng)的信使RNA分子,進(jìn)一步指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。
目前,已有許多不同來源的啟動(dòng)子被用于轉(zhuǎn)化植物。其中一大類是從根癌農(nóng)桿菌中分離出來的,另一大類為植物本身來源的啟動(dòng)子,上述啟動(dòng)子控制的目標(biāo)基因表達(dá)量往往較低,或存在植物種屬、植物器官、組織特異性。最廣泛使用的啟動(dòng)子則來自于植物病毒?;ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35S)是雙子葉植物轉(zhuǎn)化中最常用的啟動(dòng)子之一,因?yàn)樗趲缀跛薪M織中都能使外源基因高效表達(dá)。此外,為了提高外源基因的表達(dá)水平,通常將各種來源的增強(qiáng)子、順式調(diào)控元件、非轉(zhuǎn)譯序列、內(nèi)含子、外顯子、3’端調(diào)控序列等等與啟動(dòng)子聯(lián)合使用。如來自玉米胚乳蔗糖酶基因的內(nèi)含子1在煙草細(xì)胞內(nèi)可使GUS報(bào)道基因表達(dá)水平提高100倍,玉米胚乳蔗糖酶基因外顯子1的存在能使報(bào)道基因在單子葉和雙子葉植物中的表達(dá)水平提高10倍(C.Mass等,1991,The combination of novel stimulatoryelement in the first exon of the maize Shrunken-1 gene with thefollowing intron-1 enhances reporter gene expression up to 1000-fold.Plant Mol.Biol.,16:199-207)。
來自于植物雙生病毒的啟動(dòng)子對(duì)于外源基因的表達(dá)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。雙生病毒(Geminivirus)是一類具有雙生顆粒形態(tài)的病毒。雙生病毒成員眾多,侵害的作物十分廣泛。依據(jù)病毒基因組結(jié)構(gòu)及所依賴的昆蟲傳播媒體,該類病毒被劃分為三個(gè)亞組。亞組Ⅰ和Ⅱ病毒的基因組為單組份,即只含有一個(gè)基因組成份,這兩類雙生病毒主要由葉蟬傳播;它們的區(qū)別在于前者主要侵染單子葉植物,后者主要侵染雙子葉植物。亞組Ⅲ病毒主要侵染雙子葉植物,依賴粉虱傳播,基因組大多為雙組份,較大的為DNAA,小的為DNA B;其中也有些為單組份。
雙生病毒突出的特點(diǎn)是基因組DNA為單鏈環(huán)狀,其核苷酸長(zhǎng)度約為2,400~3,000nt。該類病毒基因組轉(zhuǎn)錄最顯著的特征是通過同一啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)錄。這一啟動(dòng)子具有兩個(gè)方向的轉(zhuǎn)錄功能,因此本發(fā)明稱該啟動(dòng)子為雙向啟動(dòng)子;其中一個(gè)方向的啟動(dòng)子調(diào)控病毒復(fù)制蛋白基因的表達(dá),另一方向則調(diào)控外殼蛋白基因的表達(dá),因此兩個(gè)方向的啟動(dòng)子分別被稱為復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子和外殼蛋白基因啟動(dòng)子。雙生病毒啟動(dòng)子具有典型的真核啟動(dòng)子特征,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游均存在TATA盒序列(P.A.Eagle等,1997,cis-elements that contribute to geminivrus transcriptionalregulation and the efficiency of DNA replication.J.Virol.,71:6947-6955)。
X.Zhan等(X.Zhan等,1991,Analysis of the potential promotersequence of African cassava mosaic virus by transcient expression oftheβ-glucuronidase gene.J.Gen.Virol.,72:2849-2852)分離了亞組Ⅲ的非洲木薯花葉病毒(ACMV)基因組的雙向啟動(dòng)子區(qū),煙草原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)表明,復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS(報(bào)道基因)活性比CaMV35S啟動(dòng)子的低40倍。外殼蛋白基因啟動(dòng)子本身活性極低,ACMV編碼的AC2蛋白在CaMV35S啟動(dòng)子控制下可使外殼蛋白基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)3倍(Haley,A.等,1992,Regulation of African cassava mosaic virus promotersby the AC1,AC2,AC3 gene products.Virology,188:905-909)。
R.J.Hayes等(R.J.Hayes等,1989,Replication of tomato goldenmosaic virus DNA B in transgenic plants expressing open readingframes(0RFs)of DNA A:requirement of ORF AL2 for production ofsingle-stranded DNA.Nucl.Acids Res.,17:10213-10222)以TGMV作基因載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)TGMV外殼蛋白基因啟動(dòng)子被AC2激活后的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(報(bào)道基因)活性不如CaMV35S啟動(dòng)子的強(qiáng),比CaMV35S啟動(dòng)子低2倍。
C.Brough等(C.Brough等,1992,Kinetics of tomato golden mosaicvirus DNA replication and coat protein promoter activity in Nicotianatabacum protoplast.Virology,187:1-9)發(fā)現(xiàn),以非復(fù)制型的TGMV作載體進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化,外殼蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)活性比CaMV35S啟動(dòng)子強(qiáng)約2倍。而復(fù)制型的TGMV外殼蛋白基因啟動(dòng)子活性約為CaMV35S啟動(dòng)子的60-90倍。
許煜泉等(許煜泉等,1998,煙草黃矮雙生病毒中雙向啟動(dòng)子的活性及其調(diào)節(jié)控制,病毒學(xué)報(bào),14:68-74)分離了亞組Ⅲ的煙草黃矮雙生病毒的雙向啟動(dòng)子區(qū),以GUS作報(bào)道基因,在煙草原生質(zhì)體和玉米細(xì)胞懸浮液中的瞬時(shí)表達(dá)表明,復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子活性最強(qiáng),相當(dāng)于CaMV35S啟動(dòng)子的15-20%。外殼蛋白基因啟動(dòng)子活性最弱,但可被C1:C2蛋白(相當(dāng)于AC2蛋白)激活而使活性增強(qiáng)3倍。
