專利名稱：一種核糖體失活蛋白－南瓜蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到生物化學(xué)中一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白及其制備和應(yīng)用。
在本文中，核糖體失活蛋白可被定義為至少具有下列活性之一的蛋白質(zhì)RNA-N糖苷酶活性，引產(chǎn)蛋白活性，抗腫瘤或抗病毒活性。該蛋白是寡聚的單肽鏈的簡單蛋白或糖蛋白。
從高等植物中提取的的核糖體失活蛋白，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可以分為兩類，類型I是單肽鏈蛋白，例如，來自葫蘆科植物塊根和種籽的天花粉蛋白(Trichosanthin)，絲瓜籽蛋白(Luffin)，八棱絲瓜籽蛋白(Luffaculin)和來自石竹科植物種籽的肥皂草素(Saporin)等。類型II是雙肽鏈蛋白，例如，來自大戟科植物種籽的蓖麻毒素(Ricin)和來自豆科植物種籽的相思子毒素(Abrin)。類型I蛋白以及類型II蛋白的A鏈都是通過裂解核糖體內(nèi)28S rRNA的4324位腺嘌呤的N-糖苷鍵而使真核細(xì)胞核糖體60S亞基失活(Endo and Tsaragi 1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F(xiàn).et al.，1988，Nacl.Acid Res.161349-1357)。關(guān)于類型I和類型II的核糖體失活蛋白已經(jīng)有很多的專利和文獻(xiàn)報道。
南瓜(Cucurbita moschata)是葫蘆科南瓜屬的一個品種，南瓜及其種籽均是常見蔬菜和干果。鐘雪梅等人(1994，生物化學(xué)雜志，10397-401)從筍瓜籽(Cucurbita maxima)中分離到一種核糖體失活蛋白Maximin，其分子量為28 KD，IC50為4.0×10-10Mol/L，與天花粉蛋白活性相似。Yoshinari，S；et al從西葫蘆(Cucurbita pepo)中分離出一種核糖體失活蛋白Pepocin，其分子量為26 KD，IC50為15.4×10-12Mol/L。該屬植物中其它的核糖體失活蛋白未見報道。
目前，已從葫蘆科植物的瓜果中分離出兩種核糖體失活蛋白，一種是Loshinari，S et al從西葫蘆中分離的pepocin，一種是Lee-Huang，S et al從苦瓜(Momordica charantia)中分離到的MAP。
本發(fā)明的目的是從南瓜屬植物南瓜中分離出一種新的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白，并公開了它的制備方法及用途。經(jīng)SDS-PAGE顯示它的分子量為27 KD，等電點pI＞9。
本發(fā)明采用一種溫和的分離純化方法，即南瓜切碎后經(jīng)醋酸緩沖液，或磷酸緩沖液，或水，或鹽水抽提，抽提液經(jīng)DEAE-纖維素或DEAE-瓊脂糖等弱陰離子凝膠介質(zhì)過濾后，再經(jīng)SP-瓊脂糖、S-瓊脂糖、CM-纖維素、CM-瓊脂糖等強或弱陽離子凝膠介質(zhì)二次離子交換層析分離，就可得到電泳一條帶的純蛋白，我們把它命名為南瓜蛋白(Cucurmosin)，SDS-PAGE顯示它的分子量為27 KD，等電點pI＞9。
本發(fā)明的南瓜蛋白與天花粉蛋白相類似，可以用作引產(chǎn)藥物或抗腫瘤抗病毒制劑使用。
本發(fā)明的南瓜蛋白對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成有強烈抑制作用，適合于作免疫毒素的毒素材料。
本發(fā)明的南瓜蛋白還可以作為RNA N-糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究。
使用本發(fā)明的分離純化方法，可以從葫蘆科其他種屬植物的成熟的瓜果(如瓜蔞、藥西瓜、冬瓜等)中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等電點偏堿性，并具有強烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體失活蛋白合成的活性。
使用本發(fā)明的分離純化方法，可以從擔(dān)子菌綱真菌(如香菇、蘑菇)的子實體中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等電點偏堿性，并具有強烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
本發(fā)明的南瓜蛋白，可以使用汽相擴散技術(shù)、自由界面方法或透析方法，在0.05～0.2 Mol/L的磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、咪唑緩沖液中，以10％～40％的聚乙二醇為沉淀劑條件下，長出可供X-射線衍射用的單晶。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下積極效果(1).南瓜是民間常用蔬菜，采用溫和的提取方法可獲得一種新的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白。
(2).本發(fā)明與本屬植物中分離的筍瓜籽蛋白和Pepocin相類似，它們都屬于類型I核糖體失活蛋白，分子量大約26～28KD。
(3).本發(fā)明提供的南瓜蛋白晶體，可以深入開展X-射線衍射分析和分子結(jié)構(gòu)工作。
現(xiàn)在對附圖作圖面說明

圖1.顯示核糖體失活蛋白—南瓜蛋白進(jìn)行純化的陽離子交換層析圖；圖2.顯示南瓜蛋白進(jìn)行再純化的陽離子交換色譜圖；圖3.顯示(圖1)的12％SDS-PAGE圖；圖4.顯示(圖2)的12％SDS-PAGE圖。