前人對(duì)雙生病毒雙向啟動(dòng)子的研究大多采用瞬時(shí)表達(dá)的方式,X.Zhan等(X.Zhan等,1991,Analysis of the potential promoter sequence ofAfrication cassava mosaic virus.by transcient expression of theβ-glcuronidase gene,J.Gen.Virol.,72:2849-2852)雖采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法對(duì)ACMV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子作了研究,但也發(fā)現(xiàn)比CaMV35S低。綜上文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo),目前分離到的雙生病毒復(fù)制蛋白基因的啟動(dòng)子活性普遍比CaMV35S的低。本發(fā)明從屬于雙生病毒亞組Ⅲ的棉花曲葉病毒中分離啟動(dòng)子,以GUS作報(bào)道基因,研究其表達(dá)強(qiáng)度。
棉花曲葉病毒是新近發(fā)現(xiàn)的雙生病毒,最近幾年在巴基斯坦、蘇丹、印度流行嚴(yán)重。據(jù)巴基斯坦1993-1994年統(tǒng)計(jì),棉花受害面積達(dá)900,000公頃,產(chǎn)量損失高達(dá)80%(M.Ali等,1995,Cotton leaf curl virus in thePunjab,current situation and review of work.Multan:Central CottonResearch Institute/Ministry of food,Agriculture and Livestock,Government of Pakistan/Asian Development Bank)。研究證實(shí),CLCuV由粉虱傳播,侵害的作物非常廣泛,包括法國(guó)豌豆、秋葵、煙草、番茄、棉花等,主要產(chǎn)生葉脈增厚和葉片變黃等癥狀。目前已發(fā)現(xiàn)了至少9種不同的CLCuV株系,X.Zhou(X.Zhou等,1998,Four DNA-A variants amongPakistani isolates of cotton leaf curl virus and their affinities toDNA-A of geminivirus isolates from okra.J.Gen.Virol.,79:915-923)等根據(jù)不同株系的基因組DNA序列,研究了CLCuV的進(jìn)化。至今尚未見有關(guān)將CLCuV的雙向啟動(dòng)子應(yīng)用于植物基因工程的報(bào)導(dǎo)。
植物基因工程在植物的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆境、改良作物品質(zhì)、提高作物固氮能力、雄性不育、延熟保鮮、改變花色和花型等方面取得了較大突破。然而,目標(biāo)基因表達(dá)量低或不穩(wěn)定等不良因素往往制約了植物基因工程飛速發(fā)展的步伐。開發(fā)新型的高效啟動(dòng)子不失為一較理想的策略。
目前使用的啟動(dòng)子的強(qiáng)度普遍較低,或存在植物種屬、器官、組織的特異性。
本發(fā)明的目的是提供一種普遍適用于雙子葉植物或單子葉植物轉(zhuǎn)化的超強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng),使外源基因的表達(dá)量在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高,更廣范圍地在植物體內(nèi)進(jìn)行組成型表達(dá)。
本發(fā)明提供了一種植物病毒的雙向啟動(dòng)子。
本發(fā)明提出的雙向啟動(dòng)子為雙生病毒基因組的一部分,在基因組學(xué)上又稱為大基因間區(qū)(Large intergenic region,LIR)。LIR包含了雙生病毒基因組雙向轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)及其調(diào)控元件,對(duì)于病毒的復(fù)制及雙向轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。
具體地說,本發(fā)明的啟動(dòng)子為棉花曲葉病毒基因組的一部分。更具體地說,本發(fā)明的啟動(dòng)子具有圖1所示的序列。
本發(fā)明的雙向啟動(dòng)子最好來自棉花曲葉病毒(CLCuV)基因組的LIR區(qū),是天然提純的或PCR方法分離的或者參照?qǐng)D1所示的序列化學(xué)合成的。CLCuV屬于雙生病毒亞組Ⅲ,該病毒存在相當(dāng)大的變異,目前在巴基斯坦就已發(fā)現(xiàn)了9種不同的株系。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述的啟動(dòng)子是從一種未知的CLCuV病毒株系中分離的雙向啟動(dòng)子,其DNA序列如圖1所示。
本發(fā)明提供的啟動(dòng)子可分別使用不同的方向驅(qū)動(dòng)外源基因的表達(dá),也可同時(shí)在啟動(dòng)子的兩個(gè)方向連接外源基因,也可將其中的調(diào)控序列分別與其他啟動(dòng)子組成復(fù)合啟動(dòng)子使用。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)知道,將啟動(dòng)子除TATA盒核心區(qū)外的其他序列通過堿基突變或缺失等發(fā)生變化,一般不會(huì)使啟動(dòng)子活性完全喪失,因此也可根據(jù)需要將啟動(dòng)子的調(diào)控元件發(fā)生改變后使用。因而,與圖1所示序列具有80%同源性的DNA序列也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明提供的啟動(dòng)子最好是包含了基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通常稱為+1)上游的序列,不包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)(通常為ATG密碼子)之間的序列。真核生物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特征一般為YYYAYA(Y為嘧啶),轉(zhuǎn)錄起始于第4位的A。根據(jù)已發(fā)表的其它雙生病毒的資料及同源性比較,復(fù)制蛋白基因方向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為基因組第2606核苷酸位置的A,外殼蛋白基因方向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為基因組第255核苷酸位置的T。
本發(fā)明還提供了一種將所說的雙向啟動(dòng)子應(yīng)用于植物中表達(dá)外源基因的方法。該方法包括以下步驟a.將克隆到的雙向啟動(dòng)子與待表達(dá)的外源基因相連,以此構(gòu)建植物表達(dá)載體;b.將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞;c.在適宜的培養(yǎng)條件下將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生,得到表達(dá)外源基因的植株。
上述方法中所說的雙向啟動(dòng)子是一種植物病毒來源的雙向啟動(dòng)子。
具體地說,該啟動(dòng)子來源于棉花曲葉病毒。優(yōu)選該啟動(dòng)子具有圖1所示的序列。該啟動(dòng)子是天然提純的或化學(xué)合成的。
上述方案中使用的啟動(dòng)子由于在兩個(gè)方向均有功能,因此被稱為雙向啟動(dòng)子。它可以在不同方向連接基因。
上述方案中使用的啟動(dòng)子最好是包含了基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(通常稱為+1)上游的序列,不包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)(通常為ATG密碼子)之間的序列。真核生物轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的特征一般為YYYAYA(Y為嘧啶),轉(zhuǎn)錄起始于第4位的A。根據(jù)已發(fā)表的其它雙生病毒的資料及同源性比較,復(fù)制蛋白基因方向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為基因組第2606核苷酸位置的A,外殼蛋白基因方向啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為基因組第255核苷酸位置的T。
上述方案中使用的啟動(dòng)子最好是包含了啟動(dòng)子本身的調(diào)控外源基因表達(dá)的所有順式調(diào)控元件,如根特異性、葉肉細(xì)胞特異性、種子胚乳特異性、花器官特異性、果實(shí)特異性、維管組織特異性等等組織特異性元件及誘導(dǎo)性調(diào)控元件如損傷誘導(dǎo)等,以及所有的增強(qiáng)外源基因表達(dá)的增強(qiáng)子元件、降低外源基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控元件等。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)知道,組成型表達(dá)的啟動(dòng)子往往由許多模塊化(Modular)的順式調(diào)控元件組成,這些調(diào)控元件決定了基因表達(dá)的特性,可與其它所有來源的在植物中表達(dá)外源基因的啟動(dòng)子組合在一起使用。因此,雙向啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
上述方案中使用的啟動(dòng)子最好是不僅包含病毒基因轉(zhuǎn)錄所需的核心啟動(dòng)子序列如TATA盒,還包含了其它順式調(diào)控元件,也包含了與病毒復(fù)制相關(guān)的序列如非常保守的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)及其周邊序列5’-GCTCCAAAAAGCGGCCATCCGTATAATATTACCGGATGCCGCGCTTT TTTTTTTGTG-3’。將啟動(dòng)子除TATA盒等核心區(qū)外的其他序列通過堿基突變或缺失等發(fā)生變化,一般不會(huì)使啟動(dòng)子活性完全喪失,因此也可根據(jù)需要將雙向啟動(dòng)子的調(diào)控元件發(fā)生改變后使用。因而,與圖1所示序列具有80%,最好是具有99%同源性的DNA序列也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
上述方案中使用的啟動(dòng)子最好是可增添各種來源(包括CLCuV本身)的調(diào)控元件如CaMV35S啟動(dòng)子,章魚堿合成酶基因(ocs)啟動(dòng)子(L.Comai等,1985,Expression in plants of a mutant acroA gene from Salmonellatyphimurium confers tolerance to glyphosate.Nature,317:741-744),甘露堿合成酶基因(mas)啟動(dòng)子(K.E..McBride等,1990,Improvedbinary vectors for Agrobacterium-medidated plant transformation.Plant Mol.Biol.,14:269-276)等來源的順式調(diào)控元件(如增強(qiáng)子元件)等,組成復(fù)合啟動(dòng)子使用。此外,該雙向啟動(dòng)子也可置于各種轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)因子等調(diào)控序列的上游來調(diào)控外源基因的表達(dá),轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)因子如來自苜?;ㄈ~病毒(AMV)的非轉(zhuǎn)譯序列AMV(S.A Jobling等,1987,Enhancedtranslation of chimaeric message RNAs containing a plant viraluntranslated leader sequence.Nature,325:622-625),以及來自煙草花葉病毒(TMV)的Ω因子(K.Richards等,1978,Nucleotide sequenceat the 5’extremity of tobacco mosaic virus RNA,Eur.J.Biochem.,84:513-519)等。在嵌合基因構(gòu)建物中,也可以部分或全部地插入其它的所有旨在增強(qiáng)外源基因表達(dá)的DNA序列,其中包括但不限于內(nèi)含子如水稻肌動(dòng)蛋白基因Actin1內(nèi)含子1,來自玉米蔗糖合成酶基因Sh1內(nèi)含子1、玉米Ubquin內(nèi)含子1、玉米乙醇脫氫酶基因1-S內(nèi)含子1等等內(nèi)含子以及外顯子如玉米蔗糖合成酶基因Sh1外顯子1及3’端表達(dá)調(diào)控序列如PⅠ-Ⅱ基因終止子。
本發(fā)明的方法中雙向啟動(dòng)子可以是以復(fù)制蛋白基因方向與外源基因相連,也可以外殼蛋白基因方向與外源基因相連。CLCuV外殼蛋白基因啟動(dòng)子本身活性極低,它可受病毒基因組編碼的AC2蛋白的激活調(diào)控。因而在本發(fā)明的方法中,當(dāng)啟動(dòng)子以外殼蛋白基因方向與啟動(dòng)子相連時(shí),可使用本發(fā)明提供的AC2蛋白基因(DNA序列見圖2)。
本發(fā)明提出的AC2蛋白基因可與各種來源的啟動(dòng)子融合,達(dá)到調(diào)控外殼蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)的目的。其中的啟動(dòng)子包括但不限于CLCuV本身來源的啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、Gt3啟動(dòng)子、rolc啟動(dòng)子、CoYMV啟動(dòng)子、rbcs啟動(dòng)子、hsp70啟動(dòng)子、PⅠ-Ⅱ啟動(dòng)子等等。
本發(fā)明提出的方案中使用了GUS作報(bào)道基因,出于本發(fā)明的目的,報(bào)道基因定義為融合于目標(biāo)啟動(dòng)子下游的一段核苷酸序列,啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄可使報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯生成一些易于測(cè)定的生物化學(xué)物質(zhì),如β-葡糖苷酸酶(GUS)。本發(fā)明通過測(cè)定β-葡糖苷酸酶活性來測(cè)定啟動(dòng)子在煙草和棉花細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度。
本發(fā)明提出的方案中的外源基因,是指所有旨在改變植物本身遺傳性狀的基因。其中包括但不限于所有的非編碼蛋白基因如RNA基因(包括但不限于所有的正義RNA基因和反義RNA基因等等),以及所有的編碼基因(包括但不限于抗蟲、抗病、抗逆、抗除草劑、品質(zhì)改良基因等)都可與該啟動(dòng)子組成嵌合表達(dá)結(jié)構(gòu)并置于載體中,在細(xì)胞中表達(dá)。
重組DNA的技術(shù)包括但不限于分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(J.Sambrook等,1989,“Molecular cloning,a laboratory manual.”Cold Spring HarborLaboratory Press.Cold Spring Harbor,N.Y.),轉(zhuǎn)化植物的方法使用了許多對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說非常熟知的技術(shù),其中包括但不限于基因槍轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化、PEG轉(zhuǎn)化等。以上技術(shù)都涉及使用DNA載體來傳遞用于轉(zhuǎn)化的核苷酸序列,適用于本發(fā)明的載體包括但不限于帶有用于選擇轉(zhuǎn)基因材料的標(biāo)記基因的載體。