下面結(jié)合附圖通過實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明實施例1.從南瓜中分離純化南瓜蛋白(Cucurmosin)取3 Kg金黃色的成熟的南瓜瓢，切成小塊，加適量的20mM醋酸緩沖液(pH4.5)勻漿，用脫水機離心收集粗提液，用50％的冰醋酸調(diào)pH4.0，經(jīng)冷凍離心(15,000rpm，15’)收集清液，加1/10體積的0.2 M磷酸緩沖液(pH6.0)調(diào)pH中性，加入DEAE-纖維素-52(預(yù)先在20mM pH6.0磷酸緩沖液中溶脹)攪拌，過濾后的清液上SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換柱，用20mM pH6.0磷酸緩沖液洗柱，然后用0～1M NaCl(于20mM pH6.0磷酸緩沖液中)梯度洗脫。組分17-19就是初步提純的南瓜蛋白。合并組分17-19，用鹽酸調(diào)pH4.0，經(jīng)SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換柱再純化，用20mMpH6.0磷酸緩沖液洗柱，然后用0～0.5M NaCl(于20mM pH6.0磷酸緩沖液中)梯度洗脫。所獲得的組分50就是南瓜蛋白。SDS-PAGE顯示它的分子量為27 KD。
實施例2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)核糖體失活蛋白—南瓜蛋白，在Bio-Rad公司的微量垂直平板電泳儀上進(jìn)行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為4％，電泳后按郭堯君方法(1991，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1832-37)，用考馬斯亮蘭染色，以牛血清白蛋白(MW～67KD)、天花粉蛋白(MW～27KD)和溶菌酶(MW～14KD)為分子量標(biāo)準(zhǔn)對照，顯示南瓜蛋白的分子量為27 KD。SDS-PAGE結(jié)果見附圖3和附圖4。
權(quán)利要求
1.一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白(Cucurmosin)，其特征在于，該蛋白是從南瓜中分離出來的，它的分子量(SDS-PAGE檢測)為27 KD，等電點＞9。
2.如權(quán)利要求1所述的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白，其特征在于，它具有強烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
3.一種權(quán)利要求1的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的分離純化方法，包括緩沖溶液抽提、DEAE-纖維素過濾、二次SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析，其特征在于，通過DEAE-纖維素過濾和二次SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析。
4.一種權(quán)利要求3的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的分離純化方法，其特征在于，用相似的方法可以從葫蘆科其他種屬植物的成熟的瓜果(如瓜蔞、藥西瓜、冬瓜等)中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等電點偏堿性，并具有強烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
5.一種權(quán)利要求3的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的分離純化方法，其特征在于，用相似的方法可以從擔(dān)子菌綱真菌(如香菇、蘑菇)的子實體中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在27 KD左右，等電點偏堿性，并具有強烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
6.一種權(quán)利要求1的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該蛋白可作為引產(chǎn)蛋白應(yīng)用于引產(chǎn)，以及治療相關(guān)腫瘤病和病毒性感染疾病。
7.如權(quán)利要求6所述的一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該蛋白還可開發(fā)用作制備免疫毒素的毒素材料。
8.一種權(quán)利要求1的核糖體失活蛋白—南瓜蛋白的晶體生長，其特征在于，可以使用汽相擴散技術(shù)、自由界面方法或透析方法，在0.05～0.2 Mol/L的磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液、咪唑緩沖液中，以10％～40％的聚乙二醇為沉淀劑條件下，能成功的長出可供X-射線衍射用的單晶。
全文摘要
一種核糖體失活蛋白—南瓜蛋白(Cucurmosin)是從常用蔬菜葫蘆科植物南瓜中分離出來的,其分子量為27KD(SDS－PAGE檢測),等電點>9。我們采用溫和的提取方法,經(jīng)DEAE－纖維素過濾和二次SP－瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析,獲得了高純度的蛋白。該蛋白已培養(yǎng)成可供X－射線衍射的晶體。該蛋白可以作為引產(chǎn)藥物和抗腫瘤制劑的商業(yè)應(yīng)用,作為N－糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究,并可用作為免疫毒素的毒素材料。
文檔編號C07K1/00GK1263107SQ99102290
公開日2000年8月16日 申請日期1999年2月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月11日
發(fā)明者陳明晃, 葉曉明 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所