本發(fā)明提出的啟動(dòng)子可用于在雙子葉植物(包括但不限于棉花、煙草)中表達(dá)基因,還能用在單子葉植物中驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá),但是雙子葉植物啟動(dòng)子在單子葉植物中的表達(dá)水平有所不同。煙草是常用的模式植物,因?yàn)樗子谠偕?,用根農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的效率特別高。雙子葉植物如(但不限于此)棉花、番茄、油菜、法國(guó)豌豆、秋葵、大豆、煙草等等,單子葉植物如禾本科植物水稻、小麥、玉米、大麥、燕麥等等是優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因宿主。
本發(fā)明提出的對(duì)轉(zhuǎn)化植株的基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),以評(píng)價(jià)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度,并且分析啟動(dòng)子在植物體內(nèi)的表達(dá)的組織化學(xué)定位,使用了許多對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說非常熟知的技術(shù),其中包括但不限于用于GUS酶活性分析的熒光分光光度法,用于組織化學(xué)分析的徒手切片法,冰凍切片法等技術(shù)。
本發(fā)明最后還提出了一種方案,即為了提高雙向啟動(dòng)子中外殼蛋白基因啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度,使用來自CLCuV基因組的AC2蛋白因子。
本發(fā)明提出的AC2蛋白基因是從CLCuV病毒侵染的植物組織總DNA中分離的。它來源于棉花曲葉病毒基因組,可采用PCR方法分離或天然提純或通過化學(xué)的方法合成的。
本發(fā)明的AC2蛋白的核酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列(見圖2),若通過缺失或點(diǎn)突變等方式改變其中的堿基,不會(huì)使AC2蛋白完全喪失功能。
本發(fā)明提出的AC2蛋白若通過增添其它蛋白的序列以組成融合蛋白等,不會(huì)使AC2蛋白完全喪失功能。
本發(fā)明提出的AC2蛋白基因可與各種來源的能在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子融合,達(dá)到調(diào)控外殼蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)的目的。其中的啟動(dòng)子包括但不限于CLCuV本身來源的啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、Gt3啟動(dòng)子、rolc啟動(dòng)子、CoYMV啟動(dòng)子、rbcs啟動(dòng)子、hsp70啟動(dòng)子、PⅠ-Ⅱ啟動(dòng)子。
有益效果本發(fā)明提出的雙向啟動(dòng)子在兩個(gè)方向上都有功能。其中一個(gè)方向,即復(fù)制蛋白(Replication protein,RP)基因啟動(dòng)子可使外源基因在雙子葉植物中的平均表達(dá)量是CaMV35S啟動(dòng)子的5-6倍,最高達(dá)10余倍。
該方向的啟動(dòng)子可在植物根、莖、葉器官中高效表達(dá)外源基因(見下表),其中根部表達(dá)強(qiáng)度最高。
CLCuV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)活性在轉(zhuǎn)基因煙草不同器官中的比較
注表中的數(shù)據(jù)來自農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得的穩(wěn)定表達(dá)GUS基因的6株轉(zhuǎn)化植株(T0代)苗期測(cè)定結(jié)果。數(shù)字以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,單位為pmoles MU/mg蛋白/min,CLCuV PRP表示CLCuV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子,CaMV 35S表示CaMV 35S啟動(dòng)子。
進(jìn)一步的組織化學(xué)定位證實(shí),復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子在葉片的葉肉細(xì)胞(包括柵欄組織、海綿組織)和維管束均有表達(dá)活性;莖部橫切面染色結(jié)果表明,內(nèi)外韌皮部、皮層及木質(zhì)部周圍的薄壁細(xì)胞也有GUS染色。在花器官中,花萼,花瓣,子房,柱頭,花藥均顯示染色。未成熟果實(shí)的外果壁、成熟種子的胚和胚乳均有染色反應(yīng)。
另一方向的啟動(dòng)子即外殼蛋白基因啟動(dòng)子單獨(dú)的表達(dá)活性非常低,僅為本底的5倍(圖4),但經(jīng)AC2蛋白因子的激活后,瞬時(shí)表達(dá)活性提高(見下表)。AC2基因可作為一種基因表達(dá)調(diào)控的開關(guān),控制外殼蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)的開啟與關(guān)閉。
CLCuV外殼蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在棉花和煙草葉片組織中的瞬時(shí)表達(dá)活性相對(duì)比較
注用每種構(gòu)建物植物表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)組織化學(xué)染色后的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)目和強(qiáng)度表不啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)活性相對(duì)值。用+/-表示極低的活性,++表示高活性,+++表示較高活性,++++表示極高的活性。CP啟動(dòng)子表示外殼蛋白基因方向啟動(dòng)子;RP啟動(dòng)子表示復(fù)制蛋白基因方向啟動(dòng)子;CaMV35S啟動(dòng)子表示花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子;AC2表示CLCuV的AC2蛋白基因。


圖1顯示來自CLCuV雙向啟動(dòng)子的序列。注上行數(shù)字表示序列的堿基序號(hào),下行數(shù)字表示相應(yīng)于CLCuV基因組的堿基序號(hào)。單劃線部分為PCR擴(kuò)增引物。陰影部分堿基為與發(fā)表序列不同的堿基。
圖2顯示來自CLCuV的AC2基因的核酸序列及推測(cè)的氨基酸序列。注以CLCuV侵染的煙草葉片總DNA為模板,通過PCR方法獲得AC2基因。PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)521Nt,包括450Nt的編碼序列(即145個(gè)氨基酸)、兩個(gè)終止子(星號(hào)表示)及52Nt非編碼序列(小寫字母表示)。劃線部分的序列表示PCR擴(kuò)增引物。上行數(shù)字表示序列的堿基序號(hào),下行數(shù)字表示相應(yīng)于氨基酸的序號(hào)。
圖3為一條線圖,表示經(jīng)質(zhì)粒載體pRPGUS2300轉(zhuǎn)化后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草不同植株的GUS酶活性。轉(zhuǎn)基因植株葉器官GUS活性測(cè)定熒光值的激發(fā)波長(zhǎng)為365nm,發(fā)射波長(zhǎng)為455nm。CLCuV PRP:CLCuV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子-gus轉(zhuǎn)基因植株;CLCuV PCP:CLCuV外殼蛋白基因啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)基因植株;CaMV P35S:CaMV 35S啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)基因植株;CK未轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照組織。GUS活性計(jì)算值為未除去本底的數(shù)值,單位為pmoleMU/mg蛋白質(zhì)/min。
圖4為一條線圖,表示經(jīng)質(zhì)粒載體pRPGUS2300、pCPGUS2300、pBI121轉(zhuǎn)化后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草中GUS酶活性平均值。轉(zhuǎn)基因植株葉器官GUS活性測(cè)定熒光值的激發(fā)波長(zhǎng)為365nm,發(fā)射波長(zhǎng)為455nm。CLCuV PRP:CLCuV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子-gus轉(zhuǎn)基因植株;CLCuV PCP:CLCuV外殼蛋白基因啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)基因植株;CaMV P35S:CaMV 35S啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)基因植株;CK:未轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照植株。GUS平均活性計(jì)算值為未除去本底的數(shù)值,在條線圖的上方以數(shù)字表示,單位為pmoleMU/mg蛋白/min。
圖5為一條線圖,表示經(jīng)pRPGUS2300轉(zhuǎn)化后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的煙草中根、莖、葉不同器官中GUS酶活性。GUS活性測(cè)定熒光值的激發(fā)波長(zhǎng)為365nm,發(fā)射波長(zhǎng)為455nm。CLCuV PRP:CLCuV復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子-GUS轉(zhuǎn)基因植株;CK未轉(zhuǎn)GUS基因的對(duì)照植株。GUS活性計(jì)算值為未除去本底的數(shù)值,單位為pmoleMU/mg蛋白/min。
實(shí)施例通過在棉花葉片中瞬時(shí)表達(dá)攜帶有啟動(dòng)子序列與GUS基因融合而形成的構(gòu)建物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草測(cè)定GUS活性,評(píng)價(jià)雙向啟動(dòng)子的效率。下文將說明載體的制備方法和轉(zhuǎn)化方法。
啟動(dòng)子的克隆按B.D.Harrison等(B.D.Harriso等,1997,Detection andrelationships of cotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviruses occuring in Pakistan.Ann.Appl.Biol.,130:61-75)的方法,從受CLCuV侵染的煙草葉片中提取總DNA,以下面的寡核苷酸為引物(5’端引物5 ’-CGGGAGCTCATGATTACGGGAGCGTAAAATAC-3’;3’端引物5’-CGCGGTACCATGGTGGCAATCGGTGTACACTC-3’),通過PCR的技術(shù)得到雙向啟動(dòng)子片段P1P2。兩端引物中分別添加了KpnⅠ-SacⅠ雙酶解位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)KpnⅠ-SacⅠ限制性酶切之后,插入質(zhì)粒pGEM7Zf(+)(購(gòu)自Promega公司)的相同雙酶解位點(diǎn)中,得到pGEM7ZP1P2。
包含嵌合RP啟動(dòng)子-GUS基因的表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pAMVGUS融合有一段2.137kb含GUS基因和nos終止子結(jié)構(gòu)的NcoⅠ-SalⅠ雙酶解片段。將該片段克隆在pGEM7ZP1P2的P1方向啟動(dòng)子(復(fù)制蛋白基因啟動(dòng)子)的下游,即NcoⅠ-XhoⅠ雙酶解位點(diǎn)中,得到質(zhì)粒pRPGUS。該質(zhì)粒可作瞬時(shí)表達(dá)載體,為進(jìn)一步構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體,將pRPGUS包含有RP啟動(dòng)子-GUS-nos終止子的表達(dá)結(jié)構(gòu)的約2.5kb SacⅠ-XbaⅠ片段,插入pCAMBIA2300(購(gòu)自CAMBIA公司)的相同雙酶解位點(diǎn)中,得到適合于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體pRPGUS2300。植物表達(dá)載體對(duì)照pBI121含有來自于CaMV的35S啟動(dòng)子-GUS基因表達(dá)結(jié)構(gòu)。
包含嵌合CP啟動(dòng)子-GUS基因的表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒pDMC203融合有一段含GUS基因和nos終止子結(jié)構(gòu)的片段。將pGEM7ZP1P2經(jīng)XhoⅠ-BspHⅠ雙酶解后得到的啟動(dòng)子片段插入pDMC203的XhoⅠ-NcoⅠ雙酶解位點(diǎn)中,得到質(zhì)粒pCPGUS。該質(zhì)??勺魉矔r(shí)表達(dá)載體。為進(jìn)一步構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體,將pCPGUS包含有CP啟動(dòng)子-GUS-nos終止子的表達(dá)結(jié)構(gòu)的約2.5kb BglⅡ-XhoⅠ雙酶解片段插入植物表達(dá)載體pCAMBIA2300(購(gòu)自CAMBIA公司)得到適合于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體pCPGUS2300。
反式作用因子AC2的分離及其表達(dá)載體的構(gòu)建以受CLCuV侵染的煙草葉片中提取的總DNA為模板,以下面的寡核苷酸為引物(5’端引物5’-CGCGAATTCCTAGACGAGGAAAAGAAGAC-3’;3’端引物5’-CGGGTCGACTCTATTAATTGAAATTACACCGAG-3’),通過PCR的技術(shù)得到AC2基因片段。將其5’端用EcoRⅠ酶解,3’端用Klenow酶補(bǔ)平后插入克隆載體pBluescriptKS(+)的SmaⅠ-EcoRⅠ雙酶解位點(diǎn)中得到pBlueAC2P。質(zhì)粒pBPFΩ7包含有非轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)序列Ω因子、CaMV35S啟動(dòng)子和nos終止子的基因表達(dá)載體。將pBlueAC2P經(jīng)EcoRⅠ-XbaⅠ雙酶解后插入pBPFΩ7載體中的相同雙酶解位點(diǎn)中,得到pBPFAC2表達(dá)載體。再將pBPFAC2經(jīng)HindⅢ酶解后插入pCPGUS2300的相同酶解位點(diǎn)中,得到復(fù)合表達(dá)載體pCPGUS230AC2。
棉花和煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)與分析棉籽經(jīng)濃硫酸脫絨后用自來水沖凈。剝出種仁,分別用30%次氯酸鈉浸泡15分鐘、0.1%氯化汞浸泡4分鐘、10%H2O2浸泡20分鐘消毒,無菌水沖洗后接種于發(fā)芽培養(yǎng)基(GA7培養(yǎng)盒)中;煙草種子的消毒采用30%次氯酸鈉浸泡10分鐘。上述處理過的棉花和煙草種子均于光照/黑暗周期比為16/8小時(shí),溫度為25℃的條件下培養(yǎng)30-40天,將無菌苗的葉片用于轉(zhuǎn)化。葉片平鋪在無激素的MS基本培養(yǎng)基上,用pRPGUS、pCPGUS、pCPGUS230AC2質(zhì)粒DNA進(jìn)行基因槍的轉(zhuǎn)化。金粉的制備和轉(zhuǎn)化的方法參照文獻(xiàn)(任延國(guó)等,1998,水稻psbA啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS基因在煙草葉綠體中的瞬間表達(dá),農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),3:78-83)。暗培養(yǎng)3天后,進(jìn)行組織化學(xué)染色(R.A.Jefferson,1987,Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405),并經(jīng)70%乙醇脫色以除去葉綠素。結(jié)果表明,外殼蛋白基因啟動(dòng)子單獨(dú)的表達(dá)活性非常低,但經(jīng)AC2蛋白因子的激活后,瞬時(shí)表達(dá)活性提高。
煙草的轉(zhuǎn)化與分析將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404,然后挑取單菌落于20ml YEB培養(yǎng)基(含卡那霉素,利福霉素各為50微克/毫升)中28℃過夜培養(yǎng),再按2%體積的量轉(zhuǎn)接到無抗生素的YEB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí),菌液用MS液體培養(yǎng)基稀釋3倍。
采用葉盤法進(jìn)行煙草的轉(zhuǎn)化,詳細(xì)方法參照文獻(xiàn)(R.B.Horsch,1985,A simple method and general method for transfering genes into plant.Science,227:1229-1230)。取無菌苗的葉片,用打孔器打出圓形葉片,浸入含農(nóng)桿菌的MS培養(yǎng)基中,10分鐘后,在濾紙上吸干,轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基于25℃暗培養(yǎng)2-3天后,將葉盤轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)(光/暗周期為16/8小時(shí),下同)3天后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)7-10天后,轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基,待芽長(zhǎng)至3-4cm時(shí)切下芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。生根后,取長(zhǎng)勢(shì)較一致的植株進(jìn)行GUS酶活性測(cè)定。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)(R.A.Jefferson,1987,Assaying chimeric genes in plants:the GUS gene fusionsystem.Plant Mol.Biol.Rep.,5:387-405)。測(cè)定結(jié)果表明,CLCuV RP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS酶活性平均值是CaMV35S啟動(dòng)子的5-6倍。
進(jìn)一步的組織化學(xué)定位,仍參照文獻(xiàn)(R.A.Jefferson,1987,Assayingchimeric genes in plants:the GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.,5:387-405)的方法,進(jìn)行徒手切片并染色。觀察結(jié)果表明,除花粉外,RP啟動(dòng)子在植物絕大多數(shù)器官和組織中表達(dá),基本屬組成型表達(dá)。
雙子葉植物棉花的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒載體pRPGUS2300通過電激的方法導(dǎo)入根農(nóng)桿菌LBA4404,用根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化棉花,其操作程序如下棉籽經(jīng)硫酸脫絨后用自來水沖洗,經(jīng)10%H2O2浸泡2-4小時(shí)后置于無菌水中12-14小時(shí),剝?nèi)シN皮,放置于1/2MS的發(fā)芽培養(yǎng)基上。在28℃暗培養(yǎng)下發(fā)芽3-5天后,將無菌苗下胚軸切成0.5-1cm切段。取20ml經(jīng)高壓滅菌的液體YEB培養(yǎng)基加入相應(yīng)的抗生素(卡那霉素50mg/L、利福霉素25mg/L),挑取在平板上的單菌落,接種于20ml含有上述抗菌素的液體YEB培養(yǎng)基中,28℃的恒溫?fù)u床上過夜(150-180rpm)。取400μl此菌液轉(zhuǎn)接于不含抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中(20ml),并添加2.5ml 100mmol/L的乙酰丁香酮,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3-5小時(shí)。轉(zhuǎn)化程序?qū)⑾屡咻S用稀釋至5×108個(gè)/ml的根農(nóng)桿菌菌液浸泡10分鐘左右,覆蓋有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽,B5有機(jī)成分,30g/L葡萄糖和2,4-D及KT各0.1mg/L,pH5.8)上培養(yǎng)。篩選轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化后的下胚軸經(jīng)三天暗培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)入添加了80mg/L卡那霉素、500mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上,經(jīng)2-3個(gè)月培養(yǎng)(20-30天繼代一次)誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)化愈傷,在MS培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽、B5有機(jī)成分,30g/L葡萄糖,pH5.8)上繼代4-5次以誘導(dǎo)胚狀體的形成。5-6個(gè)月后將發(fā)育好的胚狀體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽、B5有機(jī)成分,去除激素及NH4NO3、KNO3加倍并添加谷氨酰胺1g/L、天門冬酰胺0.5g/L,pH5.8)進(jìn)行胚狀體的分化。每月繼代一次,當(dāng)小植株長(zhǎng)出完整和健壯的根系并具有3-4片真葉之后,將其移栽或嫁接。
單子葉植物水稻的轉(zhuǎn)化1.載體構(gòu)建用SacⅠ/XbaⅠ雙酶解質(zhì)粒pRPGUS,回收PRP-GUS-Tnos片段并插入pCAMBIA1300載體的SacⅠ/XbaⅠ位點(diǎn),得到質(zhì)粒pRPGUSHyg。植物選擇標(biāo)記為潮霉素。
2.基因槍轉(zhuǎn)化取開花后12-15天的滅菌幼胚或幼胚來源的胚性愈傷組織(從鮮黃、致密的胚性愈傷組織上分離出胚性小愈傷組織顆粒,直徑大約1mm)作為基因槍轉(zhuǎn)化的受體。待幼胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3天后,仔細(xì)挑選無污染且盾片膨大的幼胚轉(zhuǎn)移到盛有高滲培養(yǎng)基(誘導(dǎo)培養(yǎng)基+0.5M甘露醇)的平皿(直徑9cm)上,并擺放在平皿中央2-3cm的槍擊范圍內(nèi)(注意盾片端朝上),高滲預(yù)培養(yǎng)4小時(shí)后進(jìn)行槍擊,胚性愈傷組織也需經(jīng)高滲處理后再進(jìn)行槍擊。稱取60mg的金粉(直徑1.0μm)于1.5ml的Eppendorf管中,加入1ml 70%乙醇,在旋渦振蕩器上振蕩15分鐘,然后13,000rpm離心3分鐘,仔細(xì)去掉上清,再加入70%乙醇重復(fù)上述步驟一次。然后加入1ml的無菌重蒸水重懸,13,000rpm離心去上清,這一步驟重復(fù)三次,最后加入1ml無菌水。儲(chǔ)存于-20℃冰箱。充分振蕩起金粉懸液后取50μl,置于-滅菌的Eppendorf管中,加入5μl的DNA(1.0μg/μl)溶液,在渦旋振蕩狀態(tài)下緩慢加入50μl2.5M氯化鈣溶液(高壓滅菌)以及20μl0.1M亞精胺溶液(抽濾滅菌),充分振蕩約3分鐘,靜置10分鐘(以保證DNA大分子在金粉表面的充分沉降),10,000rpm離心5秒鐘,棄上清(盡可能去除干凈)再加入250μl無水乙醇,振蕩,10,000rpm離心5秒鐘,去上清,最后加60μl無水乙醇,重懸,供5槍之用(5-10μl一槍)。將基因槍(PDS-1000/He)放置于超凈工作臺(tái)上,以利于無菌操作。用70%的乙醇消毒真空室,可裂圓片及微彈載體用70%乙醇浸泡30分鐘,晾干備用,阻擋網(wǎng)經(jīng)高壓滅菌。取包被DNA的金粉懸液(5-10μl)均勻點(diǎn)在無菌微彈載體的中央?yún)^(qū)域,于超凈工作臺(tái)上吹干備用。將可裂圓片(規(guī)格為1,100psi)裝入固定蓋、旋緊。將載有微彈的微彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置中?;驑尩霓Z擊步驟包括(1)打開穩(wěn)壓電源、真空泵及氦氣瓶閥的開關(guān),調(diào)整系統(tǒng)壓力為1,300psi。(2)將受體材料小心地放入樣品室,射程可選60mm或70mm。(3)抽真空(真空度為27-28英寸汞柱)。(4)轟擊。(5)排氣,取出樣品,用封口膜封上。槍擊后的材料于高滲培養(yǎng)基上過夜后,轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天。將上述材料轉(zhuǎn)入含有hyg B的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)三次,暗培養(yǎng),每次3-4周,粳稻使用hygB濃度依次為30mg/l、40mg/l和50mg/l。秈稻使用hygB濃度依次為10mg/l、20mg/l和40mg/l。將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含hygB 30mg/l的分化培養(yǎng)基上,先暗培養(yǎng)10天,再光照培養(yǎng),待分化出的抗性小芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí),將其轉(zhuǎn)至含hyg B 30-50mg/l的生根培養(yǎng)基上(Hyg B秈稻用30mg/L,粳稻用50mg/L)。待長(zhǎng)至完整的植株后,將其從固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)液中開放式培養(yǎng)。待生成新根后,將苗轉(zhuǎn)入溫室或大田。附培養(yǎng)基配制配方1.基本培養(yǎng)基(1L)大量元素 N6微量元素 MS鐵鹽 MS有機(jī)成分 B5MgCl2500mg谷氨酰胺 250mg脯氨酸 500mg水解酪蛋白 300mg蔗糖 30000mgGelrite2200mg2.誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1L)基本培養(yǎng)基補(bǔ)加以下成分2,4-D 2mg3.選擇培養(yǎng)基(1L)基本培養(yǎng)基補(bǔ)加以下成分2,4-D 2mgHyg B 30,40,50mg(粳稻)10,20,40或50mg(秈稻)4.分化培養(yǎng)基(1L)基本培養(yǎng)基補(bǔ)加以下成分KT 2-4mg6-BA 0.5-1mgNAA 0.25-0.5mgHgy B30mg甘露醇20-30g5.生根培養(yǎng)基(1L)大量元素1/2MS微量元素1/2MS鐵鹽1/2MS有機(jī)成分1/2B5MgCl2500mg谷氨酰胺250mg水解酪蛋白 300mg蔗糖20000mgGelrite 2200mg
權(quán)利要求
1.一種用于在植物中表達(dá)外源基因的棉花曲葉病毒(CLCuV)雙向啟動(dòng)子。
2.按照權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子,其特征在于,它具有如下核苷酸序列1 GGTACCATGG TGGCAATCGG TGTACACTCT AATTCTCTGG402581 262041 CAATCGGTGT AACGGGGTGC AATATATAGG TGTACCCCAA802621 266081 ATGGCATTAT CGTAATTTGA GAAATCATTT CAAAATCCTC 1202661 2700121 ACGCTCCAAA AAGCGGCCAT CCGTATAATA TTACCGGATG 160270115161 GCCGCGCTTT TTTTTTTGTG GGCCCCCGAT TTACGAGATT 2001655201 GCTCCCTCAA AGCTAAATAA CGCTCCCGCA CACTATAAGT 24056 5241 ACTTGCGCAC TAAGTTTCAA ATTCAAACAT GTGGGATCCA 28096 135281 CTATTAAACG AATTCCCTGA TACGGTTCAC GGGTTTCGGT 320136 175321 GTATGCTTTC TGTGAAATAT TTGCAACTTT TGTCGCAGGA 360176 215361 TTATTCACCG GATACGCTTG GGTACGAGTT AATACGGGAT 400216 255401 TTAATTTGTA TTTTACGCTC CCGTAATCAT GAGCTC 436256 292
3.按照權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子,其特征在于,其核苷酸序列與權(quán)利要求2所示的序列具有80%的同源性。
4.按照權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子,其特征在于,它來源于棉花曲葉病毒基因組,是PCR方法分離的、天然提純的或通過化學(xué)的方法合成的。
5.一種利用棉花曲葉病毒雙向啟動(dòng)子在植物不同組織中高水平表達(dá)外源基因的方法,該方法包括以下步驟a.將克隆到的來源于棉花曲葉病毒雙向啟動(dòng)子與待表達(dá)的外源基因相連,以此構(gòu)建植物表達(dá)載體;b.將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞;c.在適宜的培養(yǎng)條件下將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生,得到表達(dá)外源基因的植株。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中來源于棉花曲葉病毒雙向啟動(dòng)子具有權(quán)利要求2所示的核苷酸序列。
7.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟b中來源于棉花曲葉病毒雙向啟動(dòng)子的核苷酸序列與權(quán)利要求2所示的序列具有80%的同源性。
8.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中雙向啟動(dòng)子是以復(fù)制蛋白基因方向與外源基因相連。
9.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中雙向啟動(dòng)子是以外殼蛋白基因方向與外源基因和AC2蛋白的基因相連。
10.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中雙向啟動(dòng)子中復(fù)制蛋白基因方向啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),即基因組第2606核苷酸位置的A上游的序列,外殼蛋白基因方向啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),即基因組第255核苷酸位置的T上游的序列。
11.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中雙向啟動(dòng)子是嵌合啟動(dòng)子,含有權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的啟動(dòng)子DNA的必需的部分,該部分啟動(dòng)子DNA能在植物中起作用并能與基因的編碼序列相連接而使基因表達(dá)。
12.按照權(quán)利要求11所述的植物嵌合啟動(dòng)子,其特征在于,啟動(dòng)子包含有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件,該調(diào)控元件包括能增強(qiáng)外源基因表達(dá)或調(diào)控基因在植物中表達(dá)部位的各種來源的DNA序列。
13.按照權(quán)利要求12所述的調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件是增強(qiáng)子、組成型表達(dá)、組織特異性表達(dá)、誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控元件。
14.按照權(quán)利要求11所述的植物嵌合啟動(dòng)子,其特征在于,在啟動(dòng)子下游包含所有旨在增強(qiáng)外源基因表達(dá)的序列。
15.按照權(quán)利要求14所述的旨在增強(qiáng)外源基因表達(dá)的序列是水稻Actin1內(nèi)含子1、玉米Ubiquitin內(nèi)含子1、玉米蔗糖合成酶基因Sh1內(nèi)含子1、玉米乙醇脫氫酶1-S基因內(nèi)含子1、玉米蔗糖合成酶Sh1外顯子1、3’端表達(dá)調(diào)控序列PⅠ-Ⅱ基因終止子。
16.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,步驟a中雙向啟動(dòng)子被置于各種轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)因子序列的上游來調(diào)控外源基因的表達(dá)。
17.按照權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)因子是來自苜?;ㄈ~病毒的非轉(zhuǎn)譯序列AMV,以及來自煙草花葉病毒(TMV)的Ω因子。
18.按照權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,所述的AC2蛋白基因是與所有來源的啟動(dòng)子融合使用的,其中所述的所有來源的啟動(dòng)子包括CLCuV本身來源的啟動(dòng)子以及其它的所有組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
19.按照權(quán)利要求18所述的啟動(dòng)子是CLCuV雙向啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、番茄E8啟動(dòng)子、Gt3啟動(dòng)子、rolc啟動(dòng)子、CoYMV啟動(dòng)子、rbcs啟動(dòng)子、hsp70啟動(dòng)子、PⅠ-Ⅱ啟動(dòng)子。
20.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述的外源基因包括所有旨在改變植物遺傳性狀的基因。
21.按照權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述的植物包括雙子葉植物和單子葉植物。
22.按照權(quán)利要求21所述的雙子葉植物是棉花、番茄、油菜、法國(guó)豌豆、秋葵、大豆、煙草,以及單子葉植物是禾本科植物水稻、小麥、玉米、大麥、高粱、燕麥。
23.一種為了提高雙向啟動(dòng)子中外殼蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的來自CLCuV基因組的AC2蛋白因子。
24.按照權(quán)利要求23所述的AC2蛋白因子,它具有如下氨基酸序列Met Arg Ser Ser Ser56 His Leu Ile Asp Pro Cys Thr Gln Val Pro Ile Lys 1718 Val Gln His Arg Glu Ala Lys Arg Arg Asn Arg Arg 2930 Arg Arg Val Asp Leu Glu Cys Gly Cys Ser Tyr Tyr 4142 Leu Ser Ile Asn Cys His Asn His Gly Phe Thr His 5354 Arg Gly Thr His His Cys Ser Ser Ser Arg Glu Trp 6566 Arg Ile Tyr Leu Gly Gly Ser Lys Ser Pro Leu Phe 7778 Gln Asp His Gln Pro Arg Gln Pro Ser Ile His Asp 8990 Glu Tyr Gly His Thr His Asp Gln Asp Pro Val Gln 101102 Leu Gln His Ser Glu Ser Ser Gly Thr Ala His Val 113114 Phe Ser ASn Leu Pro Asn Leu Asp Asp Leu Thr Ala 125126 Ser Asp Trp Ser Phe Leu Lys Gly Ile Gln Asn Pro 137138 Ser Pro Gln Ile Ser Glu Gln Ser Arg Cys Asn Phe 149150 Asn 151
25.按照權(quán)利要求23所述的AC2蛋白因子,其特征在于,其氨基酸序列與權(quán)利要求24的序列具有80%的同源性。
26.按照權(quán)利要求23所述的AC2蛋白因子,其特征在于,它來源于棉花曲葉病毒基因組,是天然提純的或通過化學(xué)的方法合成的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于在植物中表達(dá)外源基因的棉花曲葉病毒(CLCuV)雙向啟動(dòng)子;一種利用棉花曲葉病毒雙向啟動(dòng)子在植物不同組織中高水平表達(dá)外源基因的方法;和一種為了提高雙向啟動(dòng)子中外殼蛋白基因啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度的來自CLCuV基因組的AC2蛋白因子。利用本發(fā)明的材料和方法可以提高外源基因在植物中的表達(dá)。
文檔編號(hào)C07K14/01GK1230592SQ9910304
公開日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1999年3月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月22日
發(fā)明者朱楨, 謝迎秋, 劉玉樂 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所
